專利名稱：一種制備牛血清白蛋白雜化膜的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物-無機雜化技術領域，特別是涉及一種制備牛血清白蛋白雜化膜的 方法，制備一種蛋白質與水滑石納米片的二元雜化薄膜，這種雜化薄膜表面平滑，結 構均勻連續(xù)。
背景技術：
生物-無機雜化技術作為超分子化學的一個重要分支一直是科學研究的重點，生物 -無機雜化薄膜的構筑及其功能化更是最近和將來很長一段時間內人們的研究熱點，結 合蛋白質具有廣泛應用潛力的特點，通過生物-無機雜化技術實現(xiàn)蛋白質的功能化和器 件化，從而實現(xiàn)生物分子在實際應用中的價值?；钚陨锓肿?如酶、氨基酸、肽) 由于其特殊的物化性質在生物傳感、催化、藥物緩釋、食品加工等領域具有廣闊的應
用前景，但由于游離活性生物分子存活的溫度、pH值范圍窄，容易變性和失活，對熱、 強酸、強堿和有機溶劑均不夠穩(wěn)定，而且價格昂貴，從而阻礙了他們作為一類重要生 物材料的進一步研究和應用。因此首要的問題是如何提高活性生物分子的穩(wěn)定性。無 機納米材料結構豐富新穎、熱穩(wěn)定性優(yōu)良、表面活性可調節(jié)、價格低廉，將活性生物 分子與無機納米材料組裝得到生物一無機雜化材料，不僅對于維持生物大分子的結構 至關重要，而且固載量大、工藝簡單易于工業(yè)化、載體無毒可回收且成本低廉，具有 良好的工業(yè)應用前景。
基于活性生物分子與無機納米材料組裝得到的生物-無機納米雜化材料同時具有 二者的獨特性質，已成為生命科學、材料科學及納米科學等領域的研究熱點。以無機 材料為出發(fā)點，無機一生物雜化材料主要體現(xiàn)在以下三個方面(1)基于零維的納米 粒子形成的無機一生物雜化材料。半導體納米粒子如(CdS， CdSe， ZnS， Ti(^等)或金 屬納米粒子(如Au)可與酶、抗原、抗體或核酸如DNA等蛋白質偶聯(lián)實現(xiàn)功能化，也可 在生物活性分子誘導下組裝成某種排列結構，功能化的納米粒子可控制生物分子的活 性、反應性或識別能力，無機納米顆粒與生物分子在溶液或基質表面形成的二維或三 維組裝體可望作為生物傳感器、生物電子器件等得到應用；(2)基于一維的碳納米管 和三維的介孔材料形成的無機一生物雜化材料。單壁碳納米管(SWNT)作為納米材料 的重要單元在電子、光學、熱量傳輸和生物傳感等領域具有廣闊的應用前景；(3)基 于納米顆粒和一維的碳納米管以及三維的介孔材料組裝得到的雜化材料具有一定的局 限性，尤其是活性生物分子為酶分子時，酶分子不能充分地與反應物分子接觸，導致 活性和利用率下降。針對上述局限性，近年來二維納米材料即層狀材料(如a-磷酸鋯、 層狀鈦酸鹽、水滑石)與生物分子的組裝受到越來越多的關注。與上述提到的半導體 或金屬納米顆粒不同，層狀材料與生物分子的組裝可通過主客體之間的離子鍵、氫鍵、憎水作用等形式實現(xiàn)，因而避免了共價作用形式所需要的苛刻反應條件，更有利于保 持生物分子特有的結構和生物活性。
蛋白質是由20多種氨基酸共價連接而成、具有特定三維結構、高分子量的多肽。
所以把多肽作為認識蛋白質的起點是合適的。 一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨
基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽(p印tide)。組成肽鏈的 氨基酸單元稱為氨基酸殘基。蛋白質分子中氨基酸殘基的排列方式和連接順序就是蛋 白質的化學結構(一級結構)。肽分子中含有兩個氨基酸殘基時稱為二肽，肽分子中 含有多個氨基酸殘基時則稱為多肽。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質，不能自由旋 轉。蛋白質有一個引人注目的特征，就是它們都具有確定的三維結構。雖然蛋白質分 子是由氨基酸首尾相連的多肽鏈組成，但一個伸展開來或隨機排布的多肽鏈并無生物 活性。蛋白質的功能來自其特定的構象，即原子在一個結構中的三維排列方式。蛋白 質由氨基酸結合而成，結合方式是通過肽鍵結合而成肽鏈，再由一個或多個肽鏈按各 自特殊的方式結合成為蛋白質分子。隨著氨基酸殘基的數(shù)目、排列順序、以及多肽鏈 的數(shù)目和空間結構的不同，形成不同的蛋白質。蛋白質除了具有一級結構外，還具有 二級結構(螺旋結構、折疊結構、轉角結構、只有回轉等)、三級結構(在二級結構 基礎上形成的很不規(guī)則的構象)和四級結構(由兩條或兩條以上的具有三級結構的多 肽鏈聚合而形成特定的構象)，因此蛋白質分子除具有通常主要的化學鍵外還有許多 其他重要的化學鍵(如氫鍵、二硫鍵、離子間、酯鍵、疏水鍵和范德華力)，這些鍵 中的一種或幾種都影響蛋白質的吸附過程。盡管不是所有蛋白質都包含所有上述鍵， 但對于任何一種蛋白質由于其固有的氨基酸結構，在1541cm—'和1642cnf'附近都有較強 的吸收峰。
(1) 一級結構包括組成蛋白質的多肽鏈數(shù)目，多肽鏈的氨基酸順序，以及多肽 鏈內或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質 生物功能的基礎。 一級結構中的作用力主要是共價鍵，包括肽鍵和二硫鍵。
(2) 二級結構是指肽鏈的主鏈在空間的排列，或規(guī)則的幾何走向、旋轉及折疊。 它只涉及肽鏈主鏈的構象及鏈內或鏈間形成的氫鍵。主要有a-螺旋、P-折疊、e-轉 角。
(3) 三級結構是指在二級結構基礎上，肽鏈的不同區(qū)段的側鏈基團相互作用在
空間進一步盤繞、折疊形成的包括主鏈和側鏈構象在內的特征三維結構。維系這種特 定結構的力主要有氫鍵、疏水鍵、離子鍵和范德華力等。尤其是疏水鍵，在蛋白質三 級結構中起著重要作用。蛋白質的三級結構實質上是由其一級結構決定的，是多肽鏈 主鏈上各個單鍵的旋轉自由度受到各種限制的總結果。
(4)四級結構蛋白質的四級結構是指由多條各自具有一、二、三級結構的肽鏈 通過非共價鍵連接起來的結構形式；各個亞基在這些蛋白質中的空間排列方式及亞基之間的相互作用關系。維持亞基之間的化學鍵主要是疏水力。
組成蛋白質的20種基本氨基酸分別是甘氨酸(Glycine)、丙氨酸(Alanine)、纈 氨酸(Valine)、亮氨酸(Leucine)、異亮氨酸(Ileucine)、脯氨酸(Proline)、甲 硫氨酸(Methionine)、半胱氨酸(Cysteine)、苯丙氨酸(Phenylalanine),酪氨酸 (Tyrosine)、色氨酸(Trytophan)、精氨酸(Arginine)、賴氨酸(Lysine)、組氨酸 (Histidine)、天冬氨酸(Aspartate)、谷氨酸(Glutamate)、絲氨酸(Serine)、蘇 氨酸(Threonine)、天冬酰胺(Asparagine)、谷酰胺(Glutamine)，除甘氨酸和脯氨 酸外，其他均具有一樣的結構通式，只是側鏈烷基不同。
牛血清白蛋白是血液的主要成分(38g/100ml)，由于具有純度高，價格便宜，商 業(yè)易得等特點，常常作為標準蛋白質研究。牛血清白蛋白由三個氨基酸區(qū)域組成，每 個氨基酸區(qū)域包含兩個亞域， 一個BSA分子由583個氨基酸組成，其中35個半胱氨酸 組成17個二硫鍵，在肽鏈的第34位有一自由巰基，分子量68kD，等電點4.8，含氮 量16%，含糖量0.08%，僅含已糖和己糖胺，含脂量只有0.2%。游離的BSA分子結構以 a-helix為主，三維尺寸為4*4*14nm，分子量為66KD，等電點是4.9，是一種酸性蛋 白質。與所有蛋白質一樣，牛血清白蛋白分子的大小以及表面的電荷分布隨蛋白質溶 液pH值的變化而變化，因此可以調節(jié)緩沖溶液的pH值，將牛血清白蛋白陰離子化或 者是陽離子化。在中性(P^7.4)蛋白質溶液中，牛血清白蛋白呈扁形橢圓體，表面電 荷以負電荷為主，主要分布在氨基一區(qū)和氨基二區(qū)。
無機一生物雜化材料很好的結合了無機納米材料和活性生物分子兩者的特性和優(yōu) 點，要想充分發(fā)揮活性生物分子的生物活性，選擇合適的無機主體成為了制備性能優(yōu) 異無機一生物雜化材料的關鍵問題。水滑石(LDH)是一種陰離子粘土，其基本構造單元 是八而體，八面體中心是金屬離子，六個頂角是氫氧根離子，相鄰八面體之間靠共用 邊相互聯(lián)結成二維延續(xù)的配位八面體結構層，單元層以面一面堆疊形成晶體顆粒構成 層狀結構，決定了它多以片狀形態(tài)存在。水滑石結構中類水滑石層板由共邊的M(0H)6 八面體構成，部分二價金屬離子被三價金屬離子取代產生多余的正電荷，使得LDH帶正 電荷，晶體結構中多余的正電荷由層間陰離子平衡以維持整個分子的電中性，層間通 道中的陰離子是可交換的水滑石由于主體層板的化學組成、電荷密度、晶粒形態(tài)和尺 寸均可以在一定范圍內調控等特性恰好可以解決上述存在的問題，為LDHs-生物雜化 材料的設計提供了較大的設計空間。另外，水滑石作為一類陰離子型層狀材料，可以 在水中剝離從而得到單層層板，這樣分子尺寸較大的生物活性分子就能夠與LDHs組裝 得到LDHs-生物雜化材料，實現(xiàn)生物分子的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備牛血清白蛋白雜化膜的方法，制備生物-無機二元 雜化膜，雜化膜結構穩(wěn)定，結構均勻連續(xù)。本發(fā)明制備的牛血清白蛋白與水滑石納米片的雜化膜是將陰離子化的牛血清白蛋 白通過靜電吸引等作用力與帶正點的水滑石納米片自組裝，在適當?shù)幕咨铣赡?，?于由牛血清白蛋白與水滑石納米片組裝粉體制備的雜化膜，膜表面結構均勻連續(xù)，牛 血白蛋白排列相對隨意，較多的牛血清白蛋白與重金屬的結合點暴露在膜表面；對于 由牛血清白蛋白與水滑石納米片交替層層組裝制備的雜化膜，膜表面結構緊湊且均勻 連續(xù)，牛血清白蛋白的光譜強度隨著組裝層數(shù)的增加成線性增長。
所述水滑石納米片為乳酸根插層鎂鋁水滑石納米片，蛋白質為牛血清白蛋白(第 五組分)。
本發(fā)明的牛血清白蛋白雜化膜的制備方法如下
(1) 水滑石納米片的制備將3.7513g的A1(N03)3*9H20禾tl 5.1280g的硝酸鎂 (Mg(N03)2*6H20)溶于60mL去離子水中，配制成Mg/Al為2/1的鹽溶液。將一定濃度
的NaOH溶液緩慢滴加到過量乳酸中，調節(jié)體系的pH值6-ll;加入Mg/Al混合鹽溶液， 繼續(xù)滴加NaOH溶液至pH值6-11，加熱至回流并晶化7-12小時，得到白色漿液，離心 分離，洗滌烘干。取上述乳酸插層水滑石白色漿液洗滌至中性后，在一定體積水中分 散，加熱回流至剝離。所制備的乳酸根插層鎂鋁水滑石具有高度結晶的晶體結構，在 水中分散剝離得到水滑石納米片。
(2) 粉體雜化膜的制備
a、 基底的處理將硅片、石英片、玻璃片基底在清潔劑、水/異丙醇中各自清洗
10-60分鐘，然后在體積比為5: 1: 1的水/雙氧水/氨水中加熱處理30-90分鐘；
b、 緩沖溶液的配制配制0. 2mol/L的磷酸氫二鈉和0. 3mol/L的磷酸二氫鈉溶液， 以此配制pH 5. 0-9. 0的緩沖溶液，用于溶解牛血清白蛋白；
c、 調節(jié)牛血清白蛋白溶液的pH 5.0-9.0，牛血清白蛋白溶液與水滑石納米片在 15-40。C的條件下自組裝30-120分鐘后，將處理過的基底浸漬在上述牛血清白蛋白溶 液與水滑石納米片的組裝體系中15-40分鐘，清洗干燥，得到粉體雜化膜，牛血清白 蛋白分子均勻地分布在基底表面；
(3) 層層組裝雜化膜的制備
a、 調節(jié)牛血清白蛋白溶液的pH 5. 0-9. 0，配制濃度為0. 5-3 mg/ml的蛋白質溶液， 組裝前溶解30-120分鐘；
b、 將處理過的基底浸漬在乳酸根插層的水滑石納米片中10-30分鐘，水洗干燥；
c、 然后浸漬在配制好的蛋白質溶液中10-30分鐘，水洗干燥，得到一個雙層二元 雜化膜；
d、 重復上述(b， c)步驟，制備多層組裝蛋白質和水滑石納米片的層層組裝雜化 膜，層層組裝雜化膜中，蛋白質和水滑石納米片交替成膜，蛋白質的特征光譜強度隨 組裝層數(shù)的增加成線性增長；水滑石納米片緊湊地排列在基底表面，由層層組裝所制備的牛血清白蛋白雜化膜的膜結構均勻連續(xù)，牛血清白蛋白的光譜強度隨著組裝層數(shù) 的增加成線性增長。
本發(fā)明制備的牛血清白蛋白雜化膜，通過調變牛血清白蛋白分子的表面電荷，結 合水滑石納米片帶正電的特性，通過牛血清白蛋白與水滑石納米片的自組裝粉體制備 牛血清白蛋白粉體沉積膜；通過靜電自組裝方法，將處理過的基底交替浸漬到水滑石 納米片和牛血清白蛋白溶液中，通過靜電及其它作用里實現(xiàn)二者的交替組裝，制備牛 血清白蛋白與水滑石納米片的層層組裝雜化膜。對具有潛在應用價值的蛋白質分子實 現(xiàn)了器件化，拓展其應用。
本發(fā)明的優(yōu)點在于，同時制備方法簡單不需要復雜的設備，成本低廉，制備過程 中只使用水作為溶劑，制備方法環(huán)保。


圖1為牛血清白蛋白與水滑石納米片自組裝粉體沉積的雜化膜的掃描電鏡照片。 圖2為牛血清白蛋白與水滑石納米片通過層層組裝的雜化膜的掃描電鏡照片。
具體實施方式
實施例1
a、 將3. 7513g的A1(N03)3*9H20和5.畫g的硝酸鎂(Mg(N03)2*6H20)溶于60mL 去離子水中。將一定濃度的NaOH溶液緩慢滴加到過量乳酸中，調節(jié)體系的pH值6-11; 加入Mg/Al混合鹽溶液，繼續(xù)滴加NaOH溶液至pH值6-11,加熱至回流并晶化7-12 小時，得到白色漿液，離心分離，洗滌烘干。取上述乳酸插層水滑石洗漆至中性后， 在一定體積水中分散，加熱回流至剝離；
b、 在pH5.0的條件下，配制濃度為3mg/ml牛血清白蛋白溶液30ml，加入10 ml 水滑石納米片溶液，組裝lh;
c、 將處理過的基底浸漬到上述組裝體系中20分鐘，取出水洗并干燥，得到粉體 沉積雜化膜。
實施例2
a、 將3. 7513 g的Al (N03)3*9H20和5. 1280 g的硝酸鎂(Mg(N03) 2'6H20)溶于60 mL 去離子水中。將一定濃度的NaOH溶液緩慢滴加到過量乳酸中，調節(jié)體系的pH值6-ll; 加入Mg/Al混合鹽溶液，繼續(xù)滴加NaOH溶液至pH值6-11，加熱至回流并晶化7-12 小時，得到白色漿液，離心分離，洗滌烘干。取上述乳酸插層水滑石洗滌至中性后， 在一定體積水中分散，加熱回流至剝離；
b、 在pH8.0的條件下，配制濃度為lmg/ml牛血清白蛋白溶液30ml，加入10ml 水滑石納米片溶液，組裝lh;
c、 將處理過的基底浸漬到上述組裝體系中20分鐘，取出水洗并干燥，得到粉體 沉積雜化膜。實施例3
a、 將3. 7513g的A1(N03)3'9H20和5. 1280g的硝酸鎂(Mg(N03) 2*6H20)溶于60 mL 去離子水中。將一定濃度的NaOH溶液緩慢滴加到過量乳酸中，調節(jié)體系的pH值6-ll; 加入Mg/Al混合鹽溶液，繼續(xù)滴加NaOH溶液至PH值6-11，加熱至回流并晶化7-12 小時，得到白色漿液，離心分離，洗滌烘干。取上述乳酸插層水滑石洗滌至中性后， 在一定體積水中分散，加熱回流至剝離；
b、 在pH 5. 0的條件下，配制濃度為3 mg/ml的牛血清白蛋白溶液；
c、 將處理過的基底浸漬到50ml水滑石納米片中20分鐘，取出水洗并干燥；
d、 將上述預鋪了一層水滑石薄膜的基片浸漬到3mg/ml的牛血清白蛋白溶液中20 分鐘，取出水洗并干燥；
e、 重復c和d步驟，制備牛血清白蛋白與水滑石納米片的多層膜。 實施例4
a、 將3. 7513g的Al (N03)3*9H20和5.體g的硝酸鎂(Mg(N03)2'6H20)溶于60 mL 去離子水中。將一定濃度的NaOH溶液緩慢滴加到過量乳酸中，調節(jié)體系的pH值6-ll; 加入Mg/Al混合鹽溶液，繼續(xù)滴加NaOH溶液至pH值6-11，加熱至回流并晶化7-12 小時，得到白色漿液，離心分離，洗滌烘干。取上述乳酸插層水滑石洗滌至中性后， 在一定體積水中分散，加熱回流至剝離；
b、 在pH 8.0的條件下，配制濃度為3 mg/ml的牛血清白蛋白溶液；
c、 將處理過的基底浸漬到50ml水滑石納米片中20分鐘，取出水洗并干燥；
d、 將上述預鋪了一層水滑石薄膜的基片浸漬到3mg/ml的牛血清白蛋白溶液中20 分鐘，取出水洗并干燥；
e、 重復c和d步驟，制備牛血清白蛋白與水滑石納米片的多層膜。 實施例5
a、 將3.7513g的Al(N03)3'9H20和5.1280g的硝酸鎂(Mg(N03)2*6H20)溶于60 mL 去離子水中。將一定濃度的NaOH溶液緩慢滴加到過量乳酸中，調節(jié)體系的pH值6-ll; 加入Mg/Al混合鹽溶液，繼續(xù)滴加NaOH溶液至pH值6-11，加熱至回流并晶化7-12 小時，得到白色漿液，離心分離，洗滌烘干。取上述乳酸插層水滑石洗滌至中性后， 在一定體積水中分散，加熱回流至剝離；
b、 在pH 8.0的條件下，配制濃度為0.5 mg/ml的牛血清白蛋白溶液；
c、 將處理過的基底浸漬到50ml水滑石納米片中20分鐘，取出水洗并干燥；
d、 將上述預鋪了一層水滑石薄膜的基片浸漬到3mg/ml的牛血清白蛋白溶液中20 分鐘，取出水洗并干燥；
e、 重復c和d步驟，制備牛血清白蛋白與水滑石納米片的多層膜。
權利要求
1、一種制備牛血清白蛋白雜化膜的方法，其特征在于，工藝步驟為(1)粉體雜化膜的制備a、基底的處理將硅片、石英片、玻璃片基底在清潔劑、水/異丙醇中各自清洗10-60分鐘，然后在體積比為5∶1∶1的水/雙氧水/氨水中加熱處理30-90分鐘；b、緩沖溶液的配制配制0.2mol/L的磷酸氫二鈉和0.3mol/L的磷酸二氫鈉溶液，以此配制pH5.0-9.0的緩沖溶液，用于溶解牛血清白蛋白；c、調節(jié)牛血清白蛋白溶液的pH5.0-9.0，牛血清白蛋白溶液與水滑石納米片在15-40℃的條件下自組裝30-120分鐘后，將處理過的基底浸漬在上述牛血清白蛋白溶液與水滑石納米片的組裝體系中15-40分鐘，清洗干燥，得到粉體雜化膜，牛血清白蛋白分子均勻地分布在基底表面；(2)層層組裝雜化膜的制備a、調節(jié)牛血清白蛋白溶液的pH5.0-9.0，配制濃度為0.5-3mg/ml的蛋白質溶液，組裝前溶解30-120分鐘；b、將處理過的基底浸漬在乳酸根插層的水滑石納米片中10-30分鐘，水洗干燥；c、然后浸漬在配制好的蛋白質溶液中10-30分鐘，水洗干燥，得到一個雙層二元雜化膜；d、重復上述(b，c)步驟，制備多層組裝蛋白質和水滑石納米片的層層組裝雜化膜，層層組裝雜化膜中，蛋白質和水滑石納米片交替成膜，蛋白質的特征光譜強度隨組裝層數(shù)的增加成線性增長；水滑石納米片緊湊地排列在基底表面，由層層組裝所制備的牛血清白蛋白雜化膜的膜結構均勻連續(xù)，牛血清白蛋白的光譜強度隨著組裝層數(shù)的增加成線性增長。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述水滑石納米片的制備步驟為.-將3. 7513g的Al (N03)3'9H20和5.1280g的硝酸鎂(Mg(N03) 2*6H20)溶于60mL去離子水中，配制成Mg/Al為2/1的鹽溶液；將一定濃度的NaOH溶液緩慢滴加到過量 乳酸中，調節(jié)體系的pH值6-11;加入Mg/Al混合鹽溶液，繼續(xù)滴加NaOH溶液至pH 值6-11，加熱至回流并晶化7-12小時，得到白色漿液，離心分離，洗滌烘干；取上 述乳酸插層水滑石白色漿液洗滌至中性后，在一定體積水中分散，加熱回流至剝離。 所制備的乳酸根插層鎂鋁水滑石具有高度結晶的晶體結構，在水中分散剝離得到水 滑石納米片。
全文摘要
一種制備牛血清白蛋白雜化膜的方法，屬于生物-無機雜化技術領域。制備工藝包括粉體雜化膜的制備；層層組裝雜化膜的制備。制備多層組裝蛋白質和水滑石納米片的層層組裝雜化膜，層層組裝雜化膜中，蛋白質和水滑石交替成膜，蛋白質的特征光譜強度隨組裝層數(shù)的增加成線性增長；水滑石片緊湊地排列在基底表面，由層層組裝所制備的牛血清白蛋白雜化膜的膜結構均勻連續(xù)，牛血清白蛋白的光譜強度隨著組裝層數(shù)的增加成線性增長；雜化膜表面緊密平滑，蛋白質均勻地分布在膜的表面。優(yōu)點在于，同時制備方法簡單不需要復雜的設備，成本低廉，制備過程中只使用水作為溶劑，制備方法環(huán)保。
文檔編號C08J5/18GK101531766SQ20091008178
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月10日 優(yōu)先權日2009年4月10日
發(fā)明者靜 何, 周良彪 申請人:北京化工大學