專利名稱：一種親和溫敏雙水相體系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于雙水相體系領(lǐng)域，特別涉及一種親和溫敏雙水相體系及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，由于雙水相萃取技術(shù)在微生物、有機化合物和金屬螯合物的分離和純化、 預(yù)濃集過程中表現(xiàn)出相當好的性能，并有望用于大規(guī)模提取和純化生物活性物質(zhì)，因此越來越受到人們的關(guān)注。由于雙水相體系易于放大、傳質(zhì)速度快、節(jié)省能耗、工作條件溫和、易于實現(xiàn)過程連續(xù)化，所以雙水相體系在生物技術(shù)中的應(yīng)用越來越廣泛。目前，雙水相體系主要用于細胞的回收、從發(fā)酵液中提取蛋白質(zhì)產(chǎn)品和酶以及與產(chǎn)物的萃取分離相結(jié)合的生物轉(zhuǎn)化等。N-異丙基丙烯酰胺(NiPAAm)的高聚物聚(N-異丙基丙烯酰胺)簡稱PNiPAAm，是一種具有最低臨界溶液溫度(LCST)特性的熱敏性智能聚合物材料，由于其大分子側(cè)鏈上同時具有親水性的酰胺基-CONH-和疏水性的異丙基-CH(CH3)2，使線型PNiPAAm的水溶液隨著外界溫度的變化可在其LCST附件發(fā)生可逆相變。其相變溫度在人體生理溫度(37°C ) 附近，具有良好的離子型水溶性、熱敏性以及生物相容性，因而在藥物控釋、酶固定化、免疫分析、生化分離等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種親和溫敏雙水相體系及其應(yīng)用，該雙水相體系的制備方法操作簡單、條件溫和、時間短、成本低且成相聚合物可重復(fù)利用，本發(fā)明的親和溫敏雙水相體系能夠快速簡便的從天然產(chǎn)物中分離純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一種親和溫敏雙水相體系，其制備方法，包括1)將0. 25 2. Og N-異丙基丙烯酰胺(NiPAAm)與50 400 μ 1丙烯酸(AA)溶解在15 50ml去離子水中，然后將其置于反應(yīng)容器中，真空脫氣，再加入30 60 μ 1 N，N， N' ,N'-四甲基乙二胺(TEMED)和含有0. 015 0. 120g過硫酸銨(APS)的過硫酸銨水溶液(0. 15 1. 20ml)，通氮氣鼓泡后密封，接著在45 55°C恒溫水浴中反應(yīng)30 60min，收集沉淀后得到溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA 二元線型聚合物；2)將上述的溫敏聚合物PNI iPAAm-co-AA配制成濃度為0. 05 0. 10g/ml的 PNIiPAAm-co-AA水溶液，取上述水溶液5 10ml，加入5 IOml濃度為0. 1 0. 2mol/L 硫酸銅溶液，室溫下振蕩反應(yīng)1 2h，收集沉淀得到親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu ；3)用上述親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4萬構(gòu)建親和溫敏雙水相體系并繪制相圖。上述步驟1)中的N-異丙基丙烯酰胺(NiPAAm)的質(zhì)量為0. 5 1. Og,丙烯酸(AA) 的用量為100 300 μ 1。上述步驟1)中真空脫氣時間為10 30min，氮氣鼓泡時間為15 30min。上述步驟1)中加入的四甲基乙二胺(TEMED)為40 50 μ 1，過硫酸銨(APS)用量為 0. 050 0. IOOg0上述步驟2)中在配制好PNIiPAAm-co-AA水溶液后，用lmol/L HCl或lmol/L NaOH 調(diào)節(jié)上述溶液的PH值為7.0。上述步驟3)中所述的繪制相圖采用濁點法。PNiPAAm-co-AA-Cu-葡聚糖4萬雙水相體系相圖的繪制，具體步驟如下將兩種成相聚合物-親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4萬分別制成一定濃度的母液。準確稱量一定量親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu母液，加入試管中，然后加入葡聚糖4萬母液混合均勻，直到試管開始出現(xiàn)混濁為止，稱量加入的葡聚糖4萬母液的質(zhì)量，算出親和溫敏聚合物和葡聚糖4萬在雙水相體系中的重量百分濃度，再加入適量水，使體系變澄清， 稱量加入水的質(zhì)量，并繼續(xù)加入葡聚糖4萬母液，使體系再次變混濁，如此反復(fù)操作，計算到達混濁時親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4萬在系統(tǒng)中的重量百分含量，則可得到親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4萬的雙節(jié)線相圖。本發(fā)明的一種親和溫敏雙水相體系應(yīng)用于BSA (牛血清蛋白)的分離純化。所述的BSA的分離純化，首先要進行BSA分離純化條件的優(yōu)化，采用單因素實驗進行優(yōu)化，只改變親和溫敏聚合物、葡聚糖4萬、BSA初始濃度及pH值中的一個因素(親和溫敏聚合物濃度的改變范圍為2. 5 4. Owt %、葡聚糖4萬濃度的改變范圍為6 Hwt %、BSA 初始濃度的改變范圍為5. O 25. Omg/ml、pH值的改變范圍為4. O 8. 0)，探討親和溫敏聚合物、葡聚糖4萬、BSA初始濃度以及pH值對BSA在雙水相體系中分配的影響，得出BSA 分離純化的最優(yōu)實驗條件。本發(fā)明在PNiPAAm高聚物上共聚丙烯酸(AA)，引入可與金屬離子螯合反應(yīng)的羧基-C00H，然后在PNiPAAm-C0-AA 二元線型聚合物上鍵合金屬離子，從而制得同時具有溫度敏感性和親和特性的聚合物。將這種聚合物引入雙水相體系，能有效解決目前雙水相體系成本偏高的缺陷，同時保留了雙水相本身的優(yōu)點，使雙水相萃取蛋白質(zhì)更具有商業(yè)應(yīng)用價值。有益效果(1)本發(fā)明所建立的親和溫敏雙水相體系，分相行為好，操作簡單，時間短，生物相容性好。(2)本發(fā)明使用的成相物質(zhì)可回收利用，大大降低了雙水相成本，適用于規(guī)?；?br> 產(chǎn)需要。(3)本發(fā)明分離純化后的BSA回收率高達80% 90%。


圖1為溫敏聚合物PNIPAAm-co-AA的LCST測定曲線；圖2為親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu的儲存穩(wěn)定性圖；圖3為PNiPAAm-co-AA-Cu/葡聚糖4萬雙水相體系相圖；圖4為不同條件對BSA分配系數(shù)(K)和回收率(Recovery)的影響。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1溫敏聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物(PNiPAAm-C0-AA)的合成，具體步驟如下將1. Og N-異丙基丙烯酰胺和100 μ 1丙烯酸溶解在25ml去離子水中，置于IOOml 具塞磨口圓底燒瓶中，真空脫氣lOmin，加入N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺(TEMED) (60 μ 1) 和0. 6ml過硫酸銨溶液(0. lg/ml)，通氮氣鼓泡15min后密封，之后50°C恒溫水浴反應(yīng) 30min。反應(yīng)結(jié)束后，將上層清液輕輕倒出，加入50ml去離子水將沉淀溶解。待沉淀完全溶解后，置于50°C恒溫水浴中30min，離心收集聚合物沉淀。重復(fù)上述步驟3次，以去除未反應(yīng)的單體。在最后一次聚合物沉淀過程中可加入0. 2mol/L NaCl溶液來促進聚合物的沉淀， 避免聚合物在沉淀過程中的損失。實施例2將0. 25g N-異丙基丙烯酰胺和50 μ 1丙烯酸溶解在15ml去離子水中，置于反應(yīng)容器中，真空脫氣201^11，加入隊隊& ,N'-四甲基乙二胺(TEMED) (30 μ 1)和0.15ml過硫酸銨溶液(0. lg/ml)，通氮氣鼓泡30min后密封，之后45°C恒溫水浴反應(yīng)60min。反應(yīng)結(jié)束后，將上層清液輕輕倒出，加入40ml去離子水將沉淀溶解。待沉淀完全溶解后，置于50°C 恒溫水浴中30min，離心收集聚合物沉淀。重復(fù)上述步驟3次，以去除未反應(yīng)的單體。在最后一次聚合物沉淀過程中可加入0. 2mol/L NaCl溶液來促進聚合物的沉淀，避免聚合物在沉淀過程中的損失。實施例3將2. Og N-異丙基丙烯酰胺和400 μ 1丙烯酸溶解在50ml去離子水中，置于反應(yīng)容器中，真空脫氣lOmin，加入N，N，N' , N'-四甲基乙二胺(TEMED) (45 μ 1)和0. 6ml過硫酸銨溶液(0. 2g/ml)，通氮氣鼓泡20min后密封，之后55°C恒溫水浴反應(yīng)60min。反應(yīng)結(jié)束后，將上層清液輕輕倒出，加入50ml去離子水將沉淀溶解。待沉淀完全溶解后，置于50°C 恒溫水浴中30min，離心收集聚合物沉淀。重復(fù)上述步驟3次，以去除未反應(yīng)的單體。在最后一次聚合物沉淀過程中可加入0. 2mol/L NaCl溶液來促進聚合物的沉淀，避免聚合物在沉淀過程中的損失。實施例4親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu的合成，具體步驟如下將上述制備的溫敏聚合物PNIiPAAm-co-AA配制成0. lg/ml的水溶液，用lmol/L HCl或lmol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值為7. 0。取5ml聚合物水溶液置于50ml錐形瓶中，冰浴30min。緩慢滴加10ml，0. lmol/L CuSO4溶液，室溫下振蕩反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后加入lml， 2mol/L NaCl溶液，60°C水浴保溫15min。IOOOOrpm離心5min，輕輕倒去上層清液，加入IOml 去離子水，置入4°C冰箱中溶解沉淀。重復(fù)2次后，將聚合物溶液的濃度調(diào)節(jié)到0. 02g/ml, 置于4°C冰箱中備用。實施例5親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu的合成，具體步驟如下
將上述制備的溫敏聚合物PNIiPAAm-co-AA配制成0. 05g/ml的水溶液，用Imol/ L HCl或lmol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值為7. O。取IOml聚合物水溶液置于50ml錐形瓶中，冰浴30min。緩慢滴加5ml，0. 2mol/L CuSO4溶液，室溫下振蕩反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后加入2ml，2mol/L NaCl溶液，60°C水浴保溫15min。20000rpm離心5min，輕輕倒去上層清液， 加入15ml去離子水，置入4°C冰箱中溶解沉淀。重復(fù)3次后，將聚合物溶液的濃度調(diào)節(jié)到 0. 02g/ml，置于4°C冰箱中備用。實施例6 PNiPAAm-co-AA-Cu-葡聚糖4萬雙水相體系相圖的繪制，具體步驟如下將兩種成相聚合物-親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4萬分別制成濃度為20wt %的母液。準確稱量2. Og親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu母液，加入試管中，然后加入葡聚糖4萬母液混合均勻，直到試管開始出現(xiàn)混濁為止，稱量加入的葡聚糖4萬母液的質(zhì)量為0. 22g，算出親和溫敏聚合物和葡聚糖4萬在雙水相體系中的重量百分濃度分別為5. 06wt%和1.91Wt%，再加入適量水，使體系變澄清，稱量加入水的質(zhì)量為 0. 89g，并繼續(xù)加入葡聚糖4萬母液，使體系再次變混濁，如此反復(fù)操作，計算到達混濁時親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4萬在系統(tǒng)中的重量百分含量，則可得到親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4萬的雙節(jié)線相圖，如圖3所示。實施例7BSA分離純化的實驗條件的優(yōu)化，具體步驟如下(l)PNiPAAm-co-AA-Cu含量的確定將雙水相體系中的葡聚糖4萬的濃度固定在
6.Owt%，改變體系中親和溫敏聚合物的濃度(2. 5wt%,3. Owt3. 5wt%,4. Owt% )來構(gòu)建不同的葡聚糖/親和溫敏聚合物雙水相體系。測定BSA在所構(gòu)建的雙水相體系中的分配系數(shù)和回收率。其他實驗條件為，PH值為7. 0，BSA溶液濃度為5. Omg/ml，如圖如所示。(2)葡聚糖4萬含量的確定用不同濃度的葡聚糖4萬(ewt^jwt^UOwt^、 12wt%U4wt% )來構(gòu)建葡聚糖/親和溫敏聚合物雙水相體系，測定BSA在所構(gòu)建的雙水相體系中的分配系數(shù)和回收率。其他實驗條件為，親和溫敏聚合物的濃度為2. 5wt%，pH值為
7.0，BSA溶液濃度為5. Omg/ml，如圖4b所示。(3)BSA初始濃度的確定在葡聚糖4萬的濃度為6. Owt%，親和溫敏聚合物的濃度為3. 5wt%構(gòu)成的雙水相體系(pH值為6. 0)中，通過改變體系中BSA的加入量(5. 0,10. 0、 15. 0,20. 0,25. Omg/ml)，考察BSA溶液的初始濃度對BSA在親和溫敏雙水相體系中的分配系數(shù)和回收率的影響并測定BSA在所構(gòu)建的雙水相體系中的分配系數(shù)和回收率，如圖如所
7J\ ο(4)pH的確定在葡聚糖4萬的濃度為6.0wt%，親和溫敏聚合物的濃度為 3. 5wt%構(gòu)成的雙水相體系中，通過改變體系的pH值0、5、6、7、8)，考察？!1值對854在親和溫敏雙水相體系中的分配系數(shù)和回收率的影響并測定BSA在所構(gòu)建的雙水相體系中的分配系數(shù)和回收率。BSA溶液的初始濃度為5. 0mg/ml，如圖4d所示。實施例8BSA的分離純化，具體步驟如下(1)用 pH 值為 7.0 的 0.05mol/L tris-HCl 緩沖液配置 5. 50wt % PNiPAAm-co-AA-Cu溶液、40wt%葡聚糖4萬溶液及5. Omg/ml的BSA溶液；
(2)在試管中加入3. 82g上述PNiPAAm-co-AA-Cu溶液及0. 9g上述葡聚糖4萬溶液，加入Iml上述BSA水溶液，并向雙水相體系中加入pH值為7. 0的tris_HCl緩沖液直至體系總重為6. Og,在旋渦混合器上混合Imin振蕩混合均勻，室溫下靜置30min，體系分成兩相，使BSA在兩相中進行分配；(3)在上下兩相中分別取出Iml樣品，分別測定兩相中BSA的濃度。其中，親和溫敏聚合物相置于40°C水浴中保溫lOmin，使親和溫敏聚合物受熱凝聚至完全沉淀，SOOOrpm 離心5min棄上清。將所得沉淀用pH 6. O的0. 05mol/L Tris-HCl緩沖溶液洗滌數(shù)次，除去未吸附的蛋白質(zhì)。最后用2ml，pH 4. O的0. 05mol/L Tris-HCl緩沖溶液(含有0. 20mol/L NaCl和0. 050mol/L EDTA)在4°C下將溫敏聚合物充分溶解，在40°C水浴下保溫lOmin，使親和溫敏聚合物完全沉淀，SOOOrpm離心5min取上層清液，分別測定洗脫前后溶液中蛋白質(zhì)的含量；葡聚糖4萬相直接進行蛋白質(zhì)含量測定；(4)根據(jù)BSA在兩相中的分配情況，計算得BSA在該雙水相體系中的分配系數(shù)為 24. 14，回收率為84. 1% ο
權(quán)利要求
1.一種親和溫敏雙水相體系，其制備方法，包括1)將0.25 2. Og N-異丙基丙烯酰胺與50 400 μ 1丙烯酸溶解在去離子水中，然后將其置于反應(yīng)容器中，真空脫氣，再加入30 60μ1 N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺和含有0. 015 0. 120g過硫酸銨的過硫酸銨水溶液0. 15 1. 20ml，通氮氣鼓泡后密封，接著在45 55 °C恒溫水浴中反應(yīng)30 60min，收集沉淀后得到溫敏聚合物PNiPAAm-co_AA 二元線型聚合物；2)將上述的溫敏聚合物PNIiPAAm-co-AA配制成濃度為0.05 0. 10g/ml的 PNIiPAAm-co-AA水溶液，取上述水溶液5 10ml，加入5 IOml濃度為0. 1 0. 2mol/L 硫酸銅溶液，室溫下振蕩反應(yīng)1 2h，收集沉淀得到親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu ；3)用上述親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4萬構(gòu)建親和溫敏雙水相體系并繪制相圖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和溫敏雙水相體系，其特征在于步驟1)中所述的 N-異丙基丙烯酰胺的質(zhì)量為0. 5 1. Og，丙烯酸的用量為100 300 μ 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和溫敏雙水相體系，其特征在于步驟1)中所述的真空脫氣時間為10 30min，氮氣鼓泡時間為15 30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和溫敏雙水相體系，其特征在于；步驟1)中加入的四甲基乙二胺為40 50 μ 1，過硫酸銨用量為0. 050 0. 100g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和溫敏雙水相體系，其特征在于步驟2)中在配制好 PNIiPAAm-co-AA水溶液后，用lmol/L HCl或lmol/L NaOH調(diào)節(jié)上述溶液的pH值為7. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和溫敏雙水相體系，其特征在于步驟幻中所述的繪制相圖采用濁點法。
7.一種親和溫敏雙水相體系應(yīng)用于BSA牛血清蛋白的分離純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種親和溫敏雙水相體系應(yīng)用于BSA牛血清蛋白的分離純化，其特征在于BSA牛血清蛋白的分離純化的實驗條件為親和溫敏聚合物濃度的改變范圍為2. 5 4. 0wt%、葡聚糖4萬濃度的改變范圍為6 HWt%、BSA初始濃度的改變范圍為5. 0 25. 0mg/ml、pH值的改變范圍為4. 0 8. 0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種親和溫敏雙水相體系及其應(yīng)用，包括1)制備溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA二元線型聚合物；2)將上述制備的溫敏聚合物PNIiPAAm-co-AA配制成水溶液，加入硫酸銅溶液，反應(yīng)完成，收集沉淀得到親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu；3)用上述親和溫敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4萬構(gòu)建親和溫敏雙水相體系并繪制相圖。本發(fā)明親和溫敏雙水相體系用于BSA牛血清蛋白的分離純化。該方法所建立的親和溫敏雙水相體系，分相行為好，操作簡單，時間短，成相物質(zhì)可回收利用，有效降低雙水相成本，適用于規(guī)?；a(chǎn)需要。
文檔編號C08F220/54GK102174147SQ201110065150
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者凌元清, 朱利民, 聶華麗 申請人:東華大學