專利名稱：一種玉足海參糖胺聚糖的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖胺聚糖的提取方法。
背景技術(shù)：
中風(fēng)病為中醫(yī)的四大頑癥之一，其高發(fā)病率、高致殘率、高病死率嚴(yán)重危害人類健康。 缺血性中風(fēng)(腦梗死)約占全部腦中風(fēng)的60% 80%，其發(fā)病率為110/10萬人口，且呈逐年上 升趨勢，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對缺血性中風(fēng)的病因、發(fā)病機理的研究進展非常迅速，在治療方面進展不 大；其中，只有溶栓被公認(rèn)為有確切的療效，但是，現(xiàn)有溶栓藥物在使用中因時間窗(72h內(nèi) )要求及高出血風(fēng)險，而限制其廣泛應(yīng)用。
海參含有的多糖主要有兩種， 一種為海參糖胺聚糖，另一種為海參巖藻多糖；研究表明 海參多糖具有抗癌、提高免疫力、抗凝、促進纖溶、降低血粘度、調(diào)節(jié)血脂、抗病毒等多種 生理活性，在抗凝等方面糖胺聚糖較巖藻多糖具有更強的活性。玉足海參糖胺聚糖( Holothuria leucospilota Glycosaminoglycan， HG)，舊稱粘多糖、酸性粘多糖或硫酸粘 多糖。玉足海參糖胺聚糖具有抗凝、纖溶、降低血粘度、調(diào)節(jié)血脂等活性，作用于缺血性中 風(fēng)(腦梗死)的各個環(huán)節(jié)，從而達到治療缺血性中風(fēng)的目的。糖胺聚糖是海參中與中風(fēng)治療 有關(guān)的主要藥效成份；但是，目前從玉足海參中提取的玉足海參糖胺聚糖為粗品(質(zhì)量純度 僅為50% 60%)，不能直接用于制成注射劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決目前從玉足海參中提取的玉足海參糖胺聚糖質(zhì)量純度低，不能直接用于 制成注射劑的問題，而提供一種玉足海參糖胺聚糖的提取方法。
玉足海參糖胺聚糖的提取方法按以下步驟實現(xiàn) 一、按體積份數(shù)比稱取l份玉足海參粉 、7 9份純化水、0. 01 0. 03份堿性蛋白酶、0. 001 0. 003份復(fù)合胰酶和0. 6 l份無水乙醇 ，將玉足海參粉與純化水混合，然后加入堿性蛋白酶，并在60 7(TC下酶解4 5h，再在80 9(TC下滅活5 15min，降溫至5(TC加入復(fù)合胰酶并酶解4 5h，然后在98 10(TC下滅活5 15min，冷卻后離心并調(diào)節(jié)pH值為2 3，在溫度為0 1(TC的條件下靜置15 20h后取上清 液并調(diào)節(jié)pH值為6 7，再加入無水乙醇，在溫度為0 l(TC的條件下靜置15 20h后離心得沉 淀A; 二、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀A、 15 25份純化水、2份可溶性鈣鹽和0.6 1份無 水乙醇，將沉淀A與純化水混合，加熱至80 9(TC并調(diào)節(jié)pH值為8 10，然后加入可溶性鈣鹽
4并在90 10(TC下保溫15 25min，冷卻后離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為10 12，再離心取上清 液并調(diào)節(jié)pH值為5. 5 6. 5，然后加入無水乙醇，在溫度為0 l(TC的條件下靜置15 20h后離 心得沉淀B;三、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀B和6 12份純化水，將沉淀B與純化水混合 ，然后加入鉀鹽至鉀離子濃度達到2mol/L，在溫度為0 l(TC的條件下靜置15 20h后離心取 沉淀用純化水溶解，再加入鉀鹽至鉀離子濃度達到2mol/L，在溫度為0 1(TC的條件下靜置 15 20h后離心取沉淀，依次用體積濃度為70%的乙醇和無水乙醇洗滌，得沉淀C;四、按體 積份數(shù)比重新稱取1份沉淀C、 40 60份濃度為0. 02 0. 08mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液和0. 8 1.2份無水乙醇，將沉淀C與濃度為O. 02 0. 08mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液混合，然后用二 乙氨乙基纖維素進行層析，再用濃度為0.4mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌，然后用濃度為 1. Omol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液進行紫外分光光度測試，選取吸收光波長 為215nm的洗脫液，然后加入無水乙醇，在溫度為0 1(TC的條件下靜置15 20h后離心，得 沉淀D;五、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀D、 15 25份的生理鹽水、0.01 0.03份質(zhì)量濃 度為30%的過氧化氫和0. 8 1. 2份無水乙醇，將沉淀D與生理鹽水混合并調(diào)節(jié)pH值為10 12， 然后加入質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫，在60 7(TC下保溫4 6h，冷卻后離心取上清液并調(diào)節(jié) pH值為6. 5 7. 5，再加入無水乙醇，在溫度為0 l(TC的條件下靜置15 20h后離心，得沉淀 E;六、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀E和15 25份的注射用生理鹽水，將沉淀E與注射用生 理鹽水混合，然后用透析膜對注射用水透析24h或者用10000分子量滲透膜超濾截流，取固相 產(chǎn)物，冷凍干燥后即得玉足海參糖胺聚糖；其中步驟一、二、三、四和五中離心的轉(zhuǎn)速均為 4000 5000r/min，時間均為15 20min;步驟四中醋酸-醋酸鈉緩沖液的pH值均為6。
本發(fā)明中從玉足海參中提取的玉足海參糖胺聚糖質(zhì)量純度高達93% 99%，重均分子量為 90000 130000，能夠直接用于制備注射劑，制成的注射劑安全、有效，在國家食品藥品監(jiān) 督管理局9家臨床試驗基地中完成的700例臨床試驗已經(jīng)得到證實。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式玉足海參糖胺聚糖的提取方法按以下步驟實現(xiàn) 一、按體 積份數(shù)比稱取l份玉足海參粉、7 9份純化水、0.01 0.03份堿性蛋白酶、0.001 0.003份 復(fù)合胰酶和0.6 1份無水乙醇，將玉足海參粉與純化水混合，然后加入堿性蛋白酶，并在60 7(TC下酶解4 5h，再在80 9(TC下滅活5 15min，降溫至5(TC加入復(fù)合胰酶并酶解4 5h ，然后在98 10(TC下滅活5 15min，冷卻后離心并調(diào)節(jié)pH值為2 3，在溫度為0 1(TC的條 件下靜置15 20h后取上清液并調(diào)節(jié)pH值為6 7，再加入無水乙醇，在溫度為0 1(TC的條件 下靜置15 20h后離心得沉淀A; 二、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀A、 15 25份純化水、2份可溶性鈣鹽和O. 6 l份無水乙醇，將沉淀A與純化水混合，加熱至80 9(TC并調(diào)節(jié)pH值為8 10，然后加入可溶性鈣鹽并在90 10(TC下保溫15 25min，冷卻后離心取上清液并調(diào)節(jié)pH 值為10 12，再離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為5. 5 6. 5，然后加入無水乙醇，在溫度為0 10 °C的條件下靜置15 20h后離心得沉淀B;三、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀B和6 12份純 化水，將沉淀B與純化水混合，然后加入鉀鹽至鉀離子濃度達到2mol/L，在溫度為0 1(TC的 條件下靜置15 20h后離心取沉淀用純化水溶解，再加入鉀鹽至鉀離子濃度達到2mol/L，在 溫度為0 l(TC的條件下靜置15 20h后離心取沉淀，依次用體積濃度為70%的乙醇和無水乙 醇洗滌，得沉淀C;四、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀C、 40 60份濃度為0. 02 0. 08mol/L 的醋酸-醋酸鈉緩沖液和O. 8 1. 2份無水乙醇，將沉淀C與濃度為O. 02 0. 08mol/L的醋酸-醋 酸鈉緩沖液混合，然后用二乙氨乙基纖維素進行層析，再用濃度為O. 4mol/L的醋酸-醋酸鈉 緩沖液洗滌，然后用濃度為l. Omol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液進行紫外分光 光度測試，選取吸收光波長為215nm的洗脫液，然后加入無水乙醇，在溫度為0 1(TC的條件 下靜置15 20h后離心，得沉淀D;五、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀D、 15 25份的生理鹽 水、0. 01 0. 03份質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫和0. 8 1. 2份無水乙醇，將沉淀D與生理鹽水混 合并調(diào)節(jié)pH值為10 12，然后加入質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫，在60 7(TC下保溫4 6h，冷 卻后離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為6. 5 7. 5，再加入無水乙醇，在溫度為0 1(TC的條件下靜 置15 20h后離心，得沉淀E;六、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀E和15 25份的注射用生理 鹽水，將沉淀E與注射用生理鹽水混合，然后用透析膜對注射用水透析24h或者用10000分子 量滲透膜超濾截流，取固相產(chǎn)物，冷凍干燥后即得玉足海參糖胺聚糖；其中步驟一、二、三 、四和五中離心的轉(zhuǎn)速均為4000 5000r/min，時間均為15 20min;步驟四中醋酸-醋酸鈉 緩沖液的pH值均為6。
本實施方式中可溶性鈣鹽為現(xiàn)有的各種可溶性鈣鹽晶體。
本實施方式中鉀鹽為現(xiàn)有的各種鉀鹽。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中按體積份數(shù)比稱取l 份玉足海參粉、7份純化水、O.Ol份堿性蛋白酶、0.001份復(fù)合胰酶和0.6份無水乙醇。其它 步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中按體積份數(shù)比稱取l 份玉足海參粉、9份純化水、0.03份堿性蛋白酶、0.003份復(fù)合胰酶和1份無水乙醇。其它步 驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中按體積份數(shù)比稱取l份玉足海參粉、8份純化水、0.02份堿性蛋白酶、0.002份復(fù)合胰酶和0.8份無水乙醇。其它 步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中按體積份數(shù)比稱取l 份玉足海參粉、8.5份純化水、0.025份堿性蛋白酶、0.0025份復(fù)合胰酶和0.7份無水乙醇。 其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
二、三、四或五不同的是步驟二中按體積 份數(shù)比重新稱取1份沉淀A、 16 22份純化水和0. 6份無水乙醇。其它步驟及參數(shù)與具體實施 方式一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
六不同的是步驟二中按體積份數(shù)比重新稱 取1份沉淀A、 18份純化水和1份無水乙醇。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
六相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
六不同的是步驟二中按體積份數(shù)比重新稱 取1份沉淀A、 20份純化水和0.8份無水乙醇。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
六相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
七或八不同的是步驟三中按體積份數(shù)比重 新稱取1份沉淀B和8 10份純化水。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
七或八相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
九不同的是步驟三中按體積份數(shù)比重新稱 取1份沉淀B和9份純化水。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
九相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
九不同的是步驟三中按體積份數(shù)比重新 稱取1份沉淀B和11份純化水。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
九相同。
具體實施方式
十二本實施方式與具體實施方式
十或十一不同的是步驟三和四中洗滌次 數(shù)均為3 5次。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
十或十一相同。
具體實施方式
十三本實施方式與具體實施方式
十二不同的是步驟三和四中洗滌次數(shù)均
為4次。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
十二相同。
具體實施方式
十四本實施方式與具體實施方式
十三不同的是步驟四中按體積份數(shù)比重 新稱取1份沉淀C、 45 55份濃度為0. 03 0. 07mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液和O. 9 1. l份無水 乙醇。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
十三相同。
具體實施方式
十五本實施方式與具體實施方式
十三不同的是步驟四中按體積份數(shù)比重 新稱取1份沉淀C、 50份濃度為0. 04mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液和l份無水乙醇。其它步驟及 參數(shù)與具體實施方式
十三相同。
具體實施方式
十六本實施方式與具體實施方式
十三不同的是步驟四中按體積份數(shù)比重 新稱取1份沉淀C、 53份濃度為0. 05mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液和0. 8份無水乙醇。其它步驟
7及參數(shù)與具體實施方式
十三相同。
具體實施方式
十七本實施方式與具體實施方式
十四、十五或十六不同的是步驟五中按 體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀D、 16 23份的生理鹽水、0. 015 0. 025份質(zhì)量濃度為30%的過 氧化氫和0.9 1. l份無水乙醇。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
十四、十五或十六相同。
具體實施方式
十八本實施方式與具體實施方式
十七不同的是步驟五中按體積份數(shù)比重 新稱取1份沉淀D、 18份的生理鹽水、0.01份質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫和0.9份無水乙醇。其 它步驟及參數(shù)與具體實施方式
十七相同。
具體實施方式
十九本實施方式與具體實施方式
十七不同的是步驟五中按體積份數(shù)比重 新稱取1份沉淀D、 20份的生理鹽水、0.02份質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫和1.2份無水乙醇。其 它步驟及參數(shù)與具體實施方式
十七相同。
具體實施方式
二十本實施方式與具體實施方式
十八或十九不同的是步驟六中按體積份 數(shù)比重新稱取1份沉淀E和16 24份的注射用生理鹽水。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
十八 或十九相同。
具體實施方式
二十一本實施方式與具體實施方式
二十不同的是步驟六中按體積份數(shù)比 重新稱取1份沉淀E和18份的注射用生理鹽水。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二十相同。
具體實施方式
二十二本實施方式與具體實施方式
二十不同的是步驟六中按體積份數(shù)比 重新稱取1份沉淀E和22份的注射用生理鹽水。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二十相同。
具體實施方式
二十三本實施方式玉足海參糖胺聚糖的提取方法按以下步驟實現(xiàn)一、 按體積份數(shù)比稱取l份玉足海參粉、8份純化水、0.02份堿性蛋白酶、0. 002份復(fù)合胰酶和0. 8 份無水乙醇，將玉足海參粉與純化水混合，然后加入堿性蛋白酶，并在65i:下酶解5h，再在 85。C下滅活10min，降溫至5(TC加入復(fù)合胰酶并酶解5h，然后在95。C下滅活10min，冷卻后離 心并調(diào)節(jié)pH值為3， 4'C靜置15h后取上清液并調(diào)節(jié)pH值為7，再加入無水乙醇，在溫度為4'C 的條件下靜置15h后離心得沉淀A; 二、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀A、 16份純化水、2份 可溶性鈣鹽和0.8份無水乙醇，將沉淀A與純化水混合，加熱至85'C并調(diào)節(jié)pH值為10，然后加 入可溶性鈣鹽并在9(TC下保溫20min，冷卻后離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為ll，再離心取上清 液并調(diào)節(jié)pH值為6，然后加入無水乙醇，在溫度為4。C的條件下靜置15h后離心得沉淀B;三、 按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀B和8份純化水，將沉淀B與純化水混合，然后加入鉀鹽至鉀離 子濃度達到2mol/L，在溫度為4'C的條件下靜置15h后離心取沉淀用純化水溶解，再加入鉀鹽 至鉀離子濃度達到2mol/L，在溫度為4'C的條件下靜置15h后離心取沉淀，依次用體積濃度為 70%的乙醇和無水乙醇洗滌，得沉淀C;四、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀C、 45份濃度為0. 04mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液和l份無水乙醇，將沉淀C與濃度為O. 04mol/L的醋酸-醋酸鈉 緩沖液混合，然后用二乙氨乙基纖維素進行層析，再用濃度為O. 4mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖 液洗滌，然后用濃度為1.0mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液進行紫外分光光度 測試，選取吸收光波長為215nm的洗脫液，然后加入無水乙醇，在溫度為4。C的條件下靜置 15h后離心，得沉淀D;五、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀D、 18份的生理鹽水、0.02份質(zhì)量 濃度為30%的過氧化氫和1份無水乙醇，將沉淀D與生理鹽水混合并調(diào)節(jié)pH值為ll，然后加入 質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫，在65。C下保溫5h，冷卻后離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為7，再加入 無水乙醇，在溫度為4。C的條件下靜置15h后離心，得沉淀E;六、按體積份數(shù)比重新稱取l份 沉淀E和20份的注射用生理鹽水，將沉淀E與注射用生理鹽水混合，然后用透析膜對注射用水 透析24h取固相產(chǎn)物，冷凍干燥后即得玉足海參糖胺聚糖；其中步驟一、二、三、四和五中 離心的轉(zhuǎn)速均為4500r/min，時間均為20min;步驟四中醋酸-醋酸鈉緩沖液的pH值均為6。
本實施方式中所得玉足海參糖胺聚糖，質(zhì)量純度為99%，重均分子量為130000，能夠用 于制備注射劑，制成的注射劑安全、有效。
本實施方式中所得玉足海參糖胺聚糖制備成注射劑，治療用藥量為注射用玉足海參糖胺 聚糖20mg，加入質(zhì)量濃度為0.9%氯化鈉注射液或質(zhì)量濃度為5%葡萄糖2501111中，每日1次，靜 點，每分鐘不超過40滴；連續(xù)用藥14天為一療程；藥品不良反應(yīng)發(fā)生率低，安全性較好。
本實施方式中所得玉足海參糖胺聚糖制備成注射劑，治療中風(fēng)病(腦梗死)癥見半身不 遂，失語，口舌歪斜，偏身感覺障礙，頭暈頭痛，面色晦暗，舌質(zhì)暗，或瘀點或瘀斑，脈象 細澀或弦澀(瘀血阻絡(luò)證)患者，通過試驗藥物治療組347例、陽性藥物對照組116例臨床試 驗驗證，得出試驗組用藥14天時，能夠改善上述中醫(yī)癥狀、體征，并能降低中風(fēng)病(腦梗死 )的神經(jīng)功能缺損評分(NIHSS評分)，同時可使患者的日常生活能力(ADL)明顯改善，療 效確切。
具體實施方式
二十四本實施方式玉足海參糖胺聚糖的提取方法按以下步驟實現(xiàn)一、 按體積份數(shù)比稱取l份玉足海參粉、7份純化水、O.Ol份堿性蛋白酶、0. OOl份復(fù)合胰酶和O. 6 份無水乙醇，將玉足海參粉與純化水混合，然后加入堿性蛋白酶，并在6(TC下酶解4h，再在 9(TC下滅活5min，降溫至5(TC加入復(fù)合胰酶并酶解4h，然后在98。C下滅活5min，冷卻后離心 并調(diào)節(jié)pH值為2，在溫度為(TC的條件下靜置15h后取上清液并調(diào)節(jié)pH值為6，再加入無水乙醇 ，在溫度為0。C的條件下靜置15h后離心得沉淀A; 二、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀A、 20 份純化水、2份可溶性鈣鹽和0.6份無水乙醇，將沉淀A與純化水混合，加熱至8(TC并調(diào)節(jié)pH 值為8，然后加入可溶性鈣鹽并在9(TC下保溫15min，冷卻后離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為10，再離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為5. 5，然后加入無水乙醇，在溫度為0。C的條件下靜置15h后離 心得沉淀B;三、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀B和6份純化水，將沉淀B與純化水混合，然 后加入鉀鹽至鉀離子濃度達到2mol/L，在溫度為(TC的條件下靜置15h后離心取沉淀用純化水 溶解，再加入鉀鹽至鉀離子濃度達到2mol/L，在溫度為0 l(TC的條件下靜置15h后離心取沉 淀，依次用體積濃度為70%的乙醇和無水乙醇洗滌，得沉淀C;四、按體積份數(shù)比重新稱取l 份沉淀C、 50份濃度為0. 05mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液和O. 8份無水乙醇，將沉淀C與濃度為 0. 05mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液混合，然后用二乙氨乙基纖維素進行層析，再用濃度為 0. 4mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌，然后用濃度為l. Omol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫，收 集洗脫液進行紫外分光光度測試，選取吸收光波長為215nm的洗脫液，然后加入無水乙醇， 在溫度為(TC的條件下靜置15h后離心，得沉淀D;五、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀D、 20 份的生理鹽水、0. 01份質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫和0. 8份無水乙醇，將沉淀D與生理鹽水混 合并調(diào)節(jié)pH值為10，然后加入質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫，在6(TC下保溫4 6h，冷卻后離心 取上清液并調(diào)節(jié)pH值為6. 5，再加入無水乙醇，在溫度為(TC的條件下靜置15h后離心，得沉 淀E;六、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀E和20份的注射用生理鹽水，將沉淀E與注射用生理 鹽水混合，然后用透析膜對注射用水透析24h，取固相產(chǎn)物，冷凍干燥后即得玉足海參糖胺 聚糖；其中步驟一、二、三、四和五中離心的轉(zhuǎn)速均為4000r/min，時間均為15min;步驟四 中醋酸-醋酸鈉緩沖液的pH值均為6。
本實施方式中所得玉足海參糖胺聚糖，質(zhì)量純度為95.58%，重均分子量為90000，能夠 用于制備注射劑。
具體實施方式
二十五本實施方式玉足海參糖胺聚糖的提取方法按以下步驟實現(xiàn)一、 按體積份數(shù)比稱取l份玉足海參粉、9份純化水、0.03份堿性蛋白酶、0.003份復(fù)合胰酶和1份 無水乙醇，將玉足海參粉與純化水混合，然后加入堿性蛋白酶，并在7(TC下酶解5h，再在90 。C下滅活15min，降溫至5(TC加入復(fù)合胰酶并酶解5h，然后在98。C下滅活15min，冷卻后離心 并調(diào)節(jié)pH值為3，在溫度為l(TC的條件下靜置20h后取上清液并調(diào)節(jié)pH值為7，再加入無水乙 醇，在溫度為10。C的條件下靜置20h后離心得沉淀A; 二、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀A、 25份純化水、2份可溶性鈣鹽和1份無水乙醇，將沉淀A與純化水混合，加熱至9(TC并調(diào)節(jié)pH 值為IO，然后加入可溶性鈣鹽并在10(TC下保溫25min，冷卻后離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為12 ，再離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為6. 5，然后加入無水乙醇，在溫度為10。C的條件下靜置20h后 離心得沉淀B;三、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀B和12份純化水，將沉淀B與純化水混合， 然后加入鉀鹽至鉀離子濃度達到2mol/L，在溫度為l(TC的條件下靜置20h后離心取沉淀用純
10化水溶解，再加入鉀鹽至鉀離子濃度達到2mol/L，在溫度為l(TC的條件下靜置20h后離心取 沉淀，依次用體積濃度為70%的乙醇和無水乙醇洗滌，得沉淀C;四、按體積份數(shù)比重新稱取 1份沉淀C、 60份濃度為0. 08mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液和l. 2份無水乙醇，將沉淀C與濃度為 0. 08mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液混合，然后用二乙氨乙基纖維素進行層析，再用濃度為 0. 4mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌，然后用濃度為l. Omol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫，收 集洗脫液進行紫外分光光度測試，選取吸收光波長為215nm的洗脫液，然后加入無水乙醇， 在溫度為l(TC的條件下靜置20h后離心，得沉淀D;五、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀D、 25 份的生理鹽水、0. 03份質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫和1. 2份無水乙醇，將沉淀D與生理鹽水混 合并調(diào)節(jié)pH值為12，然后加入質(zhì)量濃度為30%的過氧化氫，在7(TC下保溫6h，冷卻后離心取 上清液并調(diào)節(jié)pH值為7. 5，再加入無水乙醇，在溫度為l(TC的條件下靜置20h后離心，得沉淀 E;六、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀E和25份的注射用生理鹽水，將沉淀E與注射用生理鹽 水混合，然后用10000分子量滲透膜超濾截流，取固相產(chǎn)物，冷凍干燥后即得玉足海參糖胺 聚糖；其中步驟一、二、三、四和五中離心的轉(zhuǎn)速均為5000r/min，時間均為20min;步驟四 中醋酸-醋酸鈉緩沖液的pH值均為6。
本實施方式中所得玉足海參糖胺聚糖，質(zhì)量純度為96.31%，重均分子量為100000，能夠 用于制備注射劑。
權(quán)利要求
1.一種玉足海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在于玉足海參糖胺聚糖的提取方法按以下步驟實現(xiàn)一、按體積份數(shù)比稱取1份玉足海參粉、7～9份純化水、0.01～0.03份堿性蛋白酶、0.001～0.003份復(fù)合胰酶和0.6～1份無水乙醇，將玉足海參粉與純化水混合，然后加入堿性蛋白酶，并在60～70℃下酶解4～5h，再在80～90℃下滅活5～15min，降溫至50℃加入復(fù)合胰酶并酶解4～5h，然后在98～100℃下滅活5～15min，冷卻后離心并調(diào)節(jié)pH值為2～3，在溫度為0～10℃的條件下靜置15～20h后取上清液并調(diào)節(jié)pH值為6～7，再加入無水乙醇，在溫度為0～10℃的條件下靜置15～20h后離心得沉淀A；二、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀A、15～25份純化水、2份可溶性鈣鹽和0.6～1份無水乙醇，將沉淀A與純化水混合，加熱至80～90℃并調(diào)節(jié)pH值為8～10，然后加入可溶性鈣鹽并在90～100℃下保溫15～25min，冷卻后離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為10～12，再離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為5.5～6.5，然后加入無水乙醇，在溫度為0～10℃的條件下靜置15～20h后離心得沉淀B；三、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀B和6～12份純化水，將沉淀B與純化水混合，然后加入鉀鹽至鉀離子濃度達到2mol/L，在溫度為0～10℃的條件下靜置15～20h后離心取沉淀用純化水溶解，再加入鉀鹽至鉀離子濃度達到2mol/L，在溫度為0～10℃的條件下靜置15～20h后離心取沉淀，依次用體積濃度為70％的乙醇和無水乙醇洗滌，得沉淀C；四、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀C、40～60份濃度為0.02～0.08mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液和0.8～1.2份無水乙醇，將沉淀C與濃度為0.02～0.08mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液混合，然后用二乙氨乙基纖維素進行層析，再用濃度為0.4mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌，然后用濃度為1.0mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液進行紫外分光光度測試，選取吸收光波長為215nm的洗脫液，然后加入無水乙醇，在溫度為0～10℃的條件下靜置15～20h后離心，得沉淀D；五、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀D、15～25份的生理鹽水、0.01～0.03份質(zhì)量濃度為30％的過氧化氫和0.8～1.2份無水乙醇，將沉淀D與生理鹽水混合并調(diào)節(jié)pH值為10～12，然后加入質(zhì)量濃度為30％的過氧化氫，在60～70℃下保溫4～6h，冷卻后離心取上清液并調(diào)節(jié)pH值為6.5～7.5，再加入無水乙醇，在溫度為0～10℃的條件下靜置15～20h后離心，得沉淀E；六、按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀E和15～25份的注射用生理鹽水，將沉淀E與注射用生理鹽水混合，然后用透析膜對注射用水透析24h或者用10000分子量滲透膜超濾截流，取固相產(chǎn)物，冷凍干燥后即得玉足海參糖胺聚糖；其中步驟一、二、三、四和五中離心的轉(zhuǎn)速均為4000～5000r/min，時間均為15～20min；步驟四中醋酸醋酸鈉緩沖液的pH值均為6。
2 根據(jù)權(quán)利要求l所述的玉足海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在于 步驟一中按體積份數(shù)比稱取l份玉足海參粉、8份純化水、0.02份堿性蛋白酶、0.002份復(fù)合 胰酶和0.8份無水乙醇。
3 根據(jù)權(quán)利要求l所述的玉足海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在于 步驟一中按體積份數(shù)比稱取l份玉足海參粉、8.5份純化水、0.025份堿性蛋白酶、0.0025份 復(fù)合胰酶和O. 7份無水乙醇。
4 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的玉足海參糖胺聚糖的提取方法，其特征 在于步驟二中按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀A、 16 22份純化水和0. 6份無水乙醇。
5 根據(jù)權(quán)利要求4所述的玉足海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在于 步驟三中按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀B和8 1 O份純化水。
6 根據(jù)權(quán)利要求5所述的玉足海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在于 步驟三中按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀B和9份純化水。
7 根據(jù)權(quán)利要求6所述的玉足海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在于 步驟三和四中洗滌次數(shù)均為3 5次。
8 根據(jù)權(quán)利要求7所述的玉足海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在于 步驟四中按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀C、 45 55份濃度為0. 03 0. 07mol/L的醋酸-醋酸鈉 緩沖液和O. 9 1. l份無水乙醇。
9 根據(jù)權(quán)利要求8所述的玉足海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在于 步驟五中按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀D、 16 23份的生理鹽水、0. 015 0. 025份質(zhì)量濃度 為30%的過氧化氫和0. 9 1. l份無水乙醇。
10 根據(jù)權(quán)利要求9所述的玉足海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在 于步驟六中按體積份數(shù)比重新稱取1份沉淀E和16 24份的注射用生理鹽水。
全文摘要
一種玉足海參糖胺聚糖的提取方法，它涉及一種糖胺聚糖的提取方法。本發(fā)明解決了目前從玉足海參中提取的玉足海參糖胺聚糖質(zhì)量純度低，不能直接用于制成注射劑的問題。方法一、玉足海參粉與純化水混合，經(jīng)酶解和離心后得沉淀A；二、沉淀A與純化水混合，經(jīng)加熱、和離心后得沉淀B；三、沉淀B與純化水混合，離心取沉淀用純化水溶解，經(jīng)離心和洗滌得沉淀C；四、沉淀C與緩沖液混合，經(jīng)層析、洗滌、洗脫和離心后得沉淀D；五、沉淀D與生理鹽水混合，經(jīng)離心后得沉淀E；六、沉淀E與注射用水混合，透析或超濾截流后取固相產(chǎn)物，冷凍干燥后即得。本發(fā)明提取的玉足海參糖胺聚糖質(zhì)量純度高達93％～99％，能夠直接用于制備注射劑。
文檔編號C08B37/00GK101624426SQ20091030536
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者張彥廣, 王志國, 黃繼漢, 齊桂芳 申請人:黑龍江紅豆杉藥業(yè)有限責(zé)任公司