專利名稱：定制的分子印跡聚合物(mip)單元的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子印跡聚合物(MIP)單元，所述分子印跡聚合物(MIP)單元具有包括至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)的表面，所述靶結(jié)合位點(diǎn)被配置為類似靶分子，以及涉及用于制備所述分子印跡聚合物(MIP)單元的方法。本發(fā)明還涉及MIP單元用于檢測(cè)溶液中的靶分子的用途。
背景技術(shù)：
近來，在全世界范圍內(nèi)對(duì)于監(jiān)測(cè)水質(zhì)的關(guān)注增長(zhǎng)。受到特別關(guān)注的領(lǐng)域是有害健康的化合物，如藥劑、殺蟲劑、毒素等向環(huán)境中的釋放。這些化合物可能持續(xù)存在于地下水以及人類所接觸的任何其它水中。對(duì)有害化合物的監(jiān)測(cè)是至關(guān)重要的，以確保人們所接觸的水是安全的并且不含可能導(dǎo)致健康問題的污染物。至今，存在數(shù)種檢測(cè)技術(shù)，但是因?yàn)槎喾N原因監(jiān)測(cè)水中的化學(xué)污染物是困難的。例如，很多化合物以非常低的濃度存在，這使得檢測(cè)困難。此外，檢測(cè)靈敏度經(jīng)常由于可能存在于環(huán)境濃縮物中的抑制性化合物而降低。結(jié)果，產(chǎn)生了很多假陽(yáng)性信號(hào)。當(dāng)前，在分子印跡聚合物(在下文稱作MIP)領(lǐng)域中的研究正在加速。由于MIP特異性識(shí)別化合物如藥物、激素、蛋白質(zhì)等的能力，它吸引了大量關(guān)注。分子印跡是一種通用技術(shù)，它將識(shí)別特性引入至合成聚合物中?？梢酝ㄟ^從官能單體的混合物在起模板作用的分析物的存在下合成高度交聯(lián)的聚合物來制造MIP。在用溶劑萃取出分析物之后，分子印跡留在聚合物中，它可以識(shí)別相同的模板分子或其類似物。MIP不像抗體那么特異，但是對(duì)于特異性靶標(biāo)擁有高親和性(例如，咖啡因或山梨糖醇，參見Feng，L.等，基于分子印跡的電合成聚合物用于測(cè)定山梨 Il 酉享白勺生物傳感器(Biosensor for the determination of sorbitol based on molecularly imprinted electrosynthesized polymers),生物傳感器 &生物電子學(xué) (Biosensors&Bioelectronics)，2004，19，1513-1519)，并且 MIP 通常對(duì)于類似的分子具有不可忽略的親和性(例如，針對(duì)青霉素G(PeniCillin G)制備的MIP不僅對(duì)于原始模板， 并且也對(duì)其它相關(guān)的β-內(nèi)酰胺抗生素顯示高親和性，參見Benito-Pena，Ε.等，用于分子印跡聚合物測(cè)定的熒光青霉素的分子工程(Molecular engineering of fluorescent penicillins for molecularly imprinted polymer assays), Anal. Chem.(化學(xué)年報(bào))， 2006，78，2019-2027)。取決于應(yīng)用，這可能是缺點(diǎn)，但是它也可能是優(yōu)點(diǎn)。例如，如果有人考慮將基于MIP 的傳感系統(tǒng)應(yīng)用于監(jiān)測(cè)環(huán)境污染物，例如，飲用水中的藥理學(xué)化合物，他不需要對(duì)于每種污染物制造不同的MIP，而僅需對(duì)每個(gè)污染物家族制造不同的MIP?，F(xiàn)行的檢測(cè)方案，如配合化學(xué)樣品處理的層析法或電泳法，以及基于固相的萃取例如經(jīng)由MIP是費(fèi)時(shí)的并且不適合用于野外或在野外處應(yīng)用。這些技術(shù)需要收集廢水樣品運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，在那里需要耗費(fèi)勞力的萃取和分析以檢測(cè)感興趣的靶化合物的存在。此外，目前可得的MIP檢測(cè)方案遇到很多假陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生的困難，特別是在通過非共價(jià)印跡制備MIP的情況下。從而，在本領(lǐng)域?qū)τ谔峁┯糜诟信d趣的靶分子，例如水中存在的污染物和其它環(huán)境濃縮物的檢測(cè)的替代方法存在需求。這種方法應(yīng)該是方便的、廉價(jià)的并且在相當(dāng)程度上避免假陽(yáng)性信號(hào)的產(chǎn)生。更具體地，這種方法應(yīng)該能夠在其實(shí)際環(huán)境中檢測(cè)靶分子；即在發(fā)現(xiàn)它們的環(huán)境中；例如地下水或廢水。發(fā)明概述 本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是滿足上述需求并提供能夠特異地并且選擇性地在其自然環(huán)境中檢測(cè)感興趣的靶分子的MIP單元。本發(fā)明的這個(gè)和其它目標(biāo)通過根據(jù)所附權(quán)利要求所述的分子印跡聚合物(MIP) 單元實(shí)現(xiàn)。因而，在第一方面本發(fā)明涉及一種分子印跡聚合物(MIP)單元，所述單元具有包括至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)和表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)的表面。靶結(jié)合位點(diǎn)被配置為類似感興趣的靶分子。表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)總量的至少80%位于至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)中，使得與靶分子的靜電相互作用能夠發(fā)生在所述位點(diǎn)中。本發(fā)明的MIP單元包括至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)，所述位點(diǎn)被配置為類似靶分子；即所述位點(diǎn)在其尺寸和形狀方面與感興趣的靶標(biāo)互補(bǔ)。存在數(shù)個(gè)因素影響靶標(biāo)與MIP單元之間相互作用。首先，靶結(jié)合位點(diǎn)的形狀和尺寸應(yīng)該匹配靶分子的形狀和尺寸。此外，疏水相互作用增強(qiáng)在靶結(jié)合位點(diǎn)中與靶分子的相互作用。因?yàn)榘蟹肿咏?jīng)常是帶電荷的實(shí)體，在靶分子要結(jié)合的位點(diǎn)中可帶電荷的基團(tuán)的存在允許在這些位點(diǎn)處能夠發(fā)生靜電相互作用，使得更進(jìn)一步提高了靶標(biāo)-聚合物相互作用。從而，需要將表面電荷；即存在的表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)，定位至靶結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)減少在非印跡位點(diǎn)處和MIP單元表面上的其它位點(diǎn)處存在的可帶電荷的基團(tuán)。在MIP的制備過程中，特別是通過非共價(jià)印跡方法，通常形成很多印跡位點(diǎn)。這些印跡位點(diǎn)中的一些是“假”靶結(jié)合位點(diǎn)，即在尺寸和形狀上不與感興趣的靶標(biāo)互補(bǔ)的印跡位點(diǎn)。歸因于在這種“假”位點(diǎn)上和還在MIP單元的表面的非印跡部分上的表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)的存在，靶分子仍能結(jié)合至該MIP單元，但導(dǎo)致高比例的假陽(yáng)性信號(hào)。這種非特異結(jié)合使得難以確定所吸附的分子是否真正是靶向的那一個(gè)。表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)典型地由印跡過程中所使用的官能單體的質(zhì)子化或去質(zhì)子化產(chǎn)生。在本發(fā)明的MIP單元中，表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)的總量的至少80%位于能夠使與靶分子的靜電相互作用在這樣的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)中發(fā)生的至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)中。典型地，表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)的總量的至少90%，例如至少95%位于這樣的靶結(jié)合位點(diǎn)中。從而，靶分子被結(jié)合在“正確的”印跡位點(diǎn)，即被配置為類似靶分子的靶結(jié)合位點(diǎn)并且因此減少了假陽(yáng)性信號(hào)的產(chǎn)生。因此，根據(jù)本發(fā)明的MIP單元是穩(wěn)定的、穩(wěn)健的和靶標(biāo)特異的。根據(jù)本發(fā)明的MIP單元可以以具有50nm至5 μ m范圍內(nèi)的直徑的粒子的形式存在?？梢愿鶕?jù)所使用的特異檢測(cè)技術(shù)而改變粒子的尺寸。尺寸小于50n m的粒子通常含有非常少的靶結(jié)合位點(diǎn)并且可能難以制備。根據(jù)本發(fā)明的MIP單元也可以是厚度在20nm至20 μ m范圍內(nèi)的膜的形式?？梢詫⑦@樣的膜應(yīng)用至例如叉指(interdigitated finger)形式的(微)電極。 在靶標(biāo)結(jié)合時(shí)，可以觀察并探測(cè)到電容的變化。厚度在上述范圍內(nèi)的膜是合適的。當(dāng)膜的厚度小于20nm時(shí)，所述膜可能由于聚合物表面相互作用而導(dǎo)致變形，例如由于聚合物鏈的釘扎(pinning)。相反，膜厚超過20 μ m 是不實(shí)用的，因?yàn)榘袠?biāo)向膜內(nèi)部的滲透比較慢，并且導(dǎo)致靶結(jié)合位點(diǎn)的占用減少。在備選實(shí)施方案中，MIP單元還包括選自包括以下各項(xiàng)的組的識(shí)別標(biāo)志(identity tag)熒光團(tuán)、量子點(diǎn)和金納米粒子。如果檢測(cè)在混濁樣品中進(jìn)行；即包含大量其它非印跡背景信號(hào)粒子的樣品，這些實(shí)施方案是適合使用的。在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)上面所述的MIP單元用于檢測(cè)溶液中靶分子的用途。因此，根據(jù)上面所述的至少一個(gè)MIP單元與可能包含感興趣的靶分子的溶液接觸。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這可以通過測(cè)量上述MIP單元在溶液中的團(tuán)聚速率來獲得。在根據(jù)本發(fā)明的MIP單元中，在給定pH下粒子的有效電荷狀態(tài)將主要可以通過印跡位點(diǎn)的數(shù)目來確定。這歸因于表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)在靶結(jié)合位點(diǎn)中的定位，而余下的粒子表面(即非印跡位點(diǎn)和非特異性印跡位點(diǎn))基本上保持不帶電荷。從而，在與靶分子結(jié)合時(shí)，MIP單元立即將具有接近于0的有效電荷Zrff。這對(duì)團(tuán)聚速率有影響，因?yàn)榛旧喜粠щ姾傻腗IP單元將開始聚集。因此可以使用團(tuán)聚速率作為所結(jié)合的靶分子的量的量度。使用團(tuán)聚檢測(cè)與MIP單元的結(jié)合事件本身是獨(dú)特的并且在數(shù)個(gè)方面優(yōu)于其它檢測(cè)方案。團(tuán)聚直接與結(jié)合事件相關(guān)。如果模板化合物沒有結(jié)合，MIP單元將不團(tuán)聚。如上所述，當(dāng)檢測(cè)在混濁樣品中進(jìn)行時(shí)，存在“干擾”粒子的數(shù)種信號(hào)，并且這些可能干擾本發(fā)明的MIP單元并且引起過度的聚集。在這樣的情況下，使用識(shí)別標(biāo)簽是高度有利的，例如熒光團(tuán)、量子點(diǎn)、金納米粒子以定位特異性結(jié)合事件。在備選的實(shí)施方案中，對(duì)溶液中靶分子的檢測(cè)可以通過測(cè)量MIP單元的凈有效電
荷Zeff進(jìn)行。如在上文中提到的，當(dāng)靶分子結(jié)合至本發(fā)明的MIP單元時(shí)，它們的凈有效電荷Zeff 將改變至接近于0的Zrff。從而，通過簡(jiǎn)單地測(cè)量Zrff，即使不發(fā)生任何團(tuán)聚，也能夠檢測(cè)到所感興趣的靶分子的存在?？梢允褂帽景l(fā)明的MIP單元在野外，即在通常會(huì)發(fā)現(xiàn)它們的環(huán)境中特異地并且選擇性地檢測(cè)所感興趣的靶分子。在再另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及制備具有上述特征的定制的MIP單元的方法。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)關(guān)于所論述的對(duì)靶標(biāo)的非特異結(jié)合改進(jìn)分子印跡的一個(gè)方法是，有效地封閉在MIP制備過程中形成的非特異性印跡位點(diǎn)。這可以通過減少在這些位點(diǎn)上以及在非印跡位點(diǎn)上存在的表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)，以使靶分子結(jié)合至“正確的”靶結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的方法包括(a)提供至少一個(gè)MIP單元，所述MIP單元具有包括至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)和表面 結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)的表面，所述靶結(jié)合位點(diǎn)被配置為類似靶分子，(b)使來自步驟(a)的一個(gè)或多個(gè)MIP單元在第一溶劑中與至少一個(gè)模板分子接觸，使得一個(gè)或多個(gè)模板分子結(jié)合至所述一個(gè)或多個(gè)MIP單元，(c)通過加入鈍化劑鈍化所述一個(gè)或多個(gè)MIP單元上的所述表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)，(d)通過在第二溶劑中沖洗移除所述一個(gè)或多個(gè)模板分子。鈍化劑通過在第二溶劑中的沖洗時(shí)保持穩(wěn)定的鍵結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)單元表面。從而，產(chǎn)生了主要在正確的一個(gè)或多個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)中的包含可帶電荷基團(tuán)的MIP 單元。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單、廉價(jià)并且使得能夠大量生產(chǎn)具有在靶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)定位的表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)的定制的MIP單元。MIP單元在第一溶劑中與模板分子接觸。在一些實(shí)施方案中，第一溶劑具有的PH 分別產(chǎn)生相反極性的表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)與一個(gè)或多個(gè)模板分子，使得模板分子可以通過靜電相互作用結(jié)合至該單元。從而，模板分子將特異性地(即在靶結(jié)合位點(diǎn)中)并且同時(shí)非特異性地結(jié)合在MIP單元表面上。從而在步驟(b)中形成了被模板分子占據(jù)的MIP 單元。為了移除在沒有被配置為類似感興趣的靶標(biāo)的位點(diǎn)處，以及在MIP單元表面上的非印跡位點(diǎn)處的非特異性結(jié)合，鈍化步驟，即步驟(c)包括-移除沒有特異性地結(jié)合至被配置為類似靶分子的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)模板分子，以使表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)暴露在所述表面上，-在鈍化劑與表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)之間形成穩(wěn)定的鍵。鈍化劑將與非特異性地結(jié)合至表面的模板分子競(jìng)爭(zhēng)，以使這些分子在與鈍化劑的接觸中被移除。然而，將不移除在正確的靶結(jié)合位點(diǎn)中結(jié)合的模板分子，因?yàn)樵谟捎谠谶@些空穴中的尺寸和形狀的互補(bǔ)性、靜電相互作用和疏水相互作用它們保持結(jié)合。在加入鈍化劑時(shí)，表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)變得暴露在MIP單元的表面上。鈍化劑能夠與這些暴露的表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)形成未定的鍵并且這些鍵即使在用第二溶劑沖洗而洗脫模板之后仍保持對(duì)水解穩(wěn)定。例如，這樣的鍵可以選自酯鍵和酰胺鍵的組。通常在模板和交聯(lián)劑的存在下聚合官能單體典型地提供具有包括至少一個(gè)被配置為類似靶分子的靶結(jié)合位點(diǎn)的MIP單元。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以在第一溶劑中通過在一個(gè)或多個(gè)模板分子的存在下聚合官能單體同時(shí)進(jìn)行步驟(a)和步驟(b)。在這種情況下，當(dāng)官能單體在第一溶劑中并且在模板分子的存在下聚合時(shí)，形成了 MIP單元。在一些實(shí)施方案中，官能單體是甲基丙烯酸官能單體，例如甲基丙烯酸。這種單體是合適的因?yàn)樗鼈兊聂然瞧胀ǖ臍滏I結(jié)合并且是分子印跡中的酸性官能團(tuán)。如果使用甲基丙烯酸單體，模板化合物可以選自以下各項(xiàng)的組β阻滯藥，例如普萘洛爾和倍他洛爾。與上述單體和β阻滯藥一起使用的合適的鈍化劑是重氮甲烷、苯基重氮甲烷和酰鹵。本發(fā)明的這些和其它方面從下文描述的實(shí)施方案將變得顯而易見來，并將參考所述實(shí)施方案進(jìn)行闡述。附圖簡(jiǎn)述

圖1圖解了用于分子非共價(jià)印跡的一般方法。圖2圖解了根據(jù)本發(fā)明的MIP單元。圖3圖解了 ρΗ對(duì)團(tuán)聚速率的依賴性。圖4圖解了本發(fā)明的MIP單元的團(tuán)聚速率以及在團(tuán)聚之后超聲波處理的作用。圖5圖解了在非印跡聚合物(NIP)單元的情況下缺少團(tuán)聚。圖6a圖解了當(dāng)使用不同濃度的普萘洛爾作為靶分子時(shí)的團(tuán)聚速率。圖6b圖解了當(dāng)使用不同濃度的倍他洛爾作為靶分子時(shí)的團(tuán)聚速率。圖7顯示了本發(fā)明的MIP單元區(qū)分不同手性的靶分子的能力。圖8圖解了測(cè)量團(tuán)聚速率的靜態(tài)光散射方法。發(fā)明詳述在圖1中，描述了非共價(jià)印跡的一般方法步驟。官能單體100與至少一個(gè)模板分子101混合，所述模板分子101類似至少一個(gè)感興趣的靶分子?？梢允褂媒宦?lián)劑102控制聚合物基質(zhì)的形態(tài)、穩(wěn)定結(jié)合位點(diǎn)并且提供機(jī)械穩(wěn)定性。合適的交聯(lián)劑取決于用于印跡的單體，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。官能單體100基于非共價(jià)相互作用，如氫鍵、離子鍵和疏水相互作用將其自身排列在模板分子101周圍。在聚合之后，將模板分子101通過在溶劑中沖洗而洗脫，并將分子印跡103留在聚合物中，所述印跡能夠識(shí)別相同的模板分子101或其類似物。從而，所得到的印跡聚合物擁有對(duì)于模板分子103永久的“記憶”，能夠使MIP結(jié)合與模板密切相關(guān)的靶標(biāo)化合物。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)特異性隨著聚合物與靶標(biāo)上的結(jié)合“中心”之間鍵的數(shù)目增力口。這可以用模板分子101不同側(cè)面的不同形狀來說明。非共價(jià)印跡方法是有吸引力的，因?yàn)樗?jiǎn)單并且可以應(yīng)用于大數(shù)量的模板。此外， 可以在溫和條件下容易地將模板從聚合物移除。然而，非共價(jià)印跡帶有的一個(gè)缺點(diǎn)是產(chǎn)生這樣的印跡位點(diǎn)，所述印跡位點(diǎn)可能充當(dāng)“假”靶結(jié)合位點(diǎn)并結(jié)合靶分子的印跡位點(diǎn)，盡管在尺寸和形狀上并不互補(bǔ)。這種非特異性結(jié)合使得難以確定所吸附的分子是否真正是被靶向的那一個(gè)。假陽(yáng)性信號(hào)的產(chǎn)生(至少部分地)取決于MIP單元上表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)的存在。這種表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)在溶液中容易變得帶電荷并且靜電吸引極性相反的靶標(biāo)化合物。從而，需要將表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)定位至MIP單元上正確的靶結(jié)合位點(diǎn)；即被配置為類似所感興趣的靶分子的位點(diǎn)。這樣，增強(qiáng)了 MIP-靶標(biāo)相互作用并且MIP單元變得更有選擇性。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“(多個(gè))可帶電荷的基團(tuán)”意指當(dāng)遇到分別導(dǎo)致官能團(tuán)的去質(zhì)子化或質(zhì)子化的溶劑或緩沖溶液時(shí)，成為帶電荷基團(tuán)的官能團(tuán)。
這種可帶電荷官能團(tuán)的實(shí)例是羧基和氨基。圖2中圖解了根據(jù)本發(fā)明的MIP粒子200。MIP粒子200具有包括至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)202和表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)203的表面201。在該情況下，可帶電荷基團(tuán)是可帶負(fù)電荷基團(tuán)。靶結(jié)合位點(diǎn)202被配置為類似靶分子204。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“被配置為類似靶分子”意指靶結(jié)合位點(diǎn)基本上在尺寸和形狀上與感興趣的靶分子互補(bǔ)。從而，靶結(jié)合位點(diǎn)可以結(jié)合與印跡過程中所使用的模板分子相同的模板分子或者與使用的模板密切相關(guān)的靶標(biāo)化合物。表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)203的總量的至少80%位于至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)202 中，使得與靶分子的靜電相互作用發(fā)生在所述位點(diǎn)202中。通常在非共價(jià)印跡過程中，形成非特異性的，即與感興趣的靶標(biāo)在尺寸和形狀上不互補(bǔ)的印跡位點(diǎn)205。表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)203在這些位點(diǎn)以及在非印跡位點(diǎn)上的存在可以導(dǎo)致由于與靶分子的非特異性相互作用引起的假陽(yáng)性結(jié)合信號(hào)。因此需要將存在的表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)203集中至一個(gè)或多個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn) 202，所述靶結(jié)合位點(diǎn)202被配置為類似感興趣的靶標(biāo)。在根據(jù)本發(fā)明的MIP粒子中，表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)203的總量的至少80%，優(yōu)選地至少90%，例如至少95%位于至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)202中。從而，增強(qiáng)了與靶分子的相互作用，并且這是在這種位點(diǎn)202中在形狀和尺寸兩者上的相似性、靜電相互作用和疏水相互作用的結(jié)果。在非印跡部分和不擁有靶結(jié)合位點(diǎn)202的選擇性特性的印跡位點(diǎn)205上少量存在的表面可帶電荷基團(tuán)203將不會(huì)在相當(dāng)程度上被靶分子所占據(jù)。從而，提高了本發(fā)明的MIP 粒子200的檢測(cè)靈敏度并且減少了假信號(hào)的產(chǎn)生。應(yīng)該注意可帶電荷基團(tuán)也可以在該粒子內(nèi)部存在；即在聚合網(wǎng)絡(luò)的孔中，但是這些通常不易接近靶分子。根據(jù)本發(fā)明的MIP單元可以是粒子或膜的形式。MIP粒子可以以任意形狀存在，但是通常是直徑為至多1(^111，例如直徑在5011111至 5 μ m的范圍內(nèi)，例如在50nm至1，5 μ m的范圍內(nèi)的球形。粒子的尺寸可以根據(jù)所使用的特異性檢測(cè)技術(shù)而變化。如果檢測(cè)技術(shù)需要粒子在水中混沌地移動(dòng)，如光子相關(guān)光譜法所需要的，那么重要的是粒子不沉淀。在上述直徑范圍內(nèi)的粒子即使在數(shù)小時(shí)之后也不沉淀。 此外，具有低于50nm尺寸的粒子通常含有非常少的靶結(jié)合位點(diǎn)(對(duì)于低分子量模板分子，靶結(jié)合位點(diǎn)與聚合物的重量的重量比大約在1 1000至1 100的范圍內(nèi))并且通常難以制備。根據(jù)本發(fā)明MIP單元也可以是厚度在20nm至20 μ m范圍內(nèi)的膜?？梢詫⑦@樣的膜應(yīng)用至例如叉指形式的(微)電極。在靶標(biāo)結(jié)合時(shí)，可以觀察并檢測(cè)到電容的變化。公知的是電容改變或者與固定的電荷變化或者與固定的偶極矩變化有關(guān)。在本發(fā)明的情況下，靶標(biāo)結(jié)合將導(dǎo)致電荷數(shù)的降低并且從而，印跡膜的電容將改變。厚度在上述范圍內(nèi)的膜是合適的。當(dāng)膜的厚度小于20nm時(shí)，該膜可能由于聚合物表面相互作用而導(dǎo)致變形，例如由于聚合物鏈的釘扎導(dǎo)致。相反，膜厚超過20 μ m是不實(shí)用的，因?yàn)榘袠?biāo)向膜內(nèi)部的滲透比較慢，并且導(dǎo)致靶結(jié)合位點(diǎn)的占用減少。在備選實(shí)施方案中，MIP單元還包括選自包括以下各項(xiàng)的組的識(shí)別標(biāo)志熒光團(tuán)、 量子點(diǎn)和金納米粒子(沒有顯示)。如果檢測(cè)在混濁樣品中進(jìn)行，即包含大量背景信號(hào)粒子的樣品，這些實(shí)施方案是適合使用的。在又另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)上面所述的MIP單元用于檢測(cè)溶液中靶分子的用途。該檢測(cè)可以是定性的或定量的；即本發(fā)明不僅能夠測(cè)定感興趣的靶分子的存在， 也能測(cè)定溶液中靶分子的濃度。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這可以通過測(cè)量溶液中的上述MIP單元的團(tuán)聚速率來實(shí)現(xiàn)。決定膠體溶液穩(wěn)定性的主要物理和化學(xué)參數(shù)是公知的(參見，例如Robert J. Hunter,膠體禾斗學(xué)基石出(Foundations of colloid Science), vol. I, Clarendon Press, 1995，ISBN 0 19 855187 8)并且將僅簡(jiǎn)要描述。膠體溶液中納米或微米粒子由于與流體分子的相互作用而混沌地移動(dòng)(所謂的布朗運(yùn)動(dòng)(Brownian motion))。布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致粒子之間的碰撞。粒子間會(huì)遇率(intra particle encounter rate)(碰撞的頻率)隨粒子濃度的增加而增加但是隨粒子尺寸的增加而降低。在這種碰撞的過程中粒子之間的距離隨有效離子電荷的減少并隨溶液離子強(qiáng)度的增加而降低。在碰撞過程中粒子彼此越接近，它們將彼此結(jié)合的可能性越高。在這樣的碰撞過程中，如果粒子彼此結(jié)合，它們保持結(jié)合一段時(shí)間，在那之后它們可能再次分開。如果它們結(jié)合在一起的時(shí)間短于之后用于再次相遇的時(shí)間，懸浮液將是穩(wěn)定的。然而如果兩個(gè)納米粒子保持彼此結(jié)合的時(shí)間足夠長(zhǎng)，那么下一個(gè)粒子可能與這個(gè)小團(tuán)簇碰撞，并與其結(jié)合。團(tuán)簇將因此生長(zhǎng)，即，懸浮液中的粒子將團(tuán)聚，并且該膠體溶液將變得不穩(wěn)定。因而，團(tuán)聚速率取決于粒子彼此結(jié)合的強(qiáng)度以及會(huì)遇率。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)結(jié)合強(qiáng)度和會(huì)遇率極大地取決于MIP單元的靶結(jié)合位點(diǎn)的電荷以及模板分子的電荷。當(dāng)靶分子與MIP極性相反時(shí)，吸附顯著地增強(qiáng)并且包含結(jié)合了的靶分子的MIP單元將被中和。這使得基本上不帶電荷的MIP粒子由于接近的粒子間締合的更高概率而開始團(tuán)聚。也可以通過改變用于進(jìn)行團(tuán)聚的溶液的pH來控制團(tuán)聚速率。如圖3中所示，團(tuán)聚的開始是與pH依賴性的?？梢赃x擇pH以使由于在這些位點(diǎn)中存在的官能單體殘基的去質(zhì)子化或質(zhì)子化導(dǎo)致在一個(gè)或多個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)中形成可帶電荷基團(tuán)。同時(shí)(Simulateneously)，模板分子在這個(gè)pH下應(yīng)該質(zhì)子化或去質(zhì)子化以使模板分子的極性與結(jié)合位點(diǎn)的極性相反。在圖3中，使用普萘洛爾作為模板并且MIP單元，即MIP粒子由甲基丙烯酸形成， 即可帶電荷基團(tuán)表現(xiàn)為羧基。因?yàn)轸然腜Ka大約為4并且普萘洛爾的pKa大約為9，這兩個(gè)實(shí)體在大約6的pH下都將帶電荷；即羧基將去質(zhì)子化，并且普萘洛爾將質(zhì)子化。從而，由于靶分子的吸附而發(fā)生團(tuán)聚。
在足夠高的pH(圖3中的pH 12)MAA完全去質(zhì)子化并且?guī)в胸?fù)電荷。這使得MIP 粒子彼此排斥形成穩(wěn)定的膠體溶液。同時(shí)，在pH 12下普萘洛爾作為中性化合物存在，因此對(duì)帶負(fù)電荷的MIP粒子結(jié)合位點(diǎn)具有低結(jié)合強(qiáng)度。整體作用是不管普萘洛爾在樣品中存在還是不存在，粒子將不會(huì)團(tuán)聚。在低pH(圖3中的pH 2.5)下，因?yàn)镸AA的羧基質(zhì)子化而導(dǎo)致不帶凈電荷，MIP粒子是中性的。該中性粒子不結(jié)合普萘洛爾，即使后者帶有凈正電荷。從而，在pH 2. 5和pH 12下，MIP粒子的靶結(jié)合位點(diǎn)與靶標(biāo)化合物之間沒有靜電相互作用存在，并且因此沒有團(tuán)聚發(fā)生。然而，如在pH 6.0下可以觀察到的，團(tuán)聚速率是相當(dāng)快的，因?yàn)镸IP粒子的靶結(jié)合位點(diǎn)和靶標(biāo)化合物兩者都帶電荷。靶標(biāo)化合物的吸附增強(qiáng)并且這可以通過團(tuán)聚而被檢測(cè)到。因此，可能將團(tuán)聚的開始作為靶標(biāo)攝取的函數(shù)來調(diào)節(jié)，并且可以在相對(duì)少量的靶標(biāo)攝取下實(shí)現(xiàn)對(duì)團(tuán)聚的誘導(dǎo)。這使得能夠?qū)z測(cè)限推進(jìn)到更低的靶標(biāo)濃度。在根據(jù)本發(fā)明的MIP單元中，在給定PH下該單元的有效電荷狀態(tài)將主要由靶結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量決定。這是由于靶結(jié)合位點(diǎn)中表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)的定位所導(dǎo)致的，而剩下的粒子表面(即非印跡位點(diǎn)和非特異性印跡位點(diǎn))保持基本不帶電荷。從而，在與靶分子結(jié)合時(shí)，MIP單元將具有接近于0的凈有效電荷Zeff。這對(duì)于團(tuán)聚速率有影響，因?yàn)榛旧喜粠щ姾傻腗IP粒子將開始聚集。因此，可以通過簡(jiǎn)單地測(cè)量一個(gè)或多個(gè)MIP單元的凈有效電荷Zrff ■靶分子的吸附。當(dāng)Zrff下降或增加時(shí)(取決于帶電荷基團(tuán)的極性)，這可能是已經(jīng)吸附了靶分子的指示。例如可以通過監(jiān)測(cè)Z電位檢測(cè)凈有效電荷。當(dāng)MIP單元是膜或者溶液中懸浮的粒子時(shí)，這個(gè)檢測(cè)方案是合適的。當(dāng)可以測(cè)定靶分子和MIP單元的電荷狀態(tài)時(shí)，可能選擇其中使兩者都帶電荷的pH 區(qū)間，以便測(cè)定團(tuán)聚速率或Zrff的變化。圖4中進(jìn)一步圖解了團(tuán)聚的誘導(dǎo)。這里，0. 2mg/ml濃度下的MIP單元，即MIP粒子暴露至1. 25mM濃度下的R-普萘洛爾并且聚集的MIP粒子尺寸的變化是顯著的。當(dāng)粒子達(dá)到1200nm的尺寸時(shí)，對(duì)它們進(jìn)行超聲處理約45分鐘。在超聲處理之后， 重復(fù)試驗(yàn)并觀察到相同的團(tuán)聚模式(由圖4中的三角形曲線圖解)。這證明本發(fā)明的MIP 粒子是可再現(xiàn)的并且可以用可控的方式監(jiān)測(cè)。相反，非印跡粒子和模板分子(圖5)接觸基本上不團(tuán)聚。在MIP單元制備過程中使用的模板分子可以選自包括以下各項(xiàng)的組藥品、激素、 酶、抗體、受體、核酸、病毒、細(xì)胞、組織、殺蟲劑和包括蛋白質(zhì)的任意其它材料。通常使用β阻滯藥，特別是普萘洛爾和倍他洛爾作為在印跡過程中的模板分子。本發(fā)明人已經(jīng)測(cè)定在不同的普萘洛爾和倍他洛爾濃度下的團(tuán)聚速率。如圖6a和6b中所示，將0. 02mg/ml濃度的MIP單元，即MIP粒子暴露在不同的 (S)-普萘洛爾濃度下，并且在更高的普萘洛爾和倍他洛爾濃度下團(tuán)聚速率顯著增加。β阻滯藥，例如普萘洛爾或倍他洛爾的濃度典型在0. 05至2. 5mM的范圍內(nèi)。至多達(dá)0. 2mg/ml的濃度下的MIP粒子適合用于團(tuán)聚測(cè)定。也可以將本發(fā)明的MIP單元設(shè)計(jì)為評(píng)估印跡聚合物的手性。這不是一個(gè)普通的任務(wù)，它經(jīng)常需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)。在吸附正確手性的靶分子時(shí)，本發(fā)明的MIP粒子開始團(tuán)聚，但是將不吸附“錯(cuò)誤” 手性的靶標(biāo)，并且因此將不會(huì)發(fā)生團(tuán)聚。這在圖7中闡明，其中0. 02mg/ml濃度的MIP單元， 即MIP粒子分別暴露于(S)-普萘洛爾和(r)_普萘洛爾，并且僅有(S)-普萘洛爾由MIP粒子所吸附。即使在低模板分子濃度(在這個(gè)具體實(shí)施例中為0.025mM)下這也會(huì)發(fā)生。在高分析物濃度下該性質(zhì)消失，因?yàn)榇嬖诖罅康摹暗唾|(zhì)量”印跡位點(diǎn)并且這些位點(diǎn)不擁有手性識(shí)別能力。通過簡(jiǎn)單地改變分析物的濃度區(qū)分手性與非手性位點(diǎn)的能力簡(jiǎn)化了印跡優(yōu)化。這也使得人們能夠簡(jiǎn)單地評(píng)價(jià)藥品的分離質(zhì)量，其中這種性質(zhì)極為重要?？梢酝ㄟ^例如光子相關(guān)光譜(PCS)和靜態(tài)光散射監(jiān)測(cè)團(tuán)聚速率。當(dāng)本發(fā)明的MIP單元包含識(shí)別標(biāo)志時(shí)，這些MIP單元可能發(fā)熒光并且發(fā)出光，并且當(dāng)團(tuán)聚體生長(zhǎng)時(shí)，所發(fā)射的光強(qiáng)，即團(tuán)聚體點(diǎn)，變得更亮。這種識(shí)別標(biāo)志也可以幫助在懸浮液中將MIP粒子與其它粒子區(qū)分開，例如在Z電位測(cè)量過程中。Z電位測(cè)量也可以適合于更大MIP粒子的檢測(cè)，以及當(dāng)MIP單元是膜的形式時(shí)。應(yīng)該注意可以將本發(fā)明的MIP單元，以及作為用于測(cè)量靶標(biāo)吸附的手段的團(tuán)聚速率，應(yīng)用于很多情況；即它在任何情況下都不限定于廢水污染物的檢測(cè)。本發(fā)明人也已經(jīng)開發(fā)了一種用于制備具有上述特征的定制的MIP單元的方法。這個(gè)方法包括(a)提供至少一個(gè)MIP單元，所述MIP單元具有包括至少一個(gè)被配置為類似靶分子的靶結(jié)合位點(diǎn)和表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)的表面，(b)使來自步驟(a)的一個(gè)或多個(gè)MIP單元與至少一個(gè)模板分子在第一溶劑中接觸，使所述一個(gè)或多個(gè)模板分子能夠結(jié)合至所述一個(gè)或多個(gè)MIP單元，(c)通過添加鈍化劑鈍化所述一個(gè)或多個(gè)MIP單元上的表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)，(d)通過在第二溶劑中沖洗移除所述一個(gè)或多個(gè)模板分子。鈍化劑通過鍵結(jié)合至所述一個(gè)或多個(gè)單元的表面，所述鍵在第二溶劑中的沖洗時(shí)
保持穩(wěn)定。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“鈍化”意指除去可能引起非特異性結(jié)合的表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)；即將不希望有的可帶電荷基團(tuán)轉(zhuǎn)化為對(duì)水解穩(wěn)定的不帶電基團(tuán)。從而，根據(jù)本發(fā)明的方法從一開始就使得能夠制備可以主要在靶結(jié)合位點(diǎn)中帶電荷的MIP單元。本發(fā)明的方法是簡(jiǎn)單的、不昂貴的并且能夠大量生產(chǎn)具有在靶結(jié)合位點(diǎn)中定位的表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)的定制的MIP單元。第一溶劑通常具有分別產(chǎn)生相反極性的表面結(jié)合的可帶電荷基團(tuán)和一個(gè)或多個(gè)模板分子的PH。從而，MIP單元將通過靜電相互作用的方式結(jié)合至模板分子。通過在模板和交聯(lián)劑的存在下聚合官能單體典型地提供具有包括至少一個(gè)被配置為類似靶分子的靶結(jié)合位點(diǎn)的表面的MIP單元。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以通過在第一溶劑中在一個(gè)或多個(gè)模板分子的存在下聚合官能單體同時(shí)進(jìn)行步驟(a)和步驟(b)。在該情況下，當(dāng)官能單體在第一溶劑中并且在模板分子的存在下聚合時(shí)，形成MIP單元。通過實(shí)施例的方式，下面的圖解闡述了當(dāng)官能單體甲基丙烯酸和模板分子普萘洛爾在合適的溶劑中混合時(shí)，它們產(chǎn)生相反的極性。
權(quán)利要求
1.一種制備至少一個(gè)定制的MIP單元的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供至少一個(gè)MIP單元，所述MIP單元具有表面，所述表面包括至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)和表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)，所述靶結(jié)合位點(diǎn)被配置為類似靶分子；(b)將來自所述步驟(a)的所述一個(gè)或多個(gè)MIP單元與至少一個(gè)模板分子在第一溶劑中接觸，使得所述一個(gè)或多個(gè)模板分子能夠結(jié)合至所述一個(gè)或多個(gè)MIP單元；(c)通過加入鈍化劑鈍化所述一個(gè)或多個(gè)MIP單元上的所述表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)；以及(d)通過在第二溶劑中沖洗移除所述一個(gè)或多個(gè)模板分子，其中所述鈍化劑通過在所述第二溶劑中的沖洗時(shí)保持穩(wěn)定的鍵結(jié)合至所述一個(gè)或多個(gè)單元的所述表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一溶劑具有分別產(chǎn)生相反極性的所述表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)和所述一個(gè)或多個(gè)模板分子的PH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述步驟(c)包括-移除非特異結(jié)合至被配置為類似靶分子的所述一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)模板分子，使得所述表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)暴露在所述表面上，-在所述鈍化劑與所述表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)之間形成穩(wěn)定的鍵。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述鍵選自酯鍵和酰胺鍵。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項(xiàng)所述的方法，其中通過在所述第一溶劑中在所述一個(gè)或多個(gè)模板分子的存在下聚合官能單體同時(shí)進(jìn)行所述步驟(a)和(b)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述官能單體是甲基丙烯酸官能單體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述模板化合物選自β阻滯藥的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述鈍化劑選自重氮甲烷、苯基重氮甲烷和酰鹵。
9.使用根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法制備的MIP單元用于檢測(cè)溶液中的靶分子的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中通過測(cè)量所述MIP單元在所述溶液中的團(tuán)聚速率進(jìn)行所述檢測(cè)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中通過測(cè)量所述MIP單元的凈有效電荷Zrff進(jìn)行所述檢測(cè)。
12.—種分子印跡聚合物(MIP)單元000)，所述單元(200)具有表面001)，所述表面 (201)包括至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)(201)和表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)Ο02)；所述靶結(jié)合位點(diǎn)(201)被配置為類似感興趣的靶分子；其中表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)Ο02)的總量的至少80%位于所述至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)Ο01)中以使與靶分子的靜電相互作用能夠發(fā)生在所述位點(diǎn)Ο01)中。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的MIP單元，其中表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)的總量的至少 90 %位于所述至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)中。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的MIP單元，其中表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)的總量的至少 95 %位于所述至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)中。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中的任一項(xiàng)所述的MIP單元，其中所述單元是直徑在50nm 至5μπι范圍內(nèi)的粒子的形式。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至14中的任一項(xiàng)所述的MIP單元，其中所述單元是厚度在20nm 至5μπι范圍內(nèi)的膜的形式。
17.根據(jù)權(quán)利要求12至16中的任一項(xiàng)所述的MIP單元，所述MIP單元還包括選自包括以下各項(xiàng)的組的識(shí)別標(biāo)志熒光團(tuán)、量子點(diǎn)和金納米粒子。
18.根據(jù)權(quán)利要求12至17中的任一項(xiàng)所述的MIP單元用于檢測(cè)溶液中的靶分子的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中通過測(cè)量所述MIP單元在所述溶液中的團(tuán)聚速率進(jìn)行所述檢測(cè)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中通過測(cè)量所述MIP單元的凈有效電荷Zrff進(jìn)行所述檢測(cè)。
全文摘要
一種制備至少一個(gè)定制的MIP單元的方法，所述方法包括(a)提供至少一個(gè)MIP單元，所述MIP單元具有包括至少一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)和表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)的表面，所述靶結(jié)合位點(diǎn)被配置為類似靶分子；(b)將來自步驟(a)的所述一個(gè)或多個(gè)MIP單元與至少一個(gè)模板分子在第一溶劑中接觸，使得所述一個(gè)或多個(gè)模板分子能夠結(jié)合至所述一個(gè)或多個(gè)MIP單元；(c)通過加入鈍化劑鈍化所述一個(gè)或多個(gè)MIP單元上的表面結(jié)合的可帶電荷的基團(tuán)；以及(d)通過在第二溶劑中沖洗移除所述一個(gè)或多個(gè)模板分子，其中所述鈍化劑通過在所述第二溶劑中的沖洗時(shí)保持穩(wěn)定的鍵結(jié)合至所述一個(gè)或多個(gè)單元的表面。
文檔編號(hào)C08F8/10GK102317322SQ201080007166
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月16日
發(fā)明者克里斯蒂娜·賴姆霍特, 葉磊, 吉松惠一, 比約恩·勒溫, 比約恩·馬爾默, 阿納扎·克勒澤 申請(qǐng)人:依米戈有限公司