專利名稱：利用異相形核劑提高生物大分子結(jié)晶條件篩選成功率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高生物大分子結(jié)晶條件篩選成功率的方法，特別是利用異相形
核劑提高生物大分子結(jié)晶條件篩選成功率的方法。
背景技術(shù)：
文獻(xiàn)"Thakur A. S. ， Robin G. ， Guncar G. ， Saunders N. F. W. ， Newman J. ， et al (2007)ImprovedSuccess of Sparse Matrix Protein Crystallization Screening with Heterogeneous Nucleating Agents. PLoS ONE 2(10) :el091. doi :10. 1371/journal, pone. 0001091"公開了一種利用形核劑來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選成功率的方法，將玻璃絲、羥 基磷灰石、纖維素、馬毛、干藻以及其混合物作為篩選形核劑添加到蛋白溶液中，再將蛋白 溶液與沉淀劑混合，進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體生長。這種方法可以提高結(jié)晶的成功率，但仍然存在不 足，體現(xiàn)在(l)由于先將形核劑與蛋白溶液混合，導(dǎo)致蛋白溶液的量吸取的不準(zhǔn)確，(2)蛋 白質(zhì)篩選成功率提高不明顯，如以Hampton公司的96條件篩選試劑Crystal Screen HT作 為篩選條件，六種形核劑使溶菌酶結(jié)晶的成功率提高到5. 2%、6. 3%、7. 3%、6. 3%、9. 4%、 9. 4%，過氧化氫酶結(jié)晶的成功率提高到5. 2%、6. 3%、5. 2%、7. 3%、6. 3%、9. 4%，竹芋蛋 白結(jié)晶的成功率提高到5. 2%、7. 3%、7. 3%、7. 3%、6. 3%、9. 4%。篩選成功率在5. 2% 9. 4%之間。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)生物大分子結(jié)晶條件篩選技術(shù)結(jié)晶成功率低的問題，本發(fā)明提 供一種利用異相形核劑提高生物大分子結(jié)晶條件篩選成功率的方法，采用無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、及四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球作為 異相形核劑，可以提高生物大分子結(jié)晶條件篩選的成功率。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種利用異相形核劑提高生物大分
子結(jié)晶條件篩選成功率的方法，其特點(diǎn)是包括下述步驟 (a)將異相形核劑用超純水溶解，調(diào)節(jié)濃度至50mg/ml ; (b)取步驟(a)所述混合溶液1 P l，加入至結(jié)晶孔板小孔中，在30°C 6(TC溫控 箱中放置2 6小時(shí)后取出，使水分蒸發(fā)，得到的結(jié)晶孔板為異相形核結(jié)晶篩選孔板；
(c)配制生物大分子溶液； (d)將篩選試劑滴入步驟(b)得到的異相形核結(jié)晶篩選孔板中，將生物大分子溶 液滴入所述結(jié)晶篩選孔板中，使篩選試劑與異相形核劑實(shí)現(xiàn)界面接觸，獲得具有異相形核 劑的結(jié)晶溶液體系； (e)將步驟(c)得到的結(jié)晶溶液體系放置于溫控環(huán)境中生長，取出在顯微鏡下觀 察，統(tǒng)計(jì)獲得晶體的條件數(shù)目。 所述異相形核劑是無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯
3微球、四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球任一種或任幾種。 本發(fā)明的有益效果是(l)采用新的異相形核劑，包括無孔聚苯乙烯/二乙烯基 苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球以及它們的混 合物，先制備成異相形核結(jié)晶篩選孔板，再將生物大分子溶液以及篩選試劑分別滴入上述 小孔中，可使生物大分子結(jié)晶篩選成功率由現(xiàn)有技術(shù)的3. 1% 13.5%提高到11.5% 34. 3% ; (2)不需要先將形核劑與生物大分子溶液混合，避免生物大分子溶液與篩選試劑之 間的配比不準(zhǔn)確。 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :添加無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球作為篩選形核劑用于溶菌酶結(jié)晶 條件篩選。 第一步將無孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球用超純水分散，并調(diào)節(jié)濃度為50mg/ ml。 第二步用自動(dòng)取液器取第一步得到的溶液1 Pl加入96孔板的結(jié)晶小孔中，在 6(TC溫控箱中放置3小時(shí)后取出，使水分蒸發(fā)，得到的結(jié)晶孔板為異相形核結(jié)晶篩選孔板。
第三步將經(jīng)過六次重結(jié)晶的日本Seikagaku公司的貨號(hào)為100940的溶菌酶，溶 于pH為4. 60， 0. 2M的醋酸鈉緩沖液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩陣篩選試劑盒的結(jié)晶緩沖液 對(duì)溶菌酶的結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。將第二步處理的異相形核結(jié)晶篩選孔板放在自動(dòng)移液系統(tǒng) 上，系統(tǒng)設(shè)置為添加沉淀劑90 ii 1到母液池，添加0. 5 iil沉淀劑以及0. 5 iil蛋白溶液至結(jié) 晶小孔中，分別混合并與異相形核劑實(shí)現(xiàn)界面接觸，獲得采用異相形核劑的結(jié)晶溶液體系， 采用氣相擴(kuò)散坐滴法結(jié)晶。 第五步上述結(jié)晶溶液體系在2(TC溫控箱中放置96小時(shí)后，利用自動(dòng)顯微拍照系 統(tǒng)觀察并統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)溶菌酶晶體的條件數(shù)目。 經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到結(jié)果如下添加無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球的溶菌酶結(jié)晶篩選 成功率20. 8%，與文獻(xiàn)中添加形核劑得到的溶菌酶結(jié)晶篩選成功率5. 2% 9. 4%相比有 大幅度提高。 實(shí)施例2 :添加有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球作為篩選形核劑用于溶菌酶結(jié)晶 條件篩選。 第一步將有孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球用超純水分散，并調(diào)節(jié)濃度為50mg/ ml。 第二步用自動(dòng)取液器取第一步得到的溶液1 Pl加入96孔板的結(jié)晶小孔中，在 6(TC溫控箱中放置3小時(shí)后取出，使水分蒸發(fā)，得到的結(jié)晶孔板為異相形核結(jié)晶篩選孔板。
第三步將經(jīng)過六次重結(jié)晶的日本Seikagaku公司的貨號(hào)為100940的溶菌酶，溶 于pH為4. 60， 0. 2M的醋酸鈉緩沖液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩陣篩選試劑盒的結(jié)晶緩沖液 對(duì)溶菌酶的結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。將第二步處理的異相形核結(jié)晶篩選孔板放在自動(dòng)移液系統(tǒng) 上，系統(tǒng)設(shè)置為添加沉淀劑90 1到母液池，添加1 y 1沉淀劑以及1 P 1蛋白溶液至結(jié)晶小孔中，分別混合并與異相形核劑實(shí)現(xiàn)界面接觸，獲得采用異相形核劑的結(jié)晶溶液體系，采用 氣相擴(kuò)散坐滴法結(jié)晶。 第五步上述結(jié)晶溶液體系在2(TC溫控箱中放置96小時(shí)后，利用自動(dòng)顯微拍照系 統(tǒng)觀察并統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)溶菌酶晶體的條件數(shù)目。 經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到結(jié)果如下添加有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球的溶菌酶結(jié)晶篩選 成功率25. 0%，與文獻(xiàn)中添加形核劑得到的溶菌酶結(jié)晶篩選成功率5. 2% 9. 4%相比，有 大幅度提高。 實(shí)施例3 :添加四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球作為篩選形核劑用于溶菌酶結(jié)晶 條件篩選。 第一步將四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球用超純水分散，并調(diào)節(jié)濃度為50mg/ ml。 第二步用自動(dòng)取液器取第一步得到的溶液1 Pl加入96孔板的結(jié)晶小孔中，在 6(TC溫控箱中放置3小時(shí)后取出，使水分蒸發(fā)，得到的結(jié)晶孔板為異相形核結(jié)晶篩選孔板。
第三步將經(jīng)過六次重結(jié)晶的日本Seikagaku公司的貨號(hào)為100940的溶菌酶，溶 于pH為4. 60， 0. 2M的醋酸鈉緩沖液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩陣篩選試劑盒的結(jié)晶緩沖液 對(duì)溶菌酶的結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。將第二步處理的異相形核結(jié)晶篩選孔板放在自動(dòng)移液系統(tǒng) 上，系統(tǒng)設(shè)置為添加沉淀劑90iU到母液池，添加1. 5iU沉淀劑以及1. 5iU蛋白溶液至結(jié) 晶小孔中，分別混合并與異相形核劑實(shí)現(xiàn)界面接觸，獲得采用異相形核劑的結(jié)晶溶液體系， 采用氣相擴(kuò)散坐滴法結(jié)晶。 第五步上述結(jié)晶溶液體系在2(TC溫控箱中放置96小時(shí)后，利用自動(dòng)顯微拍照系 統(tǒng)觀察并統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)溶菌酶晶體的條件數(shù)目。 經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到結(jié)果如下添加四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球的溶菌酶結(jié)晶篩選 成功率20. 8%，與文獻(xiàn)中添加形核劑得到的溶菌酶結(jié)晶篩選成功率5. 2% 9. 4%相比，有 大幅度提高。 實(shí)施例4 :添加無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微 球混合物作為篩選形核劑用于過氧化氫酶結(jié)晶條件篩選。 第一步將無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球混 合物用超純水分散，并調(diào)節(jié)濃度為50mg/ml。 第二步用自動(dòng)取液器取第一步得到的溶液liU加入96孔板的結(jié)晶小孔中， 在6(TC溫控箱中放置3小時(shí)后取出，使水分蒸發(fā)，得到的結(jié)晶孔板為異相形核結(jié)晶篩選孔 板。。 第三步將Sigma公司的貨號(hào)為C40的過氧化氫酶，溶于pH為4. 60， 25mM的HEPES 鈉緩沖液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩陣篩選試劑盒的結(jié)晶緩沖液 對(duì)溶菌酶的結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。將第二步處理的異相形核結(jié)晶篩選孔板放在自動(dòng)移液系統(tǒng) 上，系統(tǒng)設(shè)置為添加沉淀劑90 1到母液池，添加0. 5 ill沉淀劑以及0. 5 ill蛋白溶液至結(jié) 晶小孔中，分別混合并與異相形核劑實(shí)現(xiàn)界面接觸，獲得采用異相形核劑的結(jié)晶溶液體系， 采用氣相擴(kuò)散坐滴法結(jié)晶。
第五步上述結(jié)晶溶液體系在2(TC溫控箱中放置96小時(shí)后，利用自動(dòng)顯微拍照系 統(tǒng)觀察并統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)過氧化氫酶晶體的條件數(shù)目。 經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到結(jié)果如下添加無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球的混合物的過氧化氫酶結(jié)晶篩選成功率29. 1%，與文獻(xiàn)中添加形核劑得到 的過氧化氫酶結(jié)晶篩選成功率5. 2% 9. 4%相比，有大幅度提高。 實(shí)施例5 :添加有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微 球的混合物作為篩選形核劑用于過氧化氫酶結(jié)晶條件篩選。 第一步將有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球混 合物用超純水分散，并調(diào)節(jié)濃度為50mg/ml。 第二步用自動(dòng)取液器取第一步得到的溶液liU加入96孔板的結(jié)晶小孔中， 在6(TC溫控箱中放置3小時(shí)后取出，使水分蒸發(fā)，得到的結(jié)晶孔板為異相形核結(jié)晶篩選孔 板。。 第三步將Sigma公司的貨號(hào)為C40的過氧化氫酶，溶于pH為4. 60， 25mM的HEPES 鈉緩沖液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩陣篩選試劑盒的結(jié)晶緩沖液 對(duì)溶菌酶的結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。將第二步處理的異相形核結(jié)晶篩選孔板放在自動(dòng)移液系統(tǒng) 上，系統(tǒng)設(shè)置為添加沉淀劑90 ii 1到母液池，添加0. 5 iil沉淀劑以及0. 5 iil蛋白溶液至結(jié) 晶小孔中，分別混合并與異相形核劑實(shí)現(xiàn)界面接觸，獲得采用異相形核劑的結(jié)晶溶液體系， 采用氣相擴(kuò)散坐滴法結(jié)晶。 第五步上述結(jié)晶溶液體系在2(TC溫控箱中放置96小時(shí)后，利用自動(dòng)顯微拍照系 統(tǒng)觀察并統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)過氧化氫酶晶體的條件數(shù)目。 經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到結(jié)果如下添加有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和四氧化三鐵/聚 苯乙烯磁性微球混合物的過氧化氫酶結(jié)晶篩選成功率27. 1%，與文獻(xiàn)中添加形核劑得到的 過氧化氫酶結(jié)晶篩選成功率5. 2% 9. 4%相比，有大幅度提高。 實(shí)施例6 :添加無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微 球混合物作為篩選形核劑用于過氧化氫酶結(jié)晶條件篩選。 第一步將無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球和四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球混 合物用超純水分散，并調(diào)節(jié)濃度為50mg/ml。 第二步用自動(dòng)取液器取第一步得到的溶液liU加入96孔板的結(jié)晶小孔中， 在6(TC溫控箱中放置3小時(shí)后取出，使水分蒸發(fā)，得到的結(jié)晶孔板為異相形核結(jié)晶篩選孔 板。。 第三步將Sigma公司的貨號(hào)為C40的過氧化氫酶，溶于pH為4. 60，25mM的HEPES 鈉緩沖液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩陣篩選試劑盒的結(jié)晶緩沖液 對(duì)溶菌酶的結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。將第二步處理的異相形核結(jié)晶篩選孔板放在自動(dòng)移液系統(tǒng) 上，系統(tǒng)設(shè)置為添加沉淀劑90iU到母液池，添加O. 5iU沉淀劑以及0. 5iU蛋白溶液至結(jié) 晶小孔中，分別混合并與異相形核劑實(shí)現(xiàn)界面接觸，獲得采用異相形核劑的結(jié)晶溶液體系， 采用氣相擴(kuò)散坐滴法結(jié)晶。 第五步上述結(jié)晶溶液體系在2(TC溫控箱中放置96小時(shí)后，利用自動(dòng)顯微拍照系統(tǒng)觀察并統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)過氧化氫酶晶體的條件數(shù)目。 經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到結(jié)果如下添加無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球與四氧化三鐵/聚 苯乙烯磁性微球混合物的過氧化氫酶結(jié)晶篩選成功率31.3%，與文獻(xiàn)中添加形核劑得到的 過氧化氫酶結(jié)晶篩選成功率5. 2% 9. 4%相比，有大幅度提高。 實(shí)施例7 :添加無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球 以及四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球的混合物作為篩選形核劑用于竹芋蛋白結(jié)晶條件篩 選。
第一步將無孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球以及
四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球混合物用超純水分散，并調(diào)節(jié)濃度為50mg/ml。 第二步用自動(dòng)取液器取第一步得到的溶液1 Pl加入96孔板的結(jié)晶小孔中，
在6(TC溫控箱中放置3小時(shí)后取出，使水分蒸發(fā)，得到的結(jié)晶孔板為異相形核結(jié)晶篩選孔板。。 第三步將Sigma公司的貨號(hào)為T7638的竹芋蛋白，溶于pH為4. 60， 25mM的HEPES 鈉緩沖液中。 第四步用Hampton公司Crystal Screen HT稀疏矩陣篩選試劑盒的結(jié)晶緩沖液 對(duì)溶菌酶的結(jié)晶條件進(jìn)行篩選。將第二步處理的異相形核結(jié)晶篩選孔板放在自動(dòng)移液系統(tǒng) 上，系統(tǒng)設(shè)置為添加沉淀劑90 ii 1到母液池，添加0. 5 iil沉淀劑以及0. 5 iil蛋白溶液至結(jié) 晶小孔中，分別混合并與異相形核劑實(shí)現(xiàn)界面接觸，獲得采用異相形核劑的結(jié)晶溶液體系， 采用氣相擴(kuò)散坐滴法結(jié)晶。 第五步上述結(jié)晶溶液體系在2(TC溫控箱中放置96小時(shí)后，利用自動(dòng)顯微拍照系 統(tǒng)觀察并統(tǒng)計(jì)竹芋蛋白晶體的條件數(shù)目。 經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到結(jié)果如下添加無孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球以及四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球混合物的竹芋蛋白結(jié)晶篩選成功率 13. 5%，與文獻(xiàn)中添加形核劑得到的竹芋蛋白結(jié)晶篩選成功率5. 2% 9. 4%相比，有大幅 度提高。 除上述的實(shí)施例外，本發(fā)明方法也用于刀豆蛋白A、蛋白酶K以及糜蛋白酶原的結(jié) 晶條件篩選，得到的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選成功率也有大幅度提高。
權(quán)利要求
一種利用異相形核劑提高生物大分子結(jié)晶條件篩選成功率的方法，其特征在于包括以下步驟(a)將異相形核劑用超純水溶解，調(diào)節(jié)濃度至50mg/ml；(b)取步驟(a)所述混合溶液1μl，加入至結(jié)晶孔板小孔中，在30℃～60℃溫控箱中放置2～6小時(shí)后取出，使水分蒸發(fā)，得到的結(jié)晶孔板為異相形核結(jié)晶篩選孔板；(c)配制生物大分子溶液；(d)將篩選試劑滴入步驟(b)得到的異相形核結(jié)晶篩選孔板中，將生物大分子溶液滴入所述結(jié)晶篩選孔板中，使篩選試劑與異相形核劑實(shí)現(xiàn)界面接觸，獲得具有異相形核劑的結(jié)晶溶液體系；(e)將步驟(c)得到的結(jié)晶溶液體系放置于溫控環(huán)境中生長，取出在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)獲得晶體的條件數(shù)目。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述異相形核劑是無孔聚苯乙烯/ 二乙 烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/ 二乙烯基苯微球、四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球任一種或任 幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用異相形核劑提高生物大分子結(jié)晶條件篩選成功率的方法，采用無孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球作為異相形核劑，采用蒸發(fā)擴(kuò)散坐滴法結(jié)晶。由于采用“無孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、有孔聚苯乙烯/二乙烯基苯微球、四氧化三鐵/聚苯乙烯磁性微球”作為異相形核劑，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化蛋白質(zhì)大分子的異相形核，同時(shí)，這種方法避免了吸入蛋白量不準(zhǔn)確以及避免篩選形核劑引起的自動(dòng)移液系統(tǒng)堵針現(xiàn)象。蛋白質(zhì)結(jié)晶條件稀疏矩陣篩選成功率由現(xiàn)有技術(shù)的3.1％～13.5％提高到11.5％～34.3％。
文檔編號(hào)C08L25/06GK101748107SQ20091021949
公開日2010年6月23日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者劉永明, 尹大川, 王燕, 郭云珠, 馬曉亮 申請人:西北工業(yè)大學(xué)