專利名稱：一種大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥用高分子材料領(lǐng)域，具體是一種大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖 基因載體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療為人類許多重要的疾病如遺傳疾病、腫瘤、心血管疾病和神經(jīng) 退行性疾病提供了廣闊的治療前景?；蛑委熓菍⑼庠茨康幕蛲ㄟ^載體或 其它途徑導(dǎo)入體內(nèi)并在靶組織和靶細胞中顯示出相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)而達到治療 疾病的一種手段，而具備有效性和安全性的治療載體仍是努力攻克的課題。 為了克服病毒載體的缺陷， 一系列的非病毒型載體正被人們認識和利用。
殼聚糖是天然甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，為不多見的無生物毒性的堿性多糖，
具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，無免疫原性，能與DNA形成聚電 解質(zhì)復(fù)合物，其復(fù)合保護質(zhì)粒DNA免遭DNase酶解的能力和基因表達水平 高。殼聚糖的細胞毒性小，但單獨使用殼聚糖作為基因載體，其轉(zhuǎn)染效率要 低于病毒基因載體。當它進入細胞內(nèi)涵體之后很難從內(nèi)涵體中釋放出來，使 得復(fù)合物很難進入細胞核，讓基因得到表達。因此，可根據(jù)實際需要對殼聚 糖進行改性，增加其靶向性，提高基因轉(zhuǎn)染效率。[1.徐海娥,閆翠娥.殼聚糖 作基因載體及其改性研究進展.高分子通報，2006, (8): 79-87.]
大環(huán)多胺具有超分子識別作用，可特異性識別DNA，其結(jié)構(gòu)片段與聚乙 烯亞胺(PEI)類似，都存在-CHrCHrNH-單元，富含陽離子，有較強的DNA 結(jié)合能力和細胞吸附能力。PEI作為基因載體的優(yōu)勢在于它的質(zhì)子海綿效應(yīng)， 當溶酶體內(nèi)的pH下降時，PEI能夠大量捕獲質(zhì)子，并引起Cl-內(nèi)流，導(dǎo)致溶 酶體滲透性腫脹破裂，從而將內(nèi)吞的DNA釋放到細胞質(zhì)。這種質(zhì)子海綿效應(yīng) 能使DNA逃脫內(nèi)體(endosome)的吞噬，免受核酸酶降解。但PEI作為基因遞 釋載體還存在一定缺陷，最大的就是細胞毒性問題。它的毒性主要同它的表 面電荷和離子聚合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。分子量越高，載體表面的電荷密度越大， 載體的毒性越大。大環(huán)多胺與PEI結(jié)構(gòu)單元類似，但是屬于小分子，表面電 荷密度明顯降低，因此，細胞毒性也會降低。[高建青,趙青青,陳金亮等.用聚乙烯亞胺修飾殼聚糖制各基因給藥載體的方法[P].中國專利，CN 101130086A. 2007 .8. 1]
本發(fā)明的意義在于結(jié)合殼聚糖的正電荷、低毒性和大環(huán)多胺的超分子識別 性能、小分子量、低表面電荷密度提供一種新型的大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖的基 因載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體，依次在殼聚糖 大分子骨架上的2位氨基與6位羥基偶聯(lián)大環(huán)多胺類化合物，降低細胞毒性， 提高基因轉(zhuǎn)染效率。
本發(fā)明的目的還在于提供所述大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體的制備方 法，獲得一種低細胞毒性，高轉(zhuǎn)染效率的非病毒基因載體。
本發(fā)明的目的還在于提供所述大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體對質(zhì)粒DNA 的凝膠阻滯作用以及對DNA的保護作用。
本發(fā)明的目的還在于提供所述化合物在基因給藥方面的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖的基因載體，具有通式I的結(jié)構(gòu)
其中R,， R2為大環(huán)多胺類化合物或者H，且必須一種為H，另一種為大環(huán) 多胺類化合物，且式I中的大環(huán)多胺類化合物以酰胺鍵偶聯(lián)在殼聚糖2位氨基 上，或者以酯鍵偶聯(lián)在殼聚糖6位羥基上；x與y的比值范圍為1.2-2.3， x+y 值的范圍為59-178。
對通式I大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體，A包括但不僅限于H， 1，4,7-三 氮雜環(huán)壬烷基乙?；?，1，4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷基乙?；却蟓h(huán)多胺類衍生物 基團；R2包括但不僅限于H， 1，4,7-三氮雜環(huán)壬烷基乙?；?，1，4,7,10-四氮雜 環(huán)十二烷基乙酰基等大環(huán)多胺類衍生物基團。本發(fā)明所提供的大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖化合物其制備方法如下所示 方案一
(1) 將6-0-三苯基甲醚化殼聚糖，溶于N,N,-二甲基甲酰胺(DMA)中 得到三苯基甲醚化殼聚糖溶液；叔丁氧羰基保護的大環(huán)多胺衍生物用N，N-二 甲基甲酰胺溶解，加入NaHC03，攪拌均勻得到大環(huán)多胺溶液；
(2) 將上述三苯基甲醚化殼聚糖溶液與大環(huán)多胺溶液混合，攪拌均勻， 加入l-乙基(-3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDAC)，攪拌反應(yīng)12-24小時；
得到的反應(yīng)液加入乙醚沉淀、離心，沉淀再用乙醚洗滌，在透析袋中用 去離子水透析2-4天，冷凍干燥得到6-0-三苯基甲醚化-N-叔丁氧羰基保護大 環(huán)多胺衍生化殼聚糖；
(3) 所得產(chǎn)品6-0-三苯基甲醚化-N-叔丁氧羰基保護大環(huán)多胺衍生化殼 聚糖加入三氟乙酸室溫攪拌使其溶解澄清，繼續(xù)攪拌2-6小時；然后把所得溶 液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑；之后再用乙醚洗滌，放入透析袋中用去離子水透析2-4 天，冷凍干燥得到N-大環(huán)多胺衍生化殼聚糖，產(chǎn)物能溶于中性水。
方案二
1) 在冰浴條件下，將叔丁氧羰基保護的大環(huán)多胺衍生物用N，N二甲基乙 酰胺溶解(DMF)，加入卡特縮合劑(BOP試劑)，N，N-二異丙基乙胺(DIEA)， 攪拌均勻，撤掉冰浴，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，TLC跟蹤到生成活化酯；將N-鄰苯二 甲酰化殼聚糖用N,N二甲基乙酰胺溶解，加入N，N-二異丙基乙胺，攪拌均勻， 得到鄰苯二甲?；瘹ぞ厶侨芤海?br> 2) 將上述活化酯與鄰苯二甲?；瘹ぞ厶侨芤夯旌希瑪嚢?-24小時，TLC 跟蹤到生成的活化酯反應(yīng)完全；
所得反應(yīng)液加入水沉淀出固體；得到的沉淀依次用水和乙醚洗滌；即得 6-0-叔丁氧羰基保護大環(huán)多胺衍生化-N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?；
3) 所得6-0-叔丁氧羰基保護大環(huán)多胺衍生化-N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶怯?三氟乙酸溶解，攪拌1.5-6小時后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，依次用乙醚和水洗滌， 得到6-0-大環(huán)多胺衍生化-N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?；
4) 所得6-0-大環(huán)多胺衍生化-N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶菓腋≡邴}酸溶液中， 氮氣保護下，回流反應(yīng)6-24小時后旋干溶劑，依次用水和乙醇洗滌，干燥即 得6-0-大環(huán)多胺衍生化殼聚糖，產(chǎn)物能溶于二甲基亞砜。本發(fā)明還研究了所述基因載體對質(zhì)粒DNA的凝膠阻滯作用見圖1，以及
在一定濃度的Dnase I酶作用下對DNA的保護作用見圖2。
以R產(chǎn)1， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷基乙?；琑fH為例，采用本發(fā)明 方法制備大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體的的反應(yīng)式如下<formula>formula see original document page 7</formula>以R產(chǎn)H ， R2=l， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷基乙酰基為例，采用本發(fā)明 方法制備大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體的的反應(yīng)式如下本發(fā)明所制備的大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體是在殼聚糖的骨架上，用縮
合劑l-乙基(-3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺、卡特縮合劑依次在2位氨基 與6位羥基偶聯(lián)大環(huán)多胺。改善了殼聚糖的水溶性，結(jié)合殼聚糖的正電荷、 低毒性和大環(huán)多胺的超分子識別性能、小分子量、低表面電荷密度，因而可 能提供一種新型的低細胞毒性高轉(zhuǎn)染效率的非病毒基因載體。


圖1基因載體對質(zhì)粒DNA的凝膠阻滯作用
圖2基因載體在Dnase I酶作用下對DNA的保護作用
具體實施例方式
實施例l: N- (1， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷基)乙?；瘹ぞ厶堑闹苽?1) 1.977g G.33mmo1) 4，7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二 垸基乙酸用20mlN,N,-二甲基甲酰胺溶解，加入0.313g(3.725mmol)NaHCO3，
磁力攪拌。
(2) 滴加0.600g (1.49mmol氨基)6-0-三苯基甲醚化殼聚糖(Cs-Tr) 的N，N,-二甲基甲酰胺溶液20ml到上步反應(yīng)液中，攪拌均勻，然后加入l-乙 基(-3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺0.715g G.725mmo1)，攪拌18小時。 得到的溶液加入乙醚沉淀，沉淀再用乙醚洗滌，在透析袋中用去離子水透析3 天，產(chǎn)品凍干。得到6-0-三苯基甲醚化^- (4， 7， 10-三(叔丁氧羰酰)-l， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷基)乙酰化殼聚糖。
(3)上述步驟中得到的產(chǎn)品加入20ml三氟乙酸攪拌使其溶解澄清，繼續(xù) 攪拌3小時。溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，之后再用乙醚洗滌，放入透析袋中透 析3天，冷凍干燥得到目標化合物N- (1， 4, 7， 10-四氮雜環(huán)十二垸基)乙 酰化殼聚糖，結(jié)構(gòu)式如下
按常規(guī)方法對目標產(chǎn)物進行了核磁共振氫譜，碳譜和紅外光譜分析，其
結(jié)果如下
氫譜'H畫R(D2O-d2,600MHz)5: 1.25(s， Hof CH3 in CS), 2.65-2.87(m， H of cyclen)， 3.39(s, H of —NCH2CO), 3.47(s, H2 of CS), 3.59畫3.76(m， H3， H4， H5, H6 of CS), 3.89(s, H1 of CS), 4.42-4.56(m， H of D20)。
碳譜13C畫R (D20-d2, 600MHz) 5:22.16(CH3), 44.18-47.61(C of cyclen)， 50.60(C of -NCH2CO), 56.49(C2 of CS), 60.10(C6 of CS)， 72.03(C6 of CS)， 74.71(C5 ofCS), 78.89(C4ofCS), 100.85(C1 ofCS), 174.21(NHCO)。
紅外IR (D,/cm",KBr disc): 721， 800， 832, 898, 952， 1034， 1069, 1129， 1203, 1319， 1380, 1415， 1456, 1562, 1677， 2866, 2954, 3083, 3425。
實施例2: N- (1， 4， 7-三氮雜環(huán)壬基)乙?；瘹ぞ厶堑闹苽?1) 0.9773g (2.52mmol) 4,7-二(叔丁氧羰酰)-1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷基) 乙酸用10mlN，N，-二甲基甲酰胺溶解，加入0.212g (2.525mmol) NaHC03， 磁力攪拌30min。
(2) 滴加0.403g (l.Olmmol氨基)6-0-三苯基甲醚化殼聚糖(Cs-Tr) 的N，N,-二甲基甲酰胺溶液15ml到上步反應(yīng)液中，攪拌均勻，加入1-乙基(-3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺0.484g (2.525mmol)，攪拌12小時。得到的 溶液加入乙醚沉淀，沉淀再用乙醚洗滌，在透析袋中用去離子水透析4天， 產(chǎn)品凍干。得到6-0-三苯基甲醚化^- (4， 7-二(叔丁氧羰酰)-l， 4， 7-三氮雜 環(huán)壬基)乙?；瘹ぞ厶恰?br> (3) 上述步驟中得到的產(chǎn)品加入15ml三氟乙酸攪拌使其溶解澄清，繼 續(xù)攪拌2小時。溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。之后再用乙醚洗滌，放入透析袋中 透析2天，冷凍干燥得到目標化合物N- (1， 4， 7-三氮雜環(huán)壬基)乙?；瘹?聚糖，結(jié)構(gòu)式如下<formula>formula see original document page 10</formula>按常規(guī)方法對目標產(chǎn)物進行了核磁共振氫譜和紅外光譜分析，其結(jié)果如
下
氫譜NMR (DMSO-d6, 600MHz)S: 2.013(s, H of CH3 in CS)， 2.84-2.97(m, H of tacn)， 3.1 l(s， H of -NCH2CO), 3.50(s， H2 of CS), 3.60曙3.79(m， H3, H4， H5, H6 of CS), 4.05(s, H1 of CS)， 4.52-4.79(m， H of D20)。
碳譜13C NMR (D20-d2, 600MHz) S: 22.14(CH3)， 43.08 and 43.76(C of tacn)， 49.79(C of —NCH2CO)， 55.09(C2 of CS)， 60.01(C6 of CS)， 72.07(C6 of CS)， 74.59(C5 of CS), 78.99(C4 of CS)， 101.27(C1 of CS), 174.64(NHCO)。
紅外IR (Dmax/cm",KBr disc): 616, 814， 900， 945, 1032， 1069, 1123, 115, 1203， 1261, 1301, 1377， 1409, 1467, 1561, 1656， 2873， 2924, 3433。
實施例3: 6-O-(l,4，7,10-四氮雜環(huán)十二烷基)乙?；瘹ぞ厶堑闹苽?1 )在冰浴條件下，將2.054g(3.86mmol)4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1，4，7,10-四氮雜環(huán)十二烷基乙酸用10ml N,N 二甲基乙酰胺溶解，加入U881g (4.25mmo1， 1.1倍當量)卡特縮合劑、0.807ml 二異丙基乙胺，攪拌溶解， 撤掉冰浴，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，TLC跟蹤到生成活化酯；將1.126g (3.86mmo1 6 位羥基)N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?Cs-NPTh)用20mlN，N二甲基乙酰胺溶 解，加入4倍當量的二異丙基乙胺，攪拌得到鄰苯二甲?；瘹ぞ厶侨芤?。
(2) 將活化酯與鄰苯二甲?；瘹ぞ厶侨芤夯旌暇鶆?，攪拌12小時。TLC 跟蹤到生成的活化酯反應(yīng)完全，加入水沉淀出固體。得到的沉淀依次用水、 乙醚洗漆，得到6-0- (4， 7， 10-三(叔丁氧羰酰)-l， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二 烷基)乙?；?N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?。
(3) 上步產(chǎn)物用15ml三氟乙酸溶解，而后攪拌3小時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去 溶劑，依次用乙醚、水洗滌，即得6-0- (1， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷基) 乙?；?N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶钱a(chǎn)物。
(4) 所得6-0-大環(huán)多胺衍生化-N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶菓腋≡邴}酸溶液 中，氮氣保護下，回流反應(yīng)10小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，依次用水、乙醇洗 滌，干燥即得目標化合物6-0-大環(huán)多胺衍生化殼聚糖，結(jié)構(gòu)式如下
按常規(guī)方法對目標產(chǎn)物進行了核磁共振氫譜和紅外光譜分析，其結(jié)果如
下
氫譜！H NMR (DMSO隱d6 ,with D20 exchange, 600MHz)5: 2.851 -2.873(q， 1H), 2.6(T\t， O.IH)， 3.148-3.179(t, 1H), 3.45(t,0.2H), 3.488,隱3.507(m， 1H)， 3.57卜3.606(m, 3H)， 3.65(d， 0.2H), 4.614畫4.627(d, 0.1H), 5.182-5.186(d, l.OH)。
碳譜13C畫R (DMSO-d6， 600畫z) 5: 54.570， 57.293, 60.08, 69.949, 70.331, 72.541,77.235， 89.129, 93.180。紅外IR (Dm肌/cm",KBr disc): 608, 773, 912, 1035, 1064, 1094, 1182, 1249, 1392, 1421, 1538， 1584, 1616， 1711, 2941， 3038, 3096, 3292, 3345。
實施例4: 6-0- (1， 4， 7-三氮雜環(huán)壬基)乙?；瘹ぞ厶堑闹苽?br> (1) 在冰浴條件下，將2.9882g (7.72mmo1) 4,7-二(叔丁氧羰酰)-1，4,7-三氮雜環(huán)壬垸基乙酸用10mlN,N二甲基乙酰胺溶解，加入10.213g(23.15mmo1, 3倍當量)卡特縮合劑、1.345ml (7.73mmo1， 2倍當量)二異丙基乙胺，攪 拌均勻，撤掉冰浴，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，TLC跟蹤到生成活化酯；將2,246g
(7.72mmo0 N-鄰苯二甲酰化殼聚糖(Cs-NPTh)用20ml N,N 二甲基乙酰胺 溶解，加入4倍當量的二異丙基乙胺，攪拌得到鄰苯二甲酰化殼聚糖溶液。
(2) 將前兩步所得溶液混合均勻，攪拌24小時。TLC跟蹤到生成的活 化酯反應(yīng)完全，加入水沉淀出固體。得到的沉淀依次用水、乙醚洗滌，即得 6_0- (4， 7-二(叔丁氧羰酰)-l， 4， 7-三氮雜環(huán)壬基)乙?；?N-鄰苯二甲酰化
殼聚糖。
(3) 上步產(chǎn)物用30ml三氟乙酸溶解，而后攪拌4小時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去 溶劑，依次用乙醚、水洗滌，即得6-0- (1， 4， 7-三氮雜環(huán)壬基)乙?；?N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?。
(5)所得6-0- (1， 4， 7-三氮雜環(huán)壬基)乙?；?N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?懸浮在溶液中，氮氣保護下，回流反應(yīng)24小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，依次用 水、乙醇洗滌，干燥即得目標化合物6-0- (1, 4， 7-三氮雜環(huán)壬基)乙?；?殼聚糖，結(jié)構(gòu)式如下
按常規(guī)方法對目標產(chǎn)物進行了紅外光譜分析，其結(jié)果如下.-氫譜& NMR (DMSO-d6, with D20 exchange, 600MHz)S: 2.579-2.61 l(t 0.2H), 2.865-2.888(q, l.OH)， 3.152-3.184(t， 1H), 3.355國3.386(q, 0.2H):3.441畫3.470(q， 0.2H), 3.484-3.513(q， 1H), 3.575誦3.654(m, 3H), 3.671國3.946(d, 0.2H), 4.609-4.623(d, 0.2H), 5.177-5.183(d， 1H)。
碳譜13C NMR (DMSO-d6, 600MHz) 5: 54.535, 57.235, 60.749, 60.878， 69.914, 70.245, 70.336, 72.447, 77.109， 89.113, 93.132。
紅外IR (D臓/cm",KBr disc): 602, 773, 854, 888, 913, 1005, 1034, 1064, 1094, 1116， 1139, 1182， 1279, 1393， 1422， 1538, 1583, 1617, 1712， 2942, 3038, 3096, 3291。
實施例1的產(chǎn)品N- (1， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二烷基)乙?；瘹ぞ厶堑?凝膠阻滯現(xiàn)象
將N- (1， 4， 7， 10-四氮雜環(huán)十二垸基)乙?；瘹ぞ厶侨苡诔兯信?成0.08mg/ml的溶液，取上述0.08mg/ml的溶液，1.6(ag/|id的pUC18質(zhì)粒DNA 和TAE溶液混合于0.5ml離心管中，使目的基因載體濃度依次為0.0016mg/ml， 0.0064mg/ml， 0.0320mg/ml, 0.0560mg/ml, 0.0800mg/ml, 0.1120mg/ml。室溫孵育 30min。然后，進行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其結(jié)果見圖1 。圖1中，泳 道1為空白，泳道2-7依次為不同濃度(0.0016mg/ml, 0.0064mg/ml， 0.0320mg/ml, 0.0560mg/ml, 0.0800mg/ml，0.1120mg/ml)的載體/DNA復(fù)合物。
可以看到N-(l， 4， 7， lO-四氮雜環(huán)十二烷基)乙酰化殼聚糖對質(zhì)粒DNA 在凝膠電泳中有一定的阻滯作用。
實施例1的產(chǎn)品N- (1， 4， 7， lO-四氮雜環(huán)十二烷基)乙?；瘹ぞ厶菍?DNA的保護作用
將N- (1， 4， 7， lO-四氮雜環(huán)十二烷基)乙?；瘹ぞ厶侨苡诔兯信?成0.08mg/ml的溶液，取上述0.08mg/ml的溶液，1.6^g/nl的pUC18質(zhì)粒DNA， Dnasel ， Dnase I buffer混合于0.5ml離心管中，使酶終濃度依次為lU/ml, lOU/ml, 20U/ml，載體終濃度為0.04mg/ml。然后37°(3保溫15min，冰浴終止 反應(yīng)。進行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其結(jié)果見圖2。圖2中，泳道1為 DNA對照；泳道2為DNA與酶，酶終濃度10U/ml;泳道3為DNA與載體， 載體終濃度為0.04mg/ml，泳道4-6依次為不同酶濃度下的載體/DNA復(fù)合物。 可以看到，泳道2點樣孔不亮，DNA已經(jīng)完全被Dnase I降解；泳道4-6點 樣孔有亮度，證明DNA沒有完全被Dnase I降解，載體對DNA有一定的保 護作用。
權(quán)利要求
1、一種大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體具有如下通式其中R1，R2為大環(huán)多胺類化合物或者H，且必須一種為H，另一種為大環(huán)多胺類化合物，式I中的大環(huán)多胺類化合物以酰胺鍵偶聯(lián)在殼聚糖2位氨基上，或者以酯鍵偶聯(lián)在殼聚糖6位羥基上；x與y的比值范圍為1.2-2.3，x+y值的范圍為59-178。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體，其特征在于 Rt為H， 1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷基乙?；?，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷基乙?；?R2為H， 1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷基乙?；?,4，7,10-四氮雜環(huán)十二烷基乙?；?。
3、如權(quán)利要求1所述的大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體的制備方法，其特 征在于，采用以下兩種方案方案一包括如下步驟(1) 將6-0-三苯基甲醚化殼聚糖，溶于N,N,-二甲基甲酰胺中得到三苯 基甲醚化殼聚糖溶液；叔丁氧羰基保護的大環(huán)多胺衍生物用N,N-二甲基甲酰 胺溶解，加入NaHC03，攪拌均勻得到大環(huán)多胺溶液；(2) 將上述三苯基甲醚化殼聚糖溶液與大環(huán)多胺溶液混合，攪拌均勻， 加入1-乙基(-3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺，攪拌反應(yīng)12-24小時得到反 應(yīng)液；得到的反應(yīng)液加入乙醚沉淀、離心，沉淀再用乙醚洗滌，在透析袋中用 去離子水透析2-4天，冷凍干燥得到6-0-三苯基甲醚化-N-叔丁氧羰基保護大 環(huán)多胺衍生化殼聚糖；(3) 所得產(chǎn)品6-0-三苯基甲醚化-N-叔丁氧羰基保護大環(huán)多胺 衍生化殼聚糖加入三氟乙酸室溫攪拌使其溶解澄清，繼續(xù)攪拌2-6小時；然后 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，之后再用乙醚洗滌，放入透析袋中用去離子水透析2-4天，冷凍干燥得到N-大環(huán)多胺衍生化殼聚糖； 方案二包括如下步驟1) 在冰浴條件下，將叔丁氧羰基保護的大環(huán)多胺衍生物用N，N二甲基乙 酰胺溶解，加入卡特縮合劑和N，N-二異丙基乙胺，攪拌均勻，撤掉冰浴，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，TLC跟蹤到生成活化酯；將N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶怯肗，N二甲 基乙酰胺溶解，加入N，N-二異丙基乙胺，攪拌均勻，得到鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?溶液；2) 將上述活化酯與鄰苯二甲?；瘹ぞ厶侨芤夯旌希瑪嚢?2-24小時，TLC 跟蹤到生成的活化酯反應(yīng)完全得到反應(yīng)液；所得反應(yīng)液加入水沉淀出固體；得到的沉淀依次用水和乙醚洗滌；即得 6-0-叔丁氧羰基保護大環(huán)多胺衍生化-N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶?；3) 所得6-0-叔丁氧羰基保護大環(huán)多胺衍生化-N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶怯?三氟乙酸溶解，攪拌2-6小時后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，依次用乙醚和水洗滌， 得到6-0-大環(huán)多胺衍生化-N-鄰苯二甲酰化殼聚糖；4) 所得6-0-大環(huán)多胺衍生化-N-鄰苯二甲?；瘹ぞ厶菓腋≡邴}酸溶液中， 氮氣保護下，回流反應(yīng)12-24小時后旋干溶劑，依次用水和乙醇洗滌，干燥即 得6-0-大環(huán)多胺衍生化殼聚糖。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因載體的應(yīng)用，其特征在于作為非病毒基因 給藥載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖基因載體及其制備方法和應(yīng)用。該基因載體通式如下，其中R₁，R₂為大環(huán)多胺類化合物或者H，大環(huán)多胺以酰胺鍵偶聯(lián)在殼聚糖2位氨基上，或者以酯鍵偶聯(lián)在殼聚糖6位羥基上。通過在殼聚糖大分子骨架上，以EDAC為縮合劑在2位偶聯(lián)大環(huán)多胺得到；或者以BOP試劑為酯縮合試劑在6位偶聯(lián)大環(huán)多胺得到。所述大環(huán)多胺偶聯(lián)殼聚糖化合物可作為非病毒基因載體，用于細胞轉(zhuǎn)染，來治療各種基因病。本發(fā)明用凝膠電泳方法，研究了目標化合物對DNA的結(jié)合與保護作用。為獲得低細胞毒性，高轉(zhuǎn)染效率的非病毒基因載體提供了良好的基礎(chǔ)和有效的途徑。
文檔編號C08B37/08GK101550200SQ200910084909
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者喬仁忠, 劉學(xué)娜, 娜 戎 申請人:北京化工大學(xué)