專利名稱：一種發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚谷氨酸的生產(chǎn)領(lǐng)域，具體是一種利用有機(jī)溶劑沉淀法提取發(fā)酵 液中聚谷氨酸的方法。
背景技術(shù)：
y -聚谷氨酸(Y -PGA，Polyglutamic acid)是一種由D_或L_谷氨酸通過(guò)a -氨 基和羧基形成谷氨酰鍵結(jié)合而成的陰離子聚合物。Y-PGA是一種水溶性可生物降 解的環(huán)境友好型多功能生物材料，具有可食用性、無(wú)毒性、成膜性、粘結(jié)性、保濕性等特點(diǎn)， 既可以作為藥物載體、增稠劑和保濕劑用于醫(yī)藥、食品和化妝品中，也可以作為保水劑及水 果、蔬菜的防凍劑、保鮮劑，也可以作為水處理的絮凝劑和重金屬螯合劑等，同時(shí)還是一種 新型的綠色環(huán)保塑料。Y-PGA產(chǎn)品價(jià)格昂貴，用途非常廣泛，需求空間巨大，而目前Y-PGA 產(chǎn)品的生產(chǎn)和供應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)需要。Y-PGA的合成方法主要有化學(xué)合成法、提取 法和微生物發(fā)酵法，前兩種方法由于自身的各種缺點(diǎn)不能得到廣泛應(yīng)用，目前生產(chǎn)Y-PGA 的主要方法是微生物發(fā)酵法。Y "PGA是一種由菌體分泌到胞外的多肽，通過(guò)液體發(fā)酵可 以得到含有大量產(chǎn)物的發(fā)酵液，從發(fā)酵液中提取產(chǎn)物的方法通常有化學(xué)沉淀法、有機(jī)溶劑 沉淀法，膜分離沉淀法。膜分離沉淀法的成本較大，而且工藝相對(duì)比較復(fù)雜，存在一定局限 性；化學(xué)沉淀法通常是利用無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行沉淀，在后續(xù)處理中脫鹽的步驟比較復(fù)雜，同時(shí)由于 Y-PGA分子內(nèi)含有大量的游離羧基，易于眾多無(wú)機(jī)鹽離子結(jié)合從而更一步增加了脫鹽的復(fù) 雜性，所以該法也存在一定局限性；有機(jī)溶劑沉淀法是普遍應(yīng)用的提取聚谷氨酸方法， 但是目前有機(jī)溶劑主要是乙醇，提取過(guò)程中乙醇的用量比較大，成本較高，且提取工藝比較 復(fù)雜，由于該法也存在一定的局限性，所以目前還沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)成本低廉、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)條件溫和的 聚谷氨酸提取方法本發(fā)明的技術(shù)方案一種發(fā)酵液中Y “聚谷氨酸的提取方法，其提取步驟如下(1)、發(fā)酵液的制備(a)、挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)接種于斜面培養(yǎng)基中，在恒溫 培養(yǎng)箱中35 40°C培養(yǎng)12小時(shí)，作為活化菌種；其中所述的斜面培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)成分如下蛋白胨l.Og，牛肉膏 0. 5g，NaCl 0. 5g，葡萄糖 0. lg，瓊脂 2. 0g，酵母粉0. 2g,蒸餾水 100ml，pH 7. 4 7. 5 ；(b)、將(a)活化后的菌種挑取一環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為180 220r/ min,35 40°C振蕩培養(yǎng)5 15小時(shí)作為種子液；其中所述的種子培養(yǎng)基成分如下
蔗糖10 15g，牛肉膏 2.0 1.8g，谷氨酸鈉 10 15g，MgS04*7H200. 10 0. 15g、 K2HP04 3H20 0. 4 0. 8g，水 300ml, pH 7. 0 7. 5 ；(c)、按4% 8%的接種量將(b)所得的種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn) 速為180 220r/min，35 40°C振蕩培養(yǎng)20 48小時(shí)得到含有產(chǎn)物的發(fā)酵液；其中所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下蔗糖15 25g，牛肉膏 2 6g，谷氨酸鈉 15 25g，MgS04 7H20 0. 10 0. 15g、 K2HP04 3H20 0. 5 1. 5g，水 500ml, pH 7. 0 7. 5 ;(2)、將步驟(1)中(c)所得的發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速為5000 12000r/min，離心時(shí)間 15 40min，取離心后的上清液，沉淀?xiàng)壢ィ?3)、將步驟(2)所得的上清液調(diào)pH2 3，然后加入一定量的預(yù)冷至4°C的異丙 醇，得上清液和異丙醇的混合物；其中異丙醇的加入量為上清液體積的1 4倍；(4)將步驟(3)所得的上清液和異丙醇的混合物在-18 20°C下靜置沉淀8 30h小時(shí)后，將靜置得到的沉淀混合物在轉(zhuǎn)速為3000 lOOOOr/min下離心5 lOmin，棄 去上清，得沉淀物；(5)、將步驟(4)所得的沉淀物在真空度為2. 5Pa下，進(jìn)行真空冷凍干24h得到 聚谷氨酸粗品；(6)、將步驟(5)所得的聚谷氨酸粗品用適量蒸餾水溶解，將所得溶液放入透 析袋中，用蒸餾水反復(fù)透析去除小分子和有機(jī)溶劑；(7)、將透析液用聚乙二醇濃縮，然后將濃縮液在真空度為2. 5Pa下，進(jìn)行真空冷 凍干48h即得聚谷氨酸純品。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用了經(jīng)典且常用的提取生物材料的方法——有機(jī)溶劑沉淀法提取發(fā)酵 液中的聚谷氨酸。目前提取聚谷氨酸的有機(jī)溶劑主要是乙醇，可是提取過(guò)程中乙 醇的用量比較大，而異丙醇作為沉淀劑其沉淀效果更好，而且其用量也相對(duì)較少。同時(shí)異丙 醇作為一種重要的化工原料，主要用于制藥、化妝品、塑料、香料、涂料及電子工業(yè)上用作脫 水劑及清洗劑，對(duì)其研究比較成熟，因?yàn)楫惐己退梢孕纬晒卜形?，利用間歇恒沸精餾法 從異丙醇水溶液中回收異丙醇已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化，這樣可以很大程度上減少聚谷氨酸 的生產(chǎn)成本。另外異丙醇的親水性不如乙醇強(qiáng)，在離心得到沉淀時(shí)離心條件可以相對(duì)較低， 從而工藝簡(jiǎn)化，并且從一定程度上減少能耗。本發(fā)明于現(xiàn)有技術(shù)相比，不僅降低了生產(chǎn)成本也簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌種選擇選擇枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis GIM1. 286)接種于斜面培養(yǎng)基 中，在恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)12小時(shí)，作為活化菌種。將活化后的菌種挑取一環(huán)接種于種 子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，37°C振蕩培養(yǎng)15小時(shí)作為種子液。按5%的接種量將 種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，37°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)得到含有產(chǎn) 物的發(fā)酵液。
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將發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心時(shí)間30min。取離心后的上清液，沉淀?xiàng)?去。上清液調(diào)PH2 3，然后一邊緩慢攪拌一邊加入2倍預(yù)冷異丙醇，將上述混合物在_18°C 下靜置數(shù)小時(shí)20h。將混合物離心，5000r/min，8min，棄去上清。沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥得到粗品。粗品用適量蒸餾水溶解，將所得溶液放入透析 袋中，用蒸餾水反復(fù)透析24小時(shí)，去除小分子和有機(jī)溶劑。將透析液用聚乙二醇濃縮，然后 將濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到純品，產(chǎn)量為13. 80g/L。其中培養(yǎng)基組分分別是斜面培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)蛋白胨l.Og，牛肉膏0. 5g，NaCl 0. 5g，葡萄糖0. lg，瓊 脂 2. 0g，酵母粉 0. 2g，蒸餾水 100ml, pH 7. 5 ；種子培養(yǎng)基蔗糖12g，牛肉膏2. 4g，谷氨酸鈉12g，MgS04 7H20 0. 12g、 K2HP04 3H20 0. 6g，水 300ml, pH 7. 5 ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖20g，牛肉膏4g，谷氨酸鈉20g，MgS04 7H20 0. 125g、 K2HP04 3H20 1. 0g，水 500ml, pH 7. 5。實(shí)施例2菌種選擇選擇枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis GIM1. 286)接種于斜面培養(yǎng)基 中，在恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)12小時(shí)，作為活化菌種。將活化后的菌種挑取一環(huán)接種于種 子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，37°C振蕩培養(yǎng)15小時(shí)作為種子液。按5%的接種量將 種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，37°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)得到含有產(chǎn) 物的發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心時(shí)間30min。取離心后的上清液，沉淀?xiàng)?去。上清液調(diào)PH2 3，然后一邊緩慢攪拌一邊加入4倍預(yù)冷異丙醇，將上述混合物在_5°C 下靜置數(shù)小時(shí)16h。將混合物離心，5000r/min，8min，棄去上清。沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥得到粗品。粗品用適量蒸餾水溶解，將所得溶液放入透析 袋中，用蒸餾水反復(fù)透析24小時(shí)，去除小分子和有機(jī)溶劑，將透析液用聚乙二醇濃縮，然后 將濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到純品，產(chǎn)量為19. 25g/L。其中培養(yǎng)基組分分別是斜面培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)蛋白胨l.Og，牛肉膏0. 5g，NaCl 0. 5g，葡萄糖0. lg，瓊 脂 2. 0g，酵母粉 0. 2g，蒸餾水 100ml, pH 7. 5 ；種子培養(yǎng)基蔗糖12g，牛肉膏2. 4g，谷氨酸鈉12g，MgS04 7H20 0. 12g、 K2HP04 3H20 0. 6g，水 300ml, pH 7. 5 ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖20g，牛肉膏4g，谷氨酸鈉20g，MgS04 7H20 0. 125g、 K2HP04 3H20 1. 0g，水 500ml, pH 7. 5。實(shí)施例3菌種選擇選擇枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis GIM1. 286)接種于斜面培養(yǎng)基 中，在恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)12小時(shí)，作為活化菌種。將活化后的菌種挑取一環(huán)接種于種 子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，37°C振蕩培養(yǎng)10小時(shí)作為種子液。按5%的接種量將 種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，37°C振蕩培養(yǎng)22小時(shí)得到含有產(chǎn) 物的發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心時(shí)間30min。取離心后的上清液，沉淀?xiàng)壢?。上清液調(diào)PH2 3，然后一邊緩慢攪拌一邊加入3倍預(yù)冷異丙醇，將上述混合物在15°C 下靜置數(shù)小時(shí)16h。將混合物離心，5000r/min，5min，棄去上清。沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥得到粗品。粗品用適量蒸餾水溶解，將所得溶液放入透析 袋中，用蒸餾水反復(fù)透析24小時(shí)，去除小分子和有機(jī)溶劑。將透析液用聚乙二醇濃縮，然后 將濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到純品，產(chǎn)量為18. 25g/L。其中培養(yǎng)基組分分別是斜面培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)蛋白胨l.Og，牛肉膏0. 5g，NaCl 0. 5g，葡萄糖0. lg，瓊 脂 2. 0g，酵母粉 0. 2g，蒸餾水 100ml, pH7. 5 ；種子培養(yǎng)基蔗糖12g，牛肉膏2. 4g，谷氨酸鈉12g，MgS04 7H20 0. 12g、 K2HP04 3H20 0. 6g，水 300ml, pH7. 5 ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖20g，牛肉膏4g，谷氨酸鈉20g，MgS04 7H20 0. 125g、 K2HP04 3H20 1. 0g，水 500ml, pH7. 5。實(shí)施例4菌種選擇選擇枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis GIM1. 286)接種于斜面培養(yǎng)基 中，在恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)12小時(shí)，作為活化菌種。將活化后的菌種挑取一環(huán)接種于種 子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，37°C振蕩培養(yǎng)15小時(shí)作為種子液。按5%的接種量將 種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，37°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)得到含有產(chǎn) 物的發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心時(shí)間30min。取離心后的上清液，沉淀?xiàng)?去。上清液調(diào)PH2 3，然后一邊緩慢攪拌一邊加入4倍預(yù)冷乙醇，將上述混合物在4°C下 靜置數(shù)小時(shí)24h。將混合物離心，5000r/min, lOmin,棄去上清。沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥得到粗品。粗品用適量蒸餾水溶解，將所得溶液放入透析 袋中，用蒸餾水反復(fù)透析24小時(shí)，去除小分子和有機(jī)溶劑。將透析液用聚乙二醇濃縮，然后 將濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到純品，產(chǎn)量為11. 60g/L。其中培養(yǎng)基組分分別是斜面培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)蛋白胨l.Og，牛肉膏0. 5g，NaCl 0. 5g，葡萄糖0. lg，瓊 脂 2. 0g，酵母粉 0. 2g，蒸餾水 100ml, pH 7. 5 ；種子培養(yǎng)基蔗糖12g，牛肉膏2. 4g，谷氨酸鈉12g，MgS04 7H20 0. 12g、 K2HP04 3H20 0. 6g，水 300ml, pH 7. 5 ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖20g，牛肉膏4g，谷氨酸鈉20g，MgS04 7H20 0. 125g、 K2HP04 3H20 1. 0g，水 500ml, pH 7. 5。以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說(shuō)明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所做的任 何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種發(fā)酵液中ν-聚谷氨酸的提取方法，其特征在于其提取方法包括如下步驟(1)、發(fā)酵液的制備(a)、挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)接種于斜面培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中35～40℃培養(yǎng)12小時(shí)，作為活化菌種；其中所述的斜面培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)成分如下蛋白胨1.0g，牛肉膏0.5g，NaCl 0.5g，葡萄糖0.1g，瓊脂2.0g，酵母粉0.2g，蒸餾水100ml，pH7.4～7.5；(b)、將(a)活化后的菌種挑取一環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為180～220r/min，35～40℃振蕩培養(yǎng)5～15小時(shí)作為種子液；其中所述的種子培養(yǎng)基成分如下蔗糖10～15g，牛肉膏2.0～1.8g，谷氨酸鈉10～15g，MgSO4·7H2O0.10～0.15g、K2HPO4·3H2O 0.4～0.8g，水300ml，pH7.0～7.5；(c)、按4％～8％的接種量將(b)所得的種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速為180～220r/min，35～40℃振蕩培養(yǎng)20～48小時(shí)得到含有產(chǎn)物的發(fā)酵液；其中所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下蔗糖15～25g，牛肉膏2～6g，谷氨酸鈉15～25g，MgSO4·7H2O 0.10～0.15g、K2HPO4·3H2O 0.5～1.5g，水500ml，pH7.0～7.5；(2)、將步驟(1)中(c)所得的發(fā)酵液離心，控制轉(zhuǎn)速為5000～12000r/min，離心時(shí)間15～40min，取離心后的上清液，沉淀?xiàng)壢ィ?3)、將步驟(2)所得的上清液調(diào)pH2～3，然后加入一定量的預(yù)冷至4℃的異丙醇，得上清液和異丙醇的混合物；其中異丙醇的加入量為上清液體積的1～4倍；(4)、將步驟(3)所得的上清液和異丙醇的混合物在-18～20℃下靜置沉淀8～30h小時(shí)后，將靜置得到的沉淀混合物在轉(zhuǎn)速為3000～10000r/min下離心5～10min，棄去上清，得沉淀物；(5)、將步驟(4)所得的沉淀物在真空度為2.5Pa下，進(jìn)行真空冷凍干24h得到γ-聚谷氨酸粗品；(6)、將步驟(5)所得的γ-聚谷氨酸粗品用適量蒸餾水溶解，將所得溶液放入透析袋中，用蒸餾水反復(fù)透析去除小分子和有機(jī)溶劑；(7)、將透析液用聚乙二醇濃縮，然后將濃縮液在真空度為2.5Pa下，進(jìn)行真空冷凍干48h即得γ-聚谷氨酸純品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸的提取方法，即菌種經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵后所得的發(fā)酵液離心，取上清液調(diào)pH2～3，然后加入異丙醇靜置沉淀后離心，所得的沉淀物進(jìn)行真空冷凍干后，用蒸餾水溶解，透析去除小分子和有機(jī)溶劑，再將透析液用聚乙二醇濃縮，然后將濃縮液真空冷凍干即得到γ-聚谷氨酸純品。本發(fā)明的提取方法由于采用異丙醇作為沉淀劑其沉淀效果好，而且用量相對(duì)較少，且異丙醇可回收反復(fù)利用，從而降低生產(chǎn)成本。另外異丙醇在離心得到沉淀時(shí)離心條件可以相對(duì)較低，從而工藝簡(jiǎn)化，并且從一定程度上減少能耗。
文檔編號(hào)C08G69/10GK101864073SQ20101018400
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者鞠蕾, 馬霞 申請(qǐng)人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院