專利名稱：用于從海藻提取物制備瓊脂糖聚合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從江蘺屬(Gracilaria)和凝花菜屬(Gelidiella)的種的提取物， 更具體地從獲自古吉拉特(Gujarat)和泰米爾納德(Tamil Nadu)海岸的印度海域的海藻一Gracilaria dura和凝花菜(Gelidiella acerosa)—的提取物分離瓊脂糖的改進(jìn)方法。
背景技術(shù)：
nj # # Selby & Wynne (mhistler (ed. ) polysaccharides and Their Derivatives，第 2 版，Academic Press, New York 1973，pp.四_48)，其中已闡明大多數(shù)商業(yè)瓊脂通過(guò)熱水提取產(chǎn)生。其他方法也是可能的，例如利用甘油、無(wú)水氨或其他溶劑進(jìn)行提取，但利用熱水的常規(guī)方法是最被推薦的(www.marinalg.org)。瓊脂提取法可根據(jù)處理的海藻種類而變化。它們通常經(jīng)歷三個(gè)階段(1)提取，(2)純化，(3)脫水，如下文中描述的 首先，用水仔細(xì)地洗滌海藻以除去海鹽和雜質(zhì)例如沙。如果海藻已經(jīng)歷堿處理，那么在壓力下或在開放式水箱中利用熱水來(lái)進(jìn)行提取。后一種方法主要用于江蘺屬海藻以降低所得瓊脂的硫酸酯或鹽(sulfate)的含量。在熱條件下將由99%的水和的瓊脂組成的提取汁 (extraction juice)過(guò)濾，然后將其冷卻至室溫。在機(jī)械壓力下或通過(guò)冷凍-解凍使所得的凝膠脫水。在壓力脫水中，施加49-98N/cm2的壓力以擠壓凝膠通過(guò)居間的過(guò)濾器。水通過(guò)過(guò)濾器，而瓊脂分子作為濾餅得到保留。在_18°C下進(jìn)行凝膠冷凍。在該溫度下，瓊脂分子從冰網(wǎng)絡(luò)(ice network)中選擇性排出并且形成條。解凍步驟使冰解凍并且選擇性回收瓊脂條。所采取的這兩種脫水操作各自除去約70%的初始含水量。然后通過(guò)用熱空氣干燥除去部分殘留水分。碾磨干瓊脂片以制備具有不同篩目大小的粉末形式的終產(chǎn)物?？蓞⒖糒ebbar Thami，Lebbar Rachid 和 Riad Abdelwahab 的專利(美國(guó)專利 5，496，936)，其中描述了瓊脂_瓊脂的加工，已在提取步驟中從海藻提取了瓊脂_瓊脂，隨后在脫水步驟中將其脫水以形成瓊脂-瓊脂凝膠或粉末，其中通過(guò)冷凍-解凍或機(jī)械擠壓或利用單螺桿或雙螺桿擠出機(jī)來(lái)進(jìn)行脫水。該方法受困于使用冷凍-解凍的耗能操作或需要復(fù)雜硬件的機(jī)械擠壓的繁瑣操作的缺點(diǎn)。可參見(jiàn)D. Du, Z. Zhuang 和 C. Zhuang 的專利(CN1587^4_A，2005 年 3 月 2 日； CN1296390-C，2007年1月M日)，其中按照下述來(lái)生產(chǎn)瓊脂“生產(chǎn)方法包括浸漬、中和、漂白和明膠提取。將材料在高溫和加壓條件下在低濃度堿溶液中浸漬，隨后進(jìn)行過(guò)濾，水洗， 用酸調(diào)整PH，用次氯酸鈉漂白，添加助劑(assistant)，煮沸以提取明膠，壓濾以脫水和干燥，獲得瓊脂”。該方法的不利方面在于其使用需要復(fù)雜硬件的“壓濾來(lái)脫水和干燥瓊脂”?？蓞⒁?jiàn)Sigma產(chǎn)品目錄Q006-2007 ；第沈9_270頁(yè))，在該目錄中其闡明“瓊脂糖是從瓊脂或具有瓊脂的海藻分離的經(jīng)純化的直鏈半乳聚糖水膠體(hydrocolloid)。瓊脂形成對(duì)于生物聚合物的擴(kuò)散和電動(dòng)運(yùn)動(dòng)幾乎是理想的凝膠基質(zhì)。因此，其可用于電泳、免疫電泳和免疫擴(kuò)散”。其中還提及不同等級(jí)的瓊脂糖具有在0. 10-0. 35%范圍內(nèi)的硫酸酯/鹽含量，其適合應(yīng)用于分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)電泳和細(xì)胞培養(yǎng)?？蓞⒖紟讉€(gè)報(bào)導(dǎo)，在所述報(bào)導(dǎo)中已闡明，瓊脂糖是從瓊脂分離的或直接從具有瓊脂的海藻例如紅藻回收的經(jīng)純化的直鏈半乳聚糖水膠體。從其提取瓊脂糖的屬包括石花菜屬(Gelidium)、江蘺屬、刺盾藻屬(Acanthopeltis)、仙菜屬(Ceramium)、雞毛菜屬 (Pterocladia)和凝菜屬(Campyla^hora)。Grabar(1957)已報(bào)導(dǎo)，通過(guò)在水中煮沸從紅藻提取瓊脂，然后通過(guò)過(guò)濾除去顆粒，膠凝化和冷凍-解凍膠體以除去水溶性雜質(zhì)并且用乙醇沉淀來(lái)分離瓊脂(Methods Biochem. Anal. 7 (1957) 1-38)。所得的產(chǎn)物是多糖的混合物，其為1，4_連接的3，6_酐-α-L-半乳糖和1，3_連接的β _D_半乳糖的交替共聚物。 重復(fù)的二糖禾爾為瓊月旨二糖(Araki, Proceedings 5th International Seaweed Symposium, Halifax, 1965, pp. 3_17)。當(dāng)然，這是理想的結(jié)構(gòu)，因?yàn)榧词辜兓沫傊且舶捎X(jué)察量的下列取代基(substituent)硫酸鹽/酯、丙酮酸鹽/酯和甲氧基。硫酸通常被酯化至3-0-吡喃半乳糖的(-4以及3，6-酐-(1-1^-半乳糖的(-2和(-6上的羥基。丙酮酸連接至β-D-吡喃半乳糖的一些殘基的C-4和C-6兩者。所得的化合物被Duckworth和 Yaphe (Carbohydr. Res. 16，1971，189-197)稱為 4，6_0_ 羧基亞乙基。nj # % Craigie 禾口 Leigh 白勺“Isolation of partially purified agarose with a quaternary base"(參見(jiàn)由 J A Hellebust 禾口 J S Craigie 編著的 Handbook of Phycological Methods, Cambridge University Press, Cambridge, 1978 ；pp. 126),其中將 250mg粗制瓊脂溶解在IOOml煮沸的蒸餾水中。加入25mg λ -角叉菜膠，在80-100°C溶液中加入IOml 2%溴棕三甲銨(Cetavlon)(西吡氯銨)。利用硅藻土 (Celite)過(guò)濾熱提取物，將其在膜(0.8微米)上加壓過(guò)濾，然后冷凍和解凍產(chǎn)物以產(chǎn)生部分純化的瓊脂糖，但該方法的缺點(diǎn)是，通過(guò)非常耗能的冷凍-解凍操作從熱提取物分離瓊脂糖聚合物。可參考美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)的網(wǎng)站www.ncbi.nlm.nih. gov，其中用于本發(fā)明的印度海域的海藻Gracilaria dura的18S核糖體RNA基因具有基因庫(kù)登錄號(hào) DQ399795。可參考Siddhanta，A. K.等(PCT 2005/118830 ；US 2005(^67296A1)，其中覆蓋了利用不同方法制備瓊脂和瓊脂糖的現(xiàn)有技術(shù)。該發(fā)明人進(jìn)一步公開了用于從(iracilaria dura制備具有高凝膠強(qiáng)度和低膠凝溫度的瓊脂糖的改進(jìn)方法，所述方法包括步驟用堿預(yù)處理干燥的海藻；漂洗預(yù)處理的海藻直至洗滌液顯示在7至8的范圍內(nèi)的pH ；加入水并且高壓滅菌以獲得提取物；用炭和硅藻土處理熱提取物以獲得熱提取物；在硅藻土床上真空過(guò)濾熱提取物；將濾液冷凍成團(tuán)塊并且使團(tuán)塊解凍；通過(guò)在高壓滅菌器中加熱將團(tuán)塊再溶解在水中，重復(fù)冷凍-解凍循環(huán)，對(duì)產(chǎn)物施壓以除去解凍的液體，隨后擠壓以盡可能排除殘留液體，從而獲得瓊脂糖和其瓊脂糖，該方法的缺點(diǎn)是將熱提取物在_15°C以下冷卻15小時(shí)，這是非常耗時(shí)和耗能的。此外，該方法中重復(fù)的冷凍-解凍循環(huán)使得其更加成本敏感。還可參考Meena 等人的論文(Carbohydrate Polymers 69 179-188，2007)，其中已表征了相同瓊脂糖并且將其性能與商購(gòu)可得的瓊脂糖的性能進(jìn)行了比較。可參考Kiyoshi Arai 等人(JP 7017，130，1970 年 1 月 13 日；Chemical Abstr. 74, 32889r，1971)的“Purification of agar，，，其中報(bào)導(dǎo)，用二甲基甲酰胺(DMF)提取粗制瓊脂以分離高純度的瓊脂糖。在攪拌的條件下將IOg瓊脂與500ml DMF混合，在熱水中浸漬 10小時(shí)，離心，將上清液倒入2升丙酮，將沉淀通過(guò)玻璃濾器，用500ml丙酮洗滌，將其溶解在熱水中并且過(guò)濾以產(chǎn)生瓊脂糖粉末?？蓞⒖糝. B. Provonchee (US 4，990，611，1991 年 2 月)的"Agarose purificationmethod using glycol”，其中通過(guò)將瓊脂或瓊脂糖溶解在低級(jí)亞烷基二醇中來(lái)從瓊脂或不純的瓊脂糖回收純化的瓊脂糖，其中在升高的溫度下將充足的瓊脂或瓊脂糖溶解在二醇中以形成包含至少約0. 瓊脂或瓊脂糖的二醇溶液，冷卻含有瓊脂或瓊脂糖的二醇溶液以誘發(fā)純化的瓊脂糖產(chǎn)物的沉淀，然后回收沉淀的瓊脂糖產(chǎn)物。還參考Kirkpatrick等人的美國(guó)專利4，983，沈8，該專利描述適合于快速電泳的純化的瓊脂糖的制備，所述瓊脂糖的特征在于硫酸酯/鹽含量低于0. 2wt%和凝膠強(qiáng)度至少1200g/Cm2(l% )。如下純化瓊脂糖將瓊脂糖或堿修飾的瓊脂糖溶解在于pH6. 0至8. 0下緩沖的并且包含不超過(guò)2. OnM的鹽如氯化物的水介質(zhì)中，然后如下通過(guò)與低級(jí)烷醇接觸來(lái)沉淀瓊脂糖“再次濾出瓊脂糖，隨后將其重懸浮于水中至IOOOg的總重量，通過(guò)煮沸溶解， 從而形成2%的溶液。將其冷卻至74°C，然后與兩升共沸異丙醇(IPA)(按重量計(jì)算87. 7% 的IPA)混合”。也可參考Alfred Poison 的著作(Chemical Abstract 65 :p5865a ； 1965)，其中已描述了用于瓊脂糖制備的瓊脂糖和瓊脂膠的混合物的分級(jí)分離。用分子量為300的聚乙二醇的水溶液處理混合物，產(chǎn)生富集瓊脂糖的沉淀。在該方法中，將80g Ion agar No. 2溶解在2升水中。向熱溶液(80°C)中加入2升40% (wt/vol)的分子量為6000的聚乙二醇，隨后利用110目的尼龍布過(guò)濾分離所得的沉淀。隨后將沉淀在40°C下洗滌2-3分鐘，在15°C 下懸浮于水中，在5升水中攪拌過(guò)夜，收集在尼龍過(guò)濾網(wǎng)中，用丙酮洗滌，然后在溫暖空氣中干燥?？蓞⒖糚rasad 等人的論文(Int. J. Biol. Macromol. 35，135-144，2005)，其中報(bào)導(dǎo)，離子型和非離子型表面活性劑以不同的方式改變瓊脂溶膠和凝膠的流變性質(zhì)和熱力學(xué)性質(zhì)。所述論文還公開了其中使用表面活性劑的其他現(xiàn)有技術(shù)。除了使用大量的多種有機(jī)溶劑外，從海藻提取物分離瓊脂的耗能問(wèn)題仍然存在于上述現(xiàn)有技術(shù)中。然而，上述論文和任何其他現(xiàn)有技術(shù)都沒(méi)有公開，使用表面活性劑在環(huán)境條件下將瓊脂糖從含水海藻提取物中沉淀出來(lái)而不使用任何有機(jī)溶劑，這是本發(fā)明的主要目的。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)很明顯的是，通過(guò)冷凍-解凍法以及在其他情況下通過(guò)壓力脫水收縮從含水海藻提取物分離瓊脂/瓊脂糖。隨后通過(guò)溶劑沉淀或?qū)游龇蛛x純化產(chǎn)物。因此， 從提取物分離產(chǎn)物所遵照的方法是高耗能的或需要復(fù)雜的硬件，因此期望發(fā)現(xiàn)從提取物分離產(chǎn)物的改進(jìn)的方法。本發(fā)明的目的本發(fā)明的主要目的是設(shè)計(jì)從稀釋的含水海藻提取物分離瓊脂糖的改進(jìn)的方法，所述方法省卻了對(duì)冷凍-解凍或機(jī)械擠壓提取物或向提取物中加入大量溶劑的需要。本發(fā)明的另一個(gè)目的是使用非離子型表面活性劑作為促凝劑誘發(fā)瓊脂糖從含水提取物凝結(jié)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是證實(shí)，對(duì)于通常具有彡0.3% (w/w)的硫酸酯或鹽 (sulphate)的瓊脂糖，所述凝結(jié)方法是特別有效的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是將來(lái)自Gracilaria dura和凝花菜的提取物用于上述目的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用堿處理海藻以降低瓊脂/瓊脂糖的硫酸酯或鹽含量并且除了如現(xiàn)有技術(shù)中公開的增加其凝膠強(qiáng)度外，還使其順從通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行的凝結(jié)。另一個(gè)目的是在添加表面活性劑之前離心熱提取物以除去所有懸浮物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是僅通過(guò)用水洗滌產(chǎn)物來(lái)除去凝結(jié)的瓊脂糖中的殘留表面活性劑。另一個(gè)目的是制備易分散的瓊脂糖。另一個(gè)目的是通過(guò)下列來(lái)獲得這樣的易分散性將產(chǎn)物再溶解在熱水中至多達(dá) 7% (w/v)的濃度，然后用異丙醇處理溶液以利用最少的溶劑獲得期望的產(chǎn)物。另一個(gè)目的是循環(huán)和再使用所述溶劑和所述表面活性劑。另一個(gè)目的是證實(shí)，本發(fā)明的瓊脂糖與通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的方法獲得的瓊脂糖相似。發(fā)明概述本發(fā)明涉及從由江蘺屬和凝花菜屬的種制備的稀釋的海藻提取物獲得瓊脂糖的改進(jìn)的方法。海藻(i)用堿進(jìn)行處理以降低硫酸酯或鹽的含量，( )用水進(jìn)行洗滌以除去堿，隨后(iii)進(jìn)行水煮以制備稀釋的提取物。隨后材料(iv)進(jìn)行均質(zhì)化，然后(ν)在熱條件下進(jìn)行離心以獲得不含不溶性雜質(zhì)的澄清海藻提取物。隨后熱提取物(Vi)在劇烈攪拌的條件下用水溶性非離子型表面活性劑進(jìn)行處理，然后(Vii)讓內(nèi)容物靜置以冷卻至室溫，之后瓊脂糖沉淀出來(lái)，隨后所述瓊脂糖(Viii)通過(guò)離心進(jìn)行分離，然后(ix)用水洗滌以除去附著的表面活性劑。隨后，(X)在熱條件下將濕的瓊脂糖團(tuán)塊再分散于最小體積的水中，(Xi)用等體積的異丙醇進(jìn)行處理以使瓊脂糖團(tuán)塊脫水，其在(xii)過(guò)濾和干燥后產(chǎn)生適合用于DNA凝膠電泳的精制的且易分散的產(chǎn)物。因此，本發(fā)明提供了使用表面活性劑從海藻的含水提取物純化瓊脂糖的改進(jìn)的方法，所述方法包括步驟(a)以10000-14000rpm離心經(jīng)堿處理的熱海藻提取物(70_80°C )5-15分鐘；(b)在連續(xù)攪拌的條件下將步驟(a)中獲得的熱海藻提取物與2-5%的表面活性劑在60-100°C的溫度下混合；(c)使步驟(b)中獲得的內(nèi)容物在25-35°C的溫度下靜置1_10小時(shí)以沉淀出瓊脂糖的固體團(tuán)塊；(d)傾倒上清液，然后用水洗滌所述團(tuán)塊以除去固體中的殘留表面活性劑；(e)將步驟(d)中獲得的濕的團(tuán)塊以7-10% w/w瓊脂糖產(chǎn)物的范圍溶解在最少量的水中，用最少量的異丙醇處理以沉淀出瓊脂糖，其中瓊脂糖溶膠對(duì)異丙醇的比率為 1 0. 5 至 1 1. 5w/w ；(f)分離固體產(chǎn)物并且在適當(dāng)?shù)母稍锲髦懈稍镆垣@得具有200至300的網(wǎng)目大小的瓊脂糖粉末。附圖概述

圖1. 1顯示PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物在Gracilaria dura瓊脂糖凝膠樣品上的DNA凝膠電泳。本發(fā)明的瓊脂糖凝膠樣品由圖1. Ia顯示，而先前(PCT2005/118830 ；US 2005/0267296 Al)發(fā)明的瓊脂糖凝膠樣品顯示于圖1. Ib中。圖a和b由相同的泳道組成，這些泳道為泳道l:lkbDNA 梯泳道2，3 1. 2kb 的 PCR 產(chǎn)物
泳道4，5 1 · 4kb 的 PCR 產(chǎn)物圖1. 2涉及從圖1. 1的凝膠上洗脫的DNA在Gracilaria dura瓊脂糖凝膠樣品上的凝膠電泳。本發(fā)明的瓊脂糖凝膠樣品由圖1. 顯示，而先前(PCT 2005/118830 ；US 2005/0267296 Al)發(fā)明的瓊脂糖凝膠樣品由圖1.2b顯示。圖a和b由相似的泳道組成，這些泳道是泳道1 IOObp DNA 梯泳道2 來(lái)自凝膠(1. Ib)的洗脫的1. 2kb產(chǎn)物泳道3 來(lái)自凝膠(1. Ib)的洗脫的1. 41Λ產(chǎn)物泳道4 來(lái)自凝膠(1. Ia)的洗脫的1. 2kb產(chǎn)物泳道5 來(lái)自凝膠(1. Ia)的洗脫的1. 4kb產(chǎn)物圖1. 3表示使用洗脫的產(chǎn)物作為模板(獲自圖1. 1)產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物在 Gracilaria dura瓊脂糖凝膠樣品上的凝膠電泳。本發(fā)明的瓊脂糖凝膠樣品示于圖1. 3a，而先前(PCT 2005/118830 ；US 2005/0267296A1)發(fā)明的瓊脂糖凝膠樣品由圖1. 3b顯示。圖 a和b由相似的泳道組成，這些泳道是泳道l:lkbDNA 梯泳道2 -ve對(duì)照泳道3,4 來(lái)自凝膠(1. Ib)和(1. Ia)洗脫的產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物1. Okb泳道5 -ve產(chǎn)物泳道6，7 來(lái)自凝膠(1. Ib)和(1. Ia)洗脫的產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物1. 4kb發(fā)明詳述本發(fā)明涉及從江蘺屬和凝花菜屬的種，更具體地Gracilaria dura和凝花菜制備具有高和低膠凝溫度的高凝膠強(qiáng)度的瓊脂糖的新型、直接且經(jīng)濟(jì)有效的方法，所述方法包括步驟(i)用堿預(yù)處理干燥的海藻以降低硫酸酯或鹽的含量，( )用水洗滌以除去堿，隨后(iii)進(jìn)行水煮以制備稀釋的提取物。隨后材料(iv)進(jìn)行均質(zhì)化，然后(ν)在熱條件下離心以獲得不含不溶性雜質(zhì)的澄清海藻提取物。隨后熱提取物(Vi)在劇烈攪拌的條件下用水溶性非離子型表面活性劑處理，然后(Vii)讓內(nèi)容物靜置以冷卻至室溫，之后瓊脂糖沉淀出來(lái)，隨后所述瓊脂糖(Viii)通過(guò)離心進(jìn)行分離，然后(ix)用水洗滌以除去附著的表面活性劑。隨后，(x)在熱條件下將濕的瓊脂糖團(tuán)塊再分散于最小體積的水中，(xi)用等體積的異丙醇處理以使瓊脂糖團(tuán)塊脫水，其在(xii)過(guò)濾和干燥后產(chǎn)生適合用于DNA凝膠電泳的精制的且易分散的產(chǎn)物。此外，所獲得的瓊脂糖的質(zhì)量能夠在塑料容器中貯存至少達(dá)到1年而無(wú)任何變質(zhì)。本發(fā)明描述了 “用于從海藻提取物制備瓊脂糖聚合物的改進(jìn)的方法”，利用新型方法分別從Gracilaria dura和凝花菜產(chǎn)生具有高端應(yīng)用、高凝膠強(qiáng)度，具有低和高膠凝溫度的瓊脂糖聚合物，所述新型方法包括(i)在25-95°C的溫度下在1-15%的堿濃度范圍內(nèi)用含水的堿分別預(yù)處理35份(對(duì)于江蘺屬的種)和20份(對(duì)于凝花菜屬的種)(v/w)，進(jìn)行 0. 5-5. 0小時(shí)的時(shí)間。(ii)用水充分漂洗經(jīng)預(yù)處理的海藻以除去過(guò)量的堿直至洗滌液顯示7至9的pH，(iii)對(duì)于每一份原始海藻分別加入約35份(對(duì)于江蘺屬的種)和20份(對(duì)于凝花菜屬的種)的水(v/V)，并且在100-1251的范圍內(nèi)高壓滅菌，進(jìn)行1.0-2.5小時(shí)的持
7續(xù)時(shí)間，以獲得提取物，(iv)均質(zhì)化熱提取物，然后離心，(ν)以10，000至14，OOOrpm離心熱提取物5至15分鐘，(vi)在連續(xù)攪拌下在60至100°C的溫度下用約2-5%的表面活性劑處理提取物，(vii)在1至10小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，在環(huán)境溫度05-35°C )下保持提取物與表面活性劑，以使固體團(tuán)塊從海藻提取物中凝結(jié)，(viii)通過(guò)離心將瓊脂糖的固體團(tuán)塊與液體分離，(ix)通過(guò)簡(jiǎn)單的洗滌或通過(guò)使用透析除去殘留表面活性劑，直至終洗滌液顯示與水相同的表面張力，(χ)任選地，將濕的團(tuán)塊以7至10% (w/w)的范圍再溶解于最少量的水中，(xi)對(duì)于IOOg瓊脂糖分散系，在50至150g IPA范圍內(nèi)的最少量的異丙醇中使其脫水，和(xii)過(guò)濾、干燥并且碾磨以獲得適合于DNA凝膠電泳的易分散的瓊脂糖產(chǎn)物。在Nilikansui型凝膠測(cè)試儀上于20°C下以1. 0%和1. 5%瓊脂糖凝膠測(cè)量本發(fā)明的瓊脂糖產(chǎn)物的凝膠強(qiáng)度。在STAR-Toledo TGA機(jī)器，Switzerland上進(jìn)行熱重分析法 (TGA)。通過(guò)在奧斯特瓦爾德粘度計(jì)(參考C. Rochas和M. Lahaye. Carbohydrate Polymers 1989,10 289)上測(cè)量固有粘度(intrinsic viscosity)來(lái)進(jìn)行分子量測(cè)定。按照Craigie 等人描述的方法(Hand Book of Phycological Methods, 1978 (Eds. Hellebust. J A and Craigie J S，Cambridge University Press) ；pp. 127)測(cè)量膠凝溫度和熔化溫度，通過(guò)在 800°C下焚燒固體6小時(shí)來(lái)測(cè)量灰分含量，通過(guò)用濃硝酸處理灰分，蒸發(fā)至干燥，將殘留物溶解在水中，過(guò)濾，然后針對(duì)硫進(jìn)行電感耦合等離子體-光發(fā)射光譜(inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy, ICP—0ES)分析來(lái)估計(jì)it酸酉旨或鹽的含量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可從江蘺屬和凝花菜屬的種，更具體地從獲自古吉拉特和泰米爾納德海岸的印度海域的Gracilaria dura和凝花菜獲得瓊脂糖。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，如現(xiàn)有技術(shù)中所實(shí)施的，進(jìn)行步驟i-iv。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可在60_90°C，更具體地70_80°C的溫度下向熱提取物中加入表面活性劑，然后以10，000至14，OOOrpm離心熱提取物5至15分鐘。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可在連續(xù)攪拌的條件下，在60-100°C的溫度下以 2%至5% (w/w)，更具體地3% (w/w)的濃度向熱提取物中加入表面活性劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)在環(huán)境溫度Q5-35°C )下靜置含有表面活性劑的提取物1-10小時(shí)，更具體地3-4小時(shí)，凝結(jié)瓊脂糖聚合物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)在環(huán)境溫度下離心來(lái)分離沉淀后產(chǎn)生的粗制瓊脂糖。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，粗制瓊脂糖中的殘留表面活性劑可通過(guò)簡(jiǎn)單的水洗滌或通過(guò)將再分散的粗制瓊脂糖經(jīng)歷透析來(lái)除去。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將濕的瓊脂糖團(tuán)塊再分散于熱水(120°C )中同時(shí)將瓊脂糖的濃度維持在7 %至10 %的范圍內(nèi)，更具體地7 %。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用等體積的異丙醇處理濃縮的瓊脂糖團(tuán)塊以使瓊脂糖團(tuán)塊脫水并且使其易于分散。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在適當(dāng)?shù)母稍锲髦羞M(jìn)行固體產(chǎn)物的分離和干燥以獲得具有200至300的網(wǎng)目大小的瓊脂糖粉末。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)已知的方法制備提取物，所述方法包括步驟 在25-95°C下用20-35份(w/w) 1-15% (w/w)氫氧化鈉水溶液處理干燥的海藻0. 5-5小時(shí)，然后洗滌以將PH調(diào)整至7-9的范圍內(nèi)，隨后向經(jīng)洗滌的海藻中加入去礦質(zhì)水，并且在 100-125°C的溫度下高壓滅菌1-2. 5小時(shí)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的表面活性劑是水溶性非離子型表面活性劑，更具體地 Triton X-100 和 Synperonic 91/6。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，其中洗滌操作的次數(shù)可以為5至20次，更具體地 6至10次操作，并且對(duì)于每一次洗滌操作，洗滌的持續(xù)時(shí)間可在10-30分鐘的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)硫酸酯或鹽的含量和灰分的含量相似或分別低于0. 3%和1. 0%時(shí)，可使用其他多糖，并且這可順從該方法。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于江蘺屬和凝花菜屬海藻，熱提取物中瓊脂糖的硫酸酯或鹽的含量分別可以為0. 20%至0. 25%。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，僅當(dāng)瓊脂糖中硫酸酯或鹽的水平低于(w/w)， 優(yōu)選低于0.5% (w/w)以及更優(yōu)選低于0.25% (w/w)時(shí)，所使用的表面活性劑才誘發(fā)絮凝。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)化學(xué)或生物化學(xué)方法將多糖脫硫酸化以使其具有約0. 3%或低于0. 3%的硫酸化內(nèi)容物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可從海藻提取物分離適合用于DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖聚合物，其在更低的濃度例如< 0. 8%的濃度下展示令人滿意的分辨性能。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在從瓊脂糖凝膠回收后，DNA的質(zhì)量和數(shù)量相似。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，DNA片段的分離在從本發(fā)明中獲得的瓊脂糖制備的瓊脂糖凝膠中是良好的。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，所獲得的瓊脂糖的質(zhì)量能夠在塑料容器中貯存至少達(dá)到1年而無(wú)任何變質(zhì)。以舉例說(shuō)明的方式提供下列實(shí)施例，因此，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中的實(shí)施例1-6遵從現(xiàn)有技術(shù)中提及的冷凍-解凍方法。但本發(fā)明的主要目的在于實(shí)施例7至11，其不使用冷凍-解凍方法。實(shí)施例1將Gracilaria dura(25g)海藻在35°C下于自來(lái)水中浸漬1小時(shí)，然后在氫氧化鈉 (NaOH)不存在的情況下在85°C下浸漬2小時(shí)。隨后將浸漬的海藻置于蒸餾水(海藻水 =1 35w/w)中并且于120°C下進(jìn)行高壓滅菌1.5小時(shí)。將提取物均質(zhì)化，離心以獲得不含不溶于水的雜質(zhì)的澄清提取物。將熱提取物傾倒在不銹鋼托盤中，并且使其冷卻至室溫。 將裝有膠凝的提取物的托盤在冰箱中于_20°C下保持20小時(shí)。隨后在室溫下解凍冷凍的凝膠。擠壓解凍的凝膠以除去附著的液體，之后其用去礦質(zhì)水進(jìn)行洗滌，最后進(jìn)行擠壓以除去附著的水。風(fēng)干天然瓊脂，然后在烘箱中于50°C干燥2小時(shí)。得率6.5gO6.0%)，相對(duì)于完全干燥的海藻；凝膠強(qiáng)度(1%的凝膠)在20°C 下，250g cm—2 ；膠凝溫度:34. 0°C ；灰分彡8. 06% ；硫酸酯或鹽彡3. 26%。實(shí)施例2
將凝花菜(25g)海藻在35°C下于自來(lái)水中浸漬1小時(shí)，然后在NaOH不存在的情況下在85°C下浸漬2小時(shí)。隨后將浸漬的海藻置于蒸餾水(海藻水=1 35w/w)中并且于120°C下進(jìn)行高壓滅菌1. 5小時(shí)。將提取物均質(zhì)化，離心以獲得不含不溶于水的雜質(zhì)的澄清提取物。將熱提取物傾倒在不銹鋼托盤中，并且使其冷卻至室溫。將裝有膠凝的提取物的托盤在冰箱中于_20°C下保持20小時(shí)。隨后在室溫下解凍冷凍的凝膠。擠壓解凍的凝膠以除去附著的液體，之后其用去礦質(zhì)水進(jìn)行洗滌，最后進(jìn)行擠壓以除去附著的水。風(fēng)干天然瓊脂，然后在烘箱中于50°C干燥2小時(shí)。得率5.5g(22.0%)，相對(duì)于完全干燥的海藻；凝膠強(qiáng)度(1.5%的凝膠)在20°C 下，300g cm—2 ；膠凝溫度:41. O0C ；灰分彡4. 56% ；硫酸酯或鹽彡2. 60%。實(shí)施例3將可食江蘺(Gracilaria edulis) (25g)海藻在35°C下于自來(lái)水中浸漬1小時(shí)，然后在NaOH不存在的情況下在85°C下浸漬2小時(shí)。隨后將浸漬的海藻置于蒸餾水(海藻 水=1 35w/w)中并且于120°C下進(jìn)行高壓滅菌1.5小時(shí)。將提取物均質(zhì)化，離心以獲得不含不溶于水的雜質(zhì)的澄清提取物。將熱提取物傾倒在不銹鋼托盤中，并且使其冷卻至室溫。將裝有膠凝的提取物的托盤在冰箱中于_20°C下保持20小時(shí)。隨后在室溫下解凍冷凍的凝膠。擠壓解凍的凝膠以除去附著的液體，之后其用去礦質(zhì)水進(jìn)行洗滌，最后進(jìn)行擠壓以除去附著的水。風(fēng)干天然瓊脂，然后在烘箱中于50°C干燥2小時(shí)。得率5.0g(20.0%)，相對(duì)于完全干燥的海藻；凝膠強(qiáng)度(1.5%的凝膠)在20°C 下，(IOOg cm—2 ；膠凝溫度:40. O0C ；灰分^ 6. 56% ；硫酸酯或鹽^ 5. 60%o實(shí)施例4在分開的實(shí)驗(yàn)中將實(shí)施例1和2的Gracilaria dura和凝花菜(各25g)海藻在 35°C下于自來(lái)水中浸漬1小時(shí)；棄去洗滌液，用2% NaOH在85°C下處理所述濕海藻2小時(shí)，然后用水洗滌海藻以除去過(guò)量的堿。隨后將經(jīng)預(yù)處理的海藻置于蒸餾水(海藻水 =1 35或1 20w/w)中并且于120°C下進(jìn)行高壓滅菌1. 5小時(shí)。將Gracilaria dura 和凝花菜的提取物分別均質(zhì)化，離心以獲得不含不溶于水的雜質(zhì)的澄清提取物，其分別具有彡1.87%和彡1.76%的硫酸酯或鹽含量。用兩種非離子型[Triton X-100 (S. D. Fine Chemicals, India) ；Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, India)]表面活性劑(3%w/w，相對(duì)于提取物)處理這些提取物。在劇烈攪拌的條件下，以不攙水的形式(neat form)逐漸加入表面活性劑。在完成表面活性劑的添加后，中斷攪拌并且讓內(nèi)容物在室溫下靜置5小時(shí)。 在任何情況下未觀察到沉淀。Gracilaria dura的瓊脂糖得率18 % ；凝膠強(qiáng)度:530g cm—2 ；硫酸酯或鹽 彡 1. 87%。凝花菜的瓊脂糖得率14% ；凝膠強(qiáng)度850g cm_2 ；硫酸酯或鹽彡1. 76%。實(shí)施例5在分開的實(shí)驗(yàn)中將實(shí)施例1和2的Gracilaria dura和凝花菜海藻在35°C下于自來(lái)水中浸漬1小時(shí)；棄去洗滌液，用3. 5% NaOH在85°C下處理所述濕海藻2小時(shí)，然后用水洗滌海藻以除去過(guò)量的堿。隨后將用3. 5% NaOH預(yù)處理的海藻置于蒸餾水(海藻水 =1 35或1 20w/w)中并且于120°C下進(jìn)行高壓滅菌1. 5小時(shí)。將Gracilaria dura 和凝花菜的提取物分別均質(zhì)化，離心以獲得不含不溶于水的雜質(zhì)的澄清提取物，其分別具有彡1.22%和彡1.47%的硫酸酯或鹽含量。用兩種非離子型[Triton X-100 (S. D. Fine Chemicals, India) ；Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, India)]表面活性劑(3%w/w，相對(duì)于提取物)處理這些提取物。在劇烈攪拌的條件下，以不攙水的形式逐漸加入表面活性劑。 在完成表面活性劑的添加后，中斷攪拌并且讓內(nèi)容物在室溫下靜置5小時(shí)。在任何情況下未觀察到沉淀。Gracilaria dura的瓊脂糖得率16 % ；凝膠強(qiáng)度:820g cm—2 ；硫酸酯或鹽 彡 1. 02%。凝花菜的瓊脂糖得率14% ；凝膠強(qiáng)度:980g cm—2 ；硫酸酯或鹽1. 47%。實(shí)施例6在分開的實(shí)驗(yàn)中將實(shí)施例1和2的Gracilaria dura和凝花菜海藻在35°C下于自來(lái)水中浸漬1小時(shí)；棄去洗滌液，用4% NaOH在85°C下處理所述濕海藻2小時(shí)，然后用水洗滌海藻以除去過(guò)量的堿。隨后將用4% NaOH預(yù)處理的海藻置于蒸餾水(海藻水=1 35 或1 20w/w)中并且于120°C下進(jìn)行高壓滅菌1. 5小時(shí)。將Gracilaria dura和凝花菜的提取物分別均質(zhì)化，離心以獲得不含不溶于水的雜質(zhì)的澄清提取物，其分別具有< 0. 72% 和彡1. 38%的硫酸酯或鹽含量。用兩種非離子型[TritonX-100 (S. D. Fine Chemicals, India) ；Synperonic 91/6 (ICI Uniqema, India)]表面活性劑(3% w/w，相對(duì)于提取物)處理這些提取物。在劇烈攪拌的條件下，以不攙水的形式逐漸加入表面活性劑。在完成表面活性劑的添加后，中斷攪拌并且讓內(nèi)容物在室溫下靜置5小時(shí)。在使用非離子型表面活性劑的情況下，在從Gracilaria dura制備的、包含彡0. 82 %的硫酸酯或鹽的提取物中觀察到沉淀。對(duì)于上述任何表面活性劑，在從凝花菜制備的、包含< 1. 38%的硫酸酯或鹽的提取物中未觀察到沉淀。Gracilaria dura的瓊脂糖得率15% ；凝膠強(qiáng)度:1300g GnT2 ；硫酸酯或鹽 彡 0. 82%。凝花菜的瓊脂糖得率13% ；凝膠強(qiáng)度:1020g cm—2 ；硫酸酯或鹽1. 38%。表1 用陽(yáng)離子型、陰離子型和非離子型表面活性劑處理經(jīng)堿處理的海藻提取物
權(quán)利要求
1.利用表面活性劑從海藻的含水提取物純化瓊脂糖的改進(jìn)的方法，所述方法包括步驟a.以10000-14000rpm離心經(jīng)堿處理的熱海藻提取物(70_80°C)5至15分鐘；b.在連續(xù)攪拌的條件下將步驟(a)中獲得的熱海藻提取物與2-5%表面活性劑在 60-100°C的溫度范圍下混合；c.使步驟(b)中獲得的內(nèi)容物在25-35°C的溫度范圍下靜置1-10小時(shí)以沉淀出瓊脂糖的固體團(tuán)塊；d.傾倒上清液并且用水洗滌所述團(tuán)塊以除去固體中的殘留表面活性劑；e.將步驟(d)中獲得的濕團(tuán)塊以7至10%w/w瓊脂糖產(chǎn)物的范圍再溶解于最少量的水中，并且用最少量的異丙醇處理以沉淀出瓊脂糖，其中瓊脂糖溶膠對(duì)異丙醇的比率為 1 0. 5 至 1 1. 5w/w ；f.分離固體產(chǎn)物并且在適當(dāng)?shù)母稍锲髦羞M(jìn)行干燥以獲得具有200至300的網(wǎng)目大小的瓊脂糖粉末。
2.權(quán)利要求1的方法，其中用于制備提取物的海藻選自江蘺屬和凝花菜屬的種，更具體地選自獲自古吉拉特和泰米爾納德海岸的印度海域的Gracilaria dura和凝花菜。
3.權(quán)利要求1的方法，其中利用已知的方法制備提取物，所述方法包括步驟在 25-95°C下用20-35份(w/w) 1-15% (w/w)的氫氧化鈉水溶液處理干燥的海藻0. 5-5小時(shí)， 然后進(jìn)行洗滌以將PH調(diào)整在7-9的范圍內(nèi)，隨后向經(jīng)洗滌的海藻中加入去礦質(zhì)水，并且在 100-125°C的溫度范圍下高壓滅菌1-2. 5小時(shí)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所使用的表面活性劑是選自商購(gòu)可得的辛基苯酚乙氧基化物(Triton X-100)和壬基苯酚乙氧基化物(Synperonic 91/6)的非離子型表面活性劑。
5.權(quán)利要求1的方法，其中在環(huán)境條件下進(jìn)行步驟(d)中的洗滌或透析操作直至洗滌液的表面張力與水的表面張力相同。
6.權(quán)利要求1的方法，其中從消耗的提取物和洗滌液再循環(huán)表面活性劑。
7.權(quán)利要求1的方法，其中僅當(dāng)瓊脂糖中硫酸酯或鹽的水平<0.82%(w/w)，優(yōu)選 < 0. 5% (w/w)，以及更優(yōu)選< 0. 25%時(shí)，所使用的表面活性劑才誘發(fā)絮凝。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法用于純化這樣的多糖，其固有地包含低硫酸酯或鹽和/或可通過(guò)化學(xué)或生物化學(xué)方法脫硫酸化至這樣低水平的硫酸酯或鹽含量。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所獲得的瓊脂糖聚合物適合用于DNA凝膠電泳。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所獲得的瓊脂糖的質(zhì)量能夠在塑料容器中貯存至少達(dá)到1 年而無(wú)任何變質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從江蘺屬和凝花菜屬的種，更具體地從印度海域的Gracilaria dura和凝花菜制備瓊脂糖的更方便和具有更高能源效率的方法，所述方法包括步驟用堿預(yù)處理干燥的海藻，漂洗經(jīng)預(yù)處理的海藻直至洗滌液顯示7至9的pH，加入水，高壓滅菌以獲得提取物，離心熱海藻提取物，隨后用表面活性化學(xué)品處理澄清的熱提取物以誘發(fā)瓊脂糖的沉淀，離心團(tuán)塊以除去附著的液體，用水漂洗離心的團(tuán)塊以除去表面活性化學(xué)品，在最少量的水中制備瓊脂糖團(tuán)塊的熱溶膠，用異丙醇再沉淀瓊脂糖以獲得這樣的產(chǎn)物，其在制備凝膠時(shí)具有可分散性并且顯示，在DNA凝膠電泳研究中所述凝膠顯示與通過(guò)更常規(guī)的瓊脂糖制備方法從相同海藻提取物獲得的凝膠以及與從商業(yè)基準(zhǔn)(commercial benchmark)制備的凝膠等同的性能。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102439047SQ201080017359
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日
發(fā)明者A·K·斯德汗塔, A·米施拉, B·K·拉馬瓦特, B·耶哈, G·K·梅塔, K·埃斯瓦蘭, K·普拉薩德, M·R·甘地, M·S·伽尼桑, P·K·阿加瓦爾, P·K·高希, R·米納 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究會(huì)