專利名稱：一種交聯(lián)聚合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高分子聚合物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種交聯(lián)聚合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
基因治療是近年來(lái)新興的一種治療手段，通過(guò)將正常基因引入患者細(xì)胞內(nèi)，糾正 致病基因的缺陷從而達(dá)到治療遺傳疾病或癌癥的目的。在基因治療中，最關(guān)鍵的問(wèn)題是將 DNA轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞，然后進(jìn)入細(xì)胞核，最終實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。目前，最常用的介導(dǎo)基因 傳遞的載體是病毒類載體，如腺病毒載體、單純皰疹病毒載體等，但是，病毒類載體制備過(guò) 程復(fù)雜，成本較高，而且存在引起免疫反應(yīng)或基因突變的安全隱患，因此，制備方便、價(jià)格低 廉、無(wú)毒、無(wú)免疫反應(yīng)的非病毒類載體成為研究熱點(diǎn)之一。目前，現(xiàn)有技術(shù)公開了多種非病毒類載體，如脂質(zhì)體復(fù)合物、陽(yáng)離子聚合物等，其 中，陽(yáng)離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)由于具有電荷集中、對(duì)基因藥物的復(fù)合能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)， 在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。但是，低分子量的PEI基因傳遞效率低，而高 分子量的PEI雖然基因傳遞效率高，但細(xì)胞毒性較大、不可降解。聚乙二醇(PEG)是無(wú)毒無(wú)免疫原性的水溶性大分子，具有優(yōu)良的生物相容性，尤 其是分子量為4000以下的PEG能夠被機(jī)體迅速排出。研究發(fā)現(xiàn)，將PEG引入基因載體體系 中，能夠增強(qiáng)載體在體內(nèi)循環(huán)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。但是，PEG的反應(yīng)官能團(tuán)位于其分 子鏈段的兩端，不易與其他分子發(fā)生反應(yīng)。因此，本發(fā)明人考慮將小分子量的聚乙烯亞胺接枝在活化后的PEG上獲得分子量 較大且可降解的聚合物，該聚合物作為基因載體時(shí)，基因傳遞效率較高，細(xì)胞毒性較低。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種交聯(lián)聚合物及其制備方法， 本發(fā)明提供的交聯(lián)聚合物用作基因傳遞載體時(shí)，基因傳遞效率較高，細(xì)胞毒性較低。本發(fā)明提供了一種交聯(lián)聚合物，在其分子中至少具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元 和式(II)結(jié)構(gòu)的第二重復(fù)單元


Q為烷基或芳香基；
R1為分子量為100 2000的聚乙烯亞胺； 所述交聯(lián)聚合物的分子量為5000 100000。 優(yōu)選的，所述Q為式1)-式4)結(jié)構(gòu)中的任意一種 優(yōu)選的，所述R1為分子量為200 1000的聚乙烯亞胺
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的交聯(lián)聚合物至少具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元 和式(II)結(jié)構(gòu)的第二重復(fù)單元，其中，第一重復(fù)單元為交聯(lián)結(jié)構(gòu)單元，第二重復(fù)單元為小 分子量的PEI接枝結(jié)構(gòu)單元，這兩個(gè)重復(fù)單元使得本發(fā)明提供的交聯(lián)聚合物具有較大分子 量，從而提高了其基因傳遞效率。同時(shí)，該交聯(lián)聚合物主要由低細(xì)胞毒性的小分子量PEI和 具有良好生物相容性的聚乙二醇組成，細(xì)胞毒性較低。此外，該交聯(lián)聚合物具有氨酯結(jié)構(gòu)， 易于降解。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的交聯(lián)聚合物作為基因載體用于體外轉(zhuǎn)染時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率 比PEI25k高十倍甚至幾十倍。本發(fā)明還提供了一種交聯(lián)聚合物的制備方法，包括a)將聚乙二醇雙丙烯酸酯與氨基乙醇混合，在無(wú)水無(wú)氧條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)，得 到第一中間產(chǎn)物；b)將所述第一中間產(chǎn)物與二異氰酸酯混合，加熱至50°C 60°C反應(yīng)，得到第二中 間產(chǎn)物，所述第一中間產(chǎn)物上的羥基與二異氰酸酯的摩爾比為1 1.1 4;c)將所述第二中間產(chǎn)物加入到聚乙烯亞胺溶液中，進(jìn)行接枝反應(yīng)，得到分子量為 5000 100000的交聯(lián)聚合物，所述聚乙烯亞胺的分子量為100 2000。優(yōu)選的，所述聚乙二醇雙丙烯酸酯的分子量為150 1000。優(yōu)選的，所述二異氰酸酯為六次甲基二異氰酸酯、2，4-甲苯二異氰酸酯、2，6-甲 苯二異氰酸酯或4，4- 二苯基二異氰酸酯。優(yōu)選的，所述步驟a)中，反應(yīng)的溫度為0°C 50°C。優(yōu)選的，所述步驟a)中，反應(yīng)的時(shí)間為1天 5天。優(yōu)選的，所述步驟b)中，反應(yīng)的時(shí)間為5h 48h。優(yōu)選的，所述步驟C)具體為將所述第二中間產(chǎn)物加入聚乙烯亞胺溶液中，冰浴反應(yīng)6h 15h后，升溫至室溫 繼續(xù)反應(yīng)20h 30h，得到分子量為5000 100000的交聯(lián)聚合物。本發(fā)明首先使聚乙二醇雙丙烯酸酯與氨基乙醇發(fā)生聚合反應(yīng)，生成線型聚合物； 再用與所述線型聚合物上的羥基摩爾比為1.1 4 1的二異氰酸酯進(jìn)行交聯(lián)和活化，得 到具有活化官能團(tuán)的交聯(lián)聚合物；所述具有活化官能團(tuán)的交聯(lián)聚合物上的官能團(tuán)與小分子 量的PEI反應(yīng)，得到至少具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元和式(II)結(jié)構(gòu)的第二重復(fù)單元的 交聯(lián)聚合物。通過(guò)控制各反應(yīng)物的摩爾比和反應(yīng)條件，可以得到不同分子量的交聯(lián)聚合物， 從而滿足不同的使用要求。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中試劑濃度與細(xì)胞存活率的曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種交聯(lián)聚合物，在其分子中至少具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元 和式(II)結(jié)構(gòu)的第二重復(fù)單元

分子量。
意一種
(II)
其中，1 < η < 25 ；
Q為烷基或芳香基；
R1為分子量為100 2000的聚乙烯亞胺； 所述交聯(lián)聚合物的分子量為5000 100000。
按照本發(fā)明，所述第一重復(fù)單元為交聯(lián)結(jié)構(gòu)單元，使所述交聯(lián)聚合物具有較大的 在所述第一重復(fù)單元中，所述Q為烷基或芳香基，優(yōu)選為式1) _式4)結(jié)構(gòu)中的任 按照本發(fā)明，所述第二重復(fù)單元為接枝結(jié)構(gòu)單元，其中，R1為分子量為100 2000 的聚乙烯亞胺，優(yōu)選分子量為200 1000的聚乙烯亞胺。為了使所述交聯(lián)聚合物作為基因載體時(shí)具有更高的基因傳遞效率，本發(fā)明提供的 交聯(lián)聚合物的分子量為5000 100000，優(yōu)選為5000 60000。本發(fā)明還提供了一種交聯(lián)聚合物的制備方法，包括a)將聚乙二醇雙丙烯酸酯與氨基乙醇混合，在無(wú)水無(wú)氧條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)，得 到第一中間產(chǎn)物；b)將所述第一中間產(chǎn)物與二異氰酸酯混合，加熱至50°C 60°C反應(yīng)，得到第二中 間產(chǎn)物，所述第一中間產(chǎn)物上的羥基與二異氰酸酯的摩爾比為1 1.1 4;c)將所述第二中間產(chǎn)物加入到聚乙烯亞胺溶液中，進(jìn)行接枝反應(yīng)，得到分子量為 5000 100000的交聯(lián)聚合物，所述聚乙烯亞胺的分子量為100 2000。按照本發(fā)明，首先將聚乙二醇雙丙烯酸酯與氨基乙醇混合，在無(wú)水無(wú)氧條件下發(fā) 生聚合反應(yīng)，得到第一中間產(chǎn)物，該第一中間產(chǎn)物為線型結(jié)構(gòu)的氨酯類聚合物(L-PAE)，反
應(yīng)式如下 其中，1 < η < 25，1 <m< 20。分子量在4000以下的聚乙二醇能夠被機(jī)體迅 速排出而不產(chǎn)生任何毒副作用，因此，本發(fā)明使用的聚乙二醇雙丙烯酸酯的分子量?jī)?yōu)選為 150 1000，更優(yōu)選為200 800。按照本發(fā)明，所述聚乙二醇雙丙烯酸酯與氨基乙醇發(fā)生聚合反應(yīng)的過(guò)程如下分別將聚乙二醇雙丙烯酸酯與氨基乙醇溶解于有機(jī)溶劑中；將得到的溶液混合，使之發(fā)生聚合反應(yīng)。按照本發(fā)明，所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為氯仿、二氯甲烷或N，N-二甲基甲酰胺；所述聚 合反應(yīng)的反應(yīng)溫度優(yōu)選為0°c 50°C，更優(yōu)選為20°C 50°C ；所述聚合反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間優(yōu) 選為1天 5天。聚合反應(yīng)完成后，將得到的反應(yīng)混合物沖入石油醚或乙醚中沉淀，將沉淀干燥后， 得到線型結(jié)構(gòu)的第一中間產(chǎn)物(L-PAE)。 得到線型結(jié)構(gòu)的第-下步驟
中間產(chǎn)物后，使用二異氰酸酯進(jìn)行交聯(lián)和活化，具體包括以
將第一中間產(chǎn)物和二異氰酸酯分別溶解于有機(jī)溶劑中；然后將得到的溶液混合，使第一中間產(chǎn)物上的羥基和二異氰酸酯的摩爾比為 1 1. 1 4 ；將混合后的溶液加熱至50°C 60°C使第一中間產(chǎn)物和二異氰酸酯發(fā)生反應(yīng)，得 到第二中間產(chǎn)物。二異氰酸酯的結(jié)構(gòu)如式(IV)所示，含有兩個(gè)異氰酸官能團(tuán)，其中，部分二 異氰酸酯的兩個(gè)異氰酸官能團(tuán)均與第一中間產(chǎn)物的羥基發(fā)生反應(yīng)，發(fā)揮交聯(lián)劑的作用，得 到具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元；部分二異氰酸酯只有一個(gè)異氰酸官能團(tuán)與第一中間產(chǎn) 物的羥基發(fā)生反應(yīng)，得到具有式(III)結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元。由此，得到的第二中間產(chǎn)物為包括 式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元和式(III)結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元的交聯(lián)聚合物，即第二中間產(chǎn)物為 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的氨酯類聚合物(N-PAE)。 O = C = N-Q-N = C = O(IV)為了得到包含式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元和式(III)結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元的第二中間 產(chǎn)物，所述第一中間產(chǎn)物上的羥基和二異氰酸酯的摩爾比為1 1.1 4，優(yōu)選為1 1.5 3 ；所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為5h 48h，更優(yōu)選為IOh 30h，最優(yōu)選為20h 25h。按照本發(fā)明，所述二異氰酸酯優(yōu)選為六次甲基二異氰酸酯、2，4_甲苯二異氰酸酯、 2，6_甲苯二異氰酸酯或4，4_二苯基二異氰酸酯；所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為氯仿、二氯甲烷或N， N-二甲基甲酰胺。得到第二中間產(chǎn)物后，使第二中間產(chǎn)物與聚乙烯亞胺進(jìn)行接枝反應(yīng)，得到最終產(chǎn) 物，優(yōu)選包括以下步驟冰浴條件下，將第二中間產(chǎn)物加入到聚乙烯亞胺溶液中，冰浴反應(yīng)6h 15h后，升 溫至室溫繼續(xù)反應(yīng)20h 30h，得到反應(yīng)混合液；將所述反應(yīng)混合液在乙醚中沉降，將沉降固體溶解后超濾，冷凍干燥后，得到分子 量為5000 100000的交聯(lián)聚合物。在進(jìn)行接枝反應(yīng)時(shí)，首先在冰浴條件下反應(yīng)，目的是降低異氰酸基團(tuán)與PEI上的 氨基的反應(yīng)活性，使接枝反應(yīng)有效進(jìn)行而盡量避免PEI與第二中間產(chǎn)物發(fā)生交聯(lián)；然后在 室溫條件下反應(yīng)，使第二中間產(chǎn)物上的異氰酸酯基活性基團(tuán)全部發(fā)生反應(yīng)，提高反應(yīng)率和接枝率。在此過(guò)程中，聚乙烯亞胺與第二中間產(chǎn)物中式(III)結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元發(fā)生接枝反 應(yīng)，得到式(II)結(jié)構(gòu)的第二重復(fù)單元；而式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元不發(fā)生變化，由此，得 到至少包含式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元和式(II)結(jié)構(gòu)的第二重復(fù)單元的交聯(lián)聚合物，該交 聯(lián)聚合物為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚氨酯接枝聚乙烯亞胺的共聚物(N-PAE-g-PEI)。為了得到低細(xì)胞毒性的交聯(lián)聚合物，所述聚乙烯亞胺的分子量為100 2000，優(yōu) 選為200 1000。本發(fā)明對(duì)所述聚乙烯亞胺的結(jié)構(gòu)沒(méi)有特殊限制，可以為線型結(jié)構(gòu)的聚乙 烯亞胺，也可以為支化結(jié)構(gòu)的聚乙烯亞胺。本發(fā)明提供的交聯(lián)聚合物用作基因載體時(shí)，基因傳遞效率較高，細(xì)胞毒性較低，且 可降解，實(shí)驗(yàn)表明，將其用于體外轉(zhuǎn)染的基因載體時(shí)，轉(zhuǎn)染效率是PEI25k和商業(yè)化轉(zhuǎn)染試 劑LipOfectamineTM2000的十倍甚至幾十倍，同時(shí)表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的交聯(lián)聚合物及其制備方 法進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例1在無(wú)水無(wú)氧條件下，分別將0.61g氨基乙醇和分子量為258的聚乙二醇雙丙烯酸 酯(PEGDA)溶解于無(wú)水二氯甲烷中，其中PEGDA與氨基乙醇的摩爾比為1 1，得到氨基乙 醇二氯甲烷溶液和PEGDA 二氯甲烷溶液，將所述兩種溶液混合，50°C反應(yīng)1天后，在IOOOmL 乙醚中沉降，將固體干燥后得到淡黃色產(chǎn)物，所述淡黃色產(chǎn)物為線型結(jié)構(gòu)的聚氨酯L-PAE1， 用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果參見(jiàn)表1，表1為本發(fā)明實(shí)施例制備的L-PAE及其 分子量。實(shí)施例2使用與實(shí)施例1相同的原料和步驟進(jìn)行操作，但是反應(yīng)時(shí)間為3天，得到淡黃色產(chǎn) 物L(fēng)-PAE2，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果參見(jiàn)表1，表1為本發(fā)明實(shí)施例制備的 L-PAE及其分子量。實(shí)施例3使用與實(shí)施例1相同的原料和步驟進(jìn)行操作，但是反應(yīng)時(shí)間為5天，得到淡黃色產(chǎn) 物L(fēng)-PAE3，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果參見(jiàn)表1，表1為本發(fā)明實(shí)施例制備的 L-PAE及其分子量。實(shí)施例4使用與實(shí)施例1相同的條件和步驟進(jìn)行操作，但是原料為分子量為600的聚乙二 醇雙丙烯酸酯(PEGDA)，得到淡黃色產(chǎn)物L(fēng)-PAE4，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果 參見(jiàn)表1，表1為本發(fā)明實(shí)施例制備的L-PAE及其分子量。實(shí)施例5使用與實(shí)施例4相同的原料和步驟進(jìn)行操作，但是反應(yīng)時(shí)間為3天，得到淡黃色產(chǎn) 物L(fēng)-PAE5，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果參見(jiàn)表1，表1為本發(fā)明實(shí)施例制備的 L-PAE及其分子量。實(shí)施例6使用與實(shí)施例4相同的原料和步驟進(jìn)行操作，但是反應(yīng)時(shí)間為5天，得到淡黃色產(chǎn) 物L(fēng)-PAE6，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果參見(jiàn)表1，表1為本發(fā)明實(shí)施例制備的 實(shí)施例7取六次甲基二異氰酸酯和0. 5g實(shí)施例1制備的L-PAEl分別溶解于干燥的氯 仿中，得到L-PAEl氯仿溶液和六次甲基二異氰酸酯氯仿溶液，其中，L-PAEl中的羥基與 六次甲基二異氰酸酯的摩爾比為1 2;將所述兩種溶液混合，控制溶液中反應(yīng)物總濃度 為0. 05g/mL，50°C反應(yīng)24h，反應(yīng)完成后恢復(fù)到室溫，直接封存，得到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚氨酯 N-PAEl，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制備的N-PAE 及其分子量。實(shí)施例8使用與實(shí)施例7相同的原料和步驟進(jìn)行操作，但是將反應(yīng)物總濃度控制為0. Ig/ mL，得到N-PAE2，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制備 的N-PAE及其分子量。實(shí)施例9使用與實(shí)施例7相同的條件和步驟進(jìn)行操作，但是原料為甲苯二異氰酸酯，得到 N-PAE3，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制備的N-PAE 及其分子量。實(shí)施例10使用與實(shí)施例9相同的原料和步驟進(jìn)行操作，但是將反應(yīng)物總濃度控制為0. Ig/ mL，得到N-PAE4，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制備 的N-PAE及其分子量。實(shí)施例11使用與實(shí)施例7相同的條件和步驟進(jìn)行操作，但是原料為4，4' - 二苯基二異氰酸酯，得到N-PAE5，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制備的N-PAE及其分子量。實(shí)施例12使用與實(shí)施例11相同的原料和步驟進(jìn)行操作，但是將反應(yīng)物總濃度控制為0. Ig/ mL，得到N-PAE6，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制備 的N-PAE及其分子量。
實(shí)施例13使用與實(shí)施例7相同的條件和步驟進(jìn)行操作，但是原料為實(shí)施例4制備的L-PAE4， 得到N-PAE7，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制備的 N-PAE及其分子量。實(shí)施例14使用與實(shí)施例13相同的原料和步驟進(jìn)行操作，但是將反應(yīng)物總濃度控制為0. Ig/ mL，得到N-PAE8，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制備 的N-PAE及其分子量。實(shí)施例15使用與實(shí)施例9相同的條件和步驟進(jìn)行操作，但是原料為實(shí)施例4制備的L-PAE4， 得到N-PAE9，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制備的 N-PAE及其分子量。實(shí)施例16使用與實(shí)施例15相同的原料和步驟進(jìn)行操作，但是將反應(yīng)物總濃度控制為0. Ig/ mL，得到N-PAE10，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制 備的N-PAE及其分子量。實(shí)施例17使用與實(shí)施例11相同的條件和步驟進(jìn)行操作，但是原料為實(shí)施例4制備的 L-PAE4，得到N-PAE11，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施 例制備的N-PAE及其分子量。實(shí)施例18使用與實(shí)施例17相同的原料和步驟進(jìn)行操作，但是將反應(yīng)物總濃度控制為0. Ig/ mL，得到N-PAE12，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表2，表2為本發(fā)明實(shí)施例制 備的N-PAE及其分子量。表2本發(fā)明實(shí)施例制備的N-PAE及其分子量 實(shí)施例19無(wú)水無(wú)氧條件下，分別將實(shí)施例7制備的N-PAEl和分子量為423的線型聚乙烯亞 胺(線型PEI423)溶解于無(wú)水氯仿中，無(wú)水、無(wú)氧、冰浴條件下，將N-PAEl氯仿溶液滴加到 線型PEI423氯仿溶液中，冰浴反應(yīng)IOh后室溫反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用IOOOmL 乙醚沉降，將固體物質(zhì)溶解于水中后，用截留分子量為3500的超濾管超濾，然后凍干，得到 交聯(lián)聚合物，即網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚氨酯接枝聚乙烯亞胺的共聚物N-PAE-g-PEIl，用凝膠滲透色 譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表3，表3為本發(fā)明實(shí)施例制備的N-PAE-g-PEI及其分子量。實(shí)施例20使用與實(shí)施例19相同的條件和步驟進(jìn)行反應(yīng)，但是原料為分子量為600的支化聚 乙烯亞胺(支化PEI600)，得到N-PAE-g-PEI2，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn) 表3，表3為本發(fā)明實(shí)施例制備的N-PAE-g-PEI及其分子量。實(shí)施例21使用與實(shí)施例19相同的條件和步驟進(jìn)行反應(yīng)，但是原料為實(shí)施例8制備的 N-PAE2，得到N-PAE-g-PEI3，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表3，表3為本發(fā)明 實(shí)施例制備的N-PAE-g-PEI及其分子量。實(shí)施例22使用與實(shí)施例21相同的條件和步驟進(jìn)行反應(yīng)，但是原料為支化PEI600，得到 N-PAE-g-PEI4，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表3，表3為本發(fā)明實(shí)施例制備的 N-PAE-g-PEI及其分子量。實(shí)施例23使用與實(shí)施例19相同的條件和步驟進(jìn)行反應(yīng)，但是原料為實(shí)施例13制備的 N-PAE7，得到N-PAE-g-PEI5，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表3，表3為本發(fā)明 實(shí)施例制備的N-PAE-g-PEI及其分子量。實(shí)施例24使用與實(shí)施例23相同的條件和步驟進(jìn)行反應(yīng)，但是原料為支化PEI600，得到 N-PAE-g-PEI6，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表3，表3為本發(fā)明實(shí)施例制備的 N-PAE-g-PEI及其分子量。實(shí)施例25使用與實(shí)施例19相同的條件和步驟進(jìn)行反應(yīng)，但是原料為實(shí)施例14制備的 N-PAE8，得到N-PAE-g-PEI7，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表3，表3為本發(fā)明 實(shí)施例制備的N-PAE-g-PEI及其分子量。
實(shí)施例26使用與實(shí)施例25相同的條件和步驟進(jìn)行反應(yīng)，但是原料為支化PEI600，得到 N-PAE-g-PEI8，用凝膠滲透色譜(GPC)計(jì)算分子量，結(jié)果見(jiàn)表3，表3為本發(fā)明實(shí)施例制備的 N-PAE-g-PEI及其分子量。表3本發(fā)明實(shí)施例制備的N-PAE-g-PEI及其分子量。 實(shí)施例27本發(fā)明實(shí)施例19制備的N-PAE-g-PEI 1介導(dǎo)的熒光酶質(zhì)粒對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(HeLa 細(xì)胞)的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)27. IHeLa細(xì)胞的培養(yǎng)取HeLa細(xì)胞置于含體積百分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的培養(yǎng)基中，在37°C、含體積百 分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳的孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)。27. 2體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24h內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，將其用胰酶消化后置于達(dá)爾伯克改良 伊格爾培養(yǎng)基中稀釋，然后按每孔ι χ IO4個(gè)細(xì)胞的密度將HeLa細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板 中，置于37°C、含體積百分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80% 90% ；轉(zhuǎn)染時(shí)，吸棄培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，更換為200 μ L含體積百分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清 的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基，然后向培養(yǎng)基中加入復(fù)合物顆粒，繼續(xù)培養(yǎng)48h，所述復(fù)合 物顆粒由本發(fā)明實(shí)施例19制備的N-PAE-g-PEIl與熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)以氮磷比為15的 比例混合形成；轉(zhuǎn)染完畢后，取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，加入細(xì)胞裂 解液使細(xì)胞裂解，然后加入熒光素酶底物，用光度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，以每毫克蛋白的發(fā)光單 元數(shù)(TLU/mg Protein)表示，結(jié)果見(jiàn)表4，表4為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的不同基因載 體材料的轉(zhuǎn)染效率結(jié)果。實(shí)施例28采用與實(shí)施例27相同的條件和步驟進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，但是加入的復(fù)合物顆粒 是由本發(fā)明實(shí)施例20制備的N-PAE-g-PEI2與熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)以氮磷比為10的比例混合形成，其轉(zhuǎn)染效率參見(jiàn)表4，表4為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的不同基因載體材料的 轉(zhuǎn)染效率結(jié)果。實(shí)施例29采用與實(shí)施例27相同的條件和步驟進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，但是加入的復(fù)合物顆粒 是由本發(fā)明實(shí)施例21制備的N-PAE-g-PEI3與熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)以氮磷比為15的比例 混合形成，其轉(zhuǎn)染效率參見(jiàn)表4，表4為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的不同基因載體材料的 轉(zhuǎn)染效率結(jié)果。實(shí)施例30采用與實(shí)施例27相同的條件和步驟進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，但是加入的復(fù)合物顆粒 是由本發(fā)明實(shí)施例22制備的N-PAE-g-PEI4與熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)以氮磷比為10的比例 混合形成，其轉(zhuǎn)染效率參見(jiàn)表4，表4為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的不同基因載體材料的 轉(zhuǎn)染效率結(jié)果。實(shí)施例31采用與實(shí)施例27相同的條件和步驟進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，但是加入的復(fù)合物顆粒 是由本發(fā)明實(shí)施例26制備的N-PAE-g-PEI8與熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)以氮磷比為10的比例 混合形成，其轉(zhuǎn)染效率參見(jiàn)表4，表4為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的不同基因載體材料的 轉(zhuǎn)染效率結(jié)果。實(shí)施例32實(shí)施例19制備的N-PAE-g-PEIl的細(xì)胞毒性測(cè)試取HeLa細(xì)胞置于含體積百分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的培養(yǎng)基中，在37°C、含體積百 分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳的孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)。測(cè)試前24h內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，將其用胰酶消化后置于達(dá)爾伯克改良 伊格爾培養(yǎng)基中稀釋，然后按每孔ι χ IO4個(gè)細(xì)胞的密度將HeLa細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板 中，置于37°C、含體積百分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80% 90% ；將培養(yǎng)基分為8組，第一組中不加任何試劑繼續(xù)培養(yǎng)24h，其他7組中分別向培養(yǎng) 基中加入 10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL 禾口 70mg/mL 實(shí)施例 19 制 備的N-PAE-g-PEIl溶液與細(xì)胞共同培養(yǎng)24h ；向每組培養(yǎng)基中加入20 μ L含質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 5%的噻唑藍(lán)的磷酸鹽緩沖溶液， 37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸除培養(yǎng)基，加入200 μ L 二甲基亞砜溶解噻唑藍(lán)甲臜結(jié)晶IOmin后，用 酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)板各孔的吸收，重復(fù)測(cè)定三次，取平均值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，測(cè)試結(jié)果見(jiàn) 圖1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中試劑濃度與細(xì)胞存活率的曲線圖，其中， 曲線a是本發(fā)明實(shí)施例19制備的N-PAE-g-PEIl的濃度與細(xì)胞存活率曲線。其中，測(cè)試波 長(zhǎng)選用492nm，細(xì)胞存活率按照下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率(％) = (A樣品/Afie)*100%其中，A#s是N-PAE-g-PEIl溶液與細(xì)胞共同培養(yǎng)的細(xì)胞樣品孔的吸收；Ase是未添加試劑的細(xì)胞空白孔的吸收。實(shí)施例33按照實(shí)施例32的條件和步驟對(duì)實(shí)施例20制備的N-PAE-g_PEI2進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中試劑濃度與細(xì)胞存活率的曲線 圖，其中，曲線b是本發(fā)明實(shí)施例20制備的N-PAE-g-PEI2的濃度與細(xì)胞存活率曲線。實(shí)施例34按照實(shí)施例32的條件和步驟對(duì)實(shí)施例21制備的N-PAE-g_PEI3進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè) 試，結(jié)果見(jiàn)圖1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中試劑濃度與細(xì)胞存活率的曲線 圖，其中，曲線C是本發(fā)明實(shí)施例21制備的N-PAE-g-PEI3的濃度與細(xì)胞存活率曲線。實(shí)施例35按照實(shí)施例32的條件和步驟對(duì)實(shí)施例22制備的N_PAE-g_PEI4進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè) 試，結(jié)果見(jiàn)圖1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中試劑濃度與細(xì)胞存活率的曲線 圖，其中，曲線d是本發(fā)明實(shí)施例22制備的N-PAE-g-PEI4的濃度與細(xì)胞存活率曲線。實(shí)施例36按照實(shí)施例32的條件和步驟對(duì)實(shí)施例26制備的N_PAE-g_PEI8進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè) 試，結(jié)果見(jiàn)圖1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中試劑濃度與細(xì)胞存活率的曲線 圖，其中，曲線e是本發(fā)明實(shí)施例26制備的N-PAE-g-PEI8的濃度與細(xì)胞存活率曲線。比較例1采用與實(shí)施例27相同的條件和步驟進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，但是加入的復(fù)合物顆粒 是由分子量為25kDa的PEI (PEI25kDa)與熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)以氮磷比為10的比例混合 形成，其轉(zhuǎn)染效率參見(jiàn)表4，表4為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的不同基因載體材料的轉(zhuǎn)染 效率結(jié)果。比較例2采用與實(shí)施例27相同的條件和步驟進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，但是加入的復(fù)合物顆粒 是由商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑LipOfectamineTM2000與熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)混合形成，其轉(zhuǎn)染效率 參見(jiàn)表4，表4為本發(fā)明實(shí)施例及比較例提供的不同基因載體材料的轉(zhuǎn)染效率結(jié)果。表4本發(fā)明實(shí)施例提供的不同基因載體材料的轉(zhuǎn)染效率結(jié)果 由表4可知，本發(fā)明實(shí)施例提供的交聯(lián)聚合物N-PAE-g-PEI作為基因載體進(jìn)行體 外轉(zhuǎn)染時(shí)，轉(zhuǎn)染效率高于PEI作為載體和商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑LipOfectamineTM2000的轉(zhuǎn)染效率。比較例3按照實(shí)施例32的條件和步驟對(duì)分子量為25kDa的PEI (PEI25kDa)進(jìn)行細(xì)胞毒性 測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中試劑濃度與細(xì)胞存活率的曲 線圖，其中，曲線f是分子量為25kDa的PEI(PEI25kDa)的濃度與細(xì)胞存活率曲線。比較例4按照實(shí)施例32的條件和步驟對(duì)商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑LipOfeCtamineTM2000進(jìn)行細(xì)胞毒 性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖1，圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中試劑濃度與細(xì)胞存活率的 曲線圖，其中，曲線g是商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000的濃度與細(xì)胞存活率曲線。由圖1可知，本發(fā)明實(shí)施例提供的交聯(lián)聚合物的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PEI25kDa和商 業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000。以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì) 于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行 若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種交聯(lián)聚合物，在其分子中至少具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元和式(II)結(jié)構(gòu)的第二重復(fù)單元其中，1＜n＜25；Q為烷基或芳香基；R1為分子量為100～2000的聚乙烯亞胺；所述交聯(lián)聚合物的分子量為5000～100000。FSA00000178550200011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)聚合物，其特征在于，所述Q為式1)-式4)結(jié)構(gòu)中的任 意一種
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的交聯(lián)聚合物，其特征在于，所述R1為分子量為200 1000的 聚乙烯亞胺。
4.一種交聯(lián)聚合物的制備方法，包括a)將聚乙二醇雙丙烯酸酯與氨基乙醇混合，在無(wú)水無(wú)氧條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到第 一中間產(chǎn)物；b)將所述第一中間產(chǎn)物與二異氰酸酯混合，加熱至50°C 60°C反應(yīng)，得到第二中間產(chǎn) 物，所述第一中間產(chǎn)物上的羥基與二異氰酸酯的摩爾比為1 :1. 1 4 ；c)將所述第二中間產(chǎn)物加入到聚乙烯亞胺溶液中，進(jìn)行接枝反應(yīng)，得到分子量為 5000 100000的交聯(lián)聚合物，所述聚乙烯亞胺的分子量為100 2000。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述聚乙二醇雙丙烯酸酯的分子量 為 150 1000。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述二異氰酸酯為六次甲基二異氰 酸酯、2，4-甲苯二異氰酸酯、2，6-甲苯二異氰酸酯或4，4-二苯基二異氰酸酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟a)中，反應(yīng)的溫度為0°C 50 "C。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟a)中，反應(yīng)的時(shí)間為1天 5天。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟b)中，反應(yīng)的時(shí)間為5h 48h。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟c)具體為將所述第二中間產(chǎn)物加入聚乙烯亞胺溶液中，冰浴反應(yīng)6h 15h后，升溫至室溫繼續(xù) 反應(yīng)20h 30h，得到分子量為5000 100000的交聯(lián)聚合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種交聯(lián)聚合物，在其分子中至少具有式(I)結(jié)構(gòu)的第一重復(fù)單元和式(II)結(jié)構(gòu)的第二重復(fù)單元，其中，1＜n＜25；Q為烷基或芳香基；R1為分子量為100～2000的聚乙烯亞胺；所述交聯(lián)聚合物的分子量為5000～100000。本發(fā)明還提供了一種交聯(lián)聚合物的制備方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的交聯(lián)聚合物中的兩個(gè)重復(fù)單元使得本發(fā)明提供的交聯(lián)聚合物具有較大分子量，從而提高了其基因傳遞效率。同時(shí)，該兩個(gè)重復(fù)單元均具有較低的細(xì)胞毒性，因此，所述交聯(lián)聚合物細(xì)胞毒性較低。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的交聯(lián)聚合物作為基因載體用于體外轉(zhuǎn)染時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率比PEI25k高十倍甚至幾十倍。
文檔編號(hào)C08G73/04GK101880397SQ20101021566
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者夏加亮, 李非凡, 林琳, 田華雨, 郭兆培, 陳學(xué)思, 陳杰, 陳磊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所