專利名稱：一種絲素蛋白/共聚物水凝膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水凝膠材料領(lǐng)域，具體涉及一種由絲素蛋白和共聚物PLA-PEG-PLA構(gòu)成的水凝膠。
背景技術(shù)：
在眾多生物醫(yī)用高分子材料中，高分子水凝膠是當(dāng)今研究熱點之一。高分子水凝膠是一種能在水中溶脹并保持大量水分而不溶解的聚合物。由于水凝膠聚合物網(wǎng)絡(luò)中充斥有大量的水分，使得整個材料具備了流體的性質(zhì)，這與充盈有大量水溶液的機體組織及其相似，柔軟、潤濕的表面大大減少了材料對周圍組織的刺激，使得水凝膠具有良好的生物相容性，在藥物釋放和人體組織工程方向擁有極大開發(fā)潛力?，F(xiàn)有技術(shù)中，屬于研究熱點并且已取得一定進(jìn)展的水凝膠材料有包括膠原、殼聚糖、聚乙烯醇、聚乙二醇/聚酯嵌段共聚物等，其中，膠原的力學(xué)性能較差，需要使用交聯(lián)劑改善其機械性能，而通常應(yīng)用的交聯(lián)劑如戊二醛等都具有很高的細(xì)胞毒性，經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)以后，膠原的生物相容性會降低；殼聚糖作為支架材料，其降解速度以及與組織之間的結(jié)合能力都有待提高和優(yōu)化；聚乙烯醇、聚乙二醇/聚酯嵌段共聚物等人工合成材料，雖然其可加工性好，但是其生物相容性比不上天然可降解材料，降解速度過慢，這些都是需要加以改善和研究的方面。絲素蛋白是一種純天然蛋白質(zhì)，具有與膠原蛋白同等的體內(nèi)、外生物相容性，并且可以自然降解，降解最終產(chǎn)物為氨基酸，非常適合用作生物材料。絲素蛋白水溶液自然放置會形成水凝膠，但其凝膠時間較長，因此，限制了它的應(yīng)用。Tuna Yucel, Peggy Cebe等人通過超聲波振蕩的方法，能在短時間內(nèi)將絲素蛋白溶液形成為水凝膠，大大提高了工作
:Tuna Yucel, Peggy Cebe et al. Biophysical. 97(2009) 2044 - 2050),{0 是此種方法只是解決了絲素凝膠過慢的問題，其細(xì)胞相容性以及形成凝膠的結(jié)構(gòu)都還需要進(jìn)一步研究。聚乳酸(PLA)和聚二乙醇(PEG)的共聚物PLA-PEG-PLA水溶液能在接近人體溫度下產(chǎn)生溫度敏感的溶膠-凝膠化轉(zhuǎn)變，是被廣泛研究的一種水凝膠材料。其合成原料聚乳酸和聚乙二醇都具有良好的生物相容性，但由于其溫敏可逆物理交聯(lián)的性質(zhì)，決定了其形成的水凝膠機械性能較差缺陷。Christine Hiemstra, Zhiyuan Zhong等人通過合成PEG-PLA星形共聚物來改進(jìn)PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠機械性能較差的缺點(參見 Christine Hiemstra, Zhiyuan Zhong et al. Biomacromolecules 7(2006) 2790-2795), 但是PLA-PEG-PLA共聚物的生物相容性還沒有得到改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種水凝膠的制備方法，采用絲素蛋白和共聚物構(gòu)成水凝膠，改善水凝膠的機械性能、生物相容性，并且使水凝膠的制備時間可控。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種絲素蛋白/共聚物水凝膠的制備方法，包括以下步驟(1)將家蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析處理后形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 30%的絲素蛋白水溶液； 按照質(zhì)量比，丙交酯(LA)聚乙二醇(PEG)= 5 1 1 5，通過開環(huán)反應(yīng)制備聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)共聚物，其中聚乙二醇的重均分子量為400 10000 ；
(2)將聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)共聚物加入到絲素蛋白溶液，在 35 39°C下靜置至少5分鐘直至形成絲素蛋白/聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物水凝膠。優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(1)中，絲素蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為洲 6%;制備聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)共聚物時，按照質(zhì)量比，丙交酯(LA)聚乙二醇 (PEG) = 1 1 3，聚乙二醇的重均分子量為400 1000。上述技術(shù)方案中，當(dāng)制備的水凝膠作為藥物和生長因子緩釋載體時，步驟(1)中， 絲素蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為21 4%，制備聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)共聚物時，按照質(zhì)量比，丙交酯(LA)聚乙二醇(PEG)= 1 1 3，聚乙二醇的重均分子量為 400 1000 ；步驟⑵中，共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比在3 1 10 1。上述技術(shù)方案中，當(dāng)制備的水凝膠作為細(xì)胞培養(yǎng)支架或其他用途時，步驟(1)中， 絲素蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為4% 696，制備聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)共聚物時，按照質(zhì)量比，丙交酯(LA)聚乙二醇(PEG)= 0.8 1.2 1，聚乙二醇的重均分子量為800 1200 ；步驟O)中，共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比在1 3 1。上述技術(shù)方案中，形成水凝膠的時間一般為5 720分鐘，并且共聚物的濃度越大、PEG鏈段的比例越低、PEG鏈段的分子量越大、共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比越大，靜置形成水凝膠的時間越短。上述技術(shù)方案中，絲素蛋白溶液的濃度越大，靜置形成的水凝膠力學(xué)性能越好。本發(fā)明同時要求保護(hù)采用上述技術(shù)方案制備得到的水凝膠材料。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點
1.采用本發(fā)明所述制備方法制備得到的水凝膠具有良好的機械性能、生物相容性。2.本發(fā)明可以通過調(diào)整加入的PLA-PEG-PLA共聚物的濃度、PEG鏈段的比例和分子量的大小可調(diào)節(jié)水凝膠的凝固時間，還可以通過調(diào)整加入的絲素蛋白溶液的濃度調(diào)節(jié)水凝膠的力學(xué)性能。


圖1為實施例一中合成PLA-PEG-PLA共聚物的核磁共振譜圖2為實施例二中絲素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠的橫向剖面掃描電鏡圖； 圖3為實施例七中絲素蛋白水凝膠的細(xì)胞培養(yǎng)熒光顯微鏡圖； 圖4為實施例七中PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠的細(xì)胞培養(yǎng)熒光顯微鏡圖； 圖5為實施例七中絲素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠的細(xì)胞培養(yǎng)熒光顯微鏡圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實施例一
⑴天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 05%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純桑蠶絲素蛋白纖維。將該絲素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (質(zhì)量比)中恒溫80士2°C水浴鍋內(nèi)攪拌溶解獲得再生絲素蛋白水溶液。透析處理后形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為5%的絲素蛋白溶液。⑵以辛酸亞錫為催化劑，丙交酯和聚乙二醇(1000)以1:1的比例，在130°C油浴鍋中開環(huán)反應(yīng)M小時合成出pla-peg-pla共聚物，并對所得共聚物進(jìn)行核磁共振分析，得到圖1，由圖1可知pla-peg-pla共聚物制備成功。⑶將步驟⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物溶液和絲素蛋白溶液分別在37°C 左右靜置。5%絲素蛋白溶液形成水凝膠所需的凝膠時間約為一星期，而25%共聚物水凝膠的彈性回復(fù)率為1. 86%。實施例二
⑴天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 05%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純桑蠶絲素蛋白纖維。將該絲素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (質(zhì)量比)中恒溫80士2°C水浴鍋內(nèi)攪拌溶解獲得再生絲素蛋白水溶液。透析處理后形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為5%的絲素蛋白溶液。⑵以辛酸亞錫為催化劑，丙交酯和聚乙二醇(1000)以1:1的比例，在130°C油浴鍋中開環(huán)反應(yīng)M小時合成出PLA-PEG-PLA共聚物。⑶將步驟⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物加入到絲素蛋白溶液在37°C左右靜置。當(dāng)加入的PLA-PEG-PLA共聚物(分子量1000)與絲素蛋白質(zhì)量比為5:1時，制備水凝膠所需的凝膠時間約為15分鐘，所得水凝膠的彈性回復(fù)率為25. 23%。對所得絲素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠進(jìn)行橫向剖面電鏡掃描，得到圖2， 由圖2可知制備的水凝膠有一定的取向孔隙結(jié)構(gòu)，有望應(yīng)用于藥物和生長因子緩釋載體。實施例三
⑴天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 05%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純桑蠶絲素蛋白纖維。將該絲素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (質(zhì)量比)中恒溫80士2°C水浴鍋內(nèi)攪拌溶解獲得再生絲素蛋白水溶液。透析處理后形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為5%的絲素蛋白溶液。⑵以辛酸亞錫為催化劑，丙交酯和聚乙二醇(1000)以1:1的比例，在130°C油浴鍋中開環(huán)反應(yīng)M小時合成出PLA-PEG-PLA共聚物。⑶將步驟⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物加入到絲素蛋白溶液在37°C左右靜置。當(dāng)加入的PLA-PEG-PLA共聚物(分子量1000)與絲素蛋白質(zhì)量比為3:1時，制備水凝膠所需的凝膠時間約為50分鐘，所得水凝膠的彈性回復(fù)率為43. 25%。實施例四
⑴天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 05%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純桑蠶絲素蛋白纖維。將該絲素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (質(zhì)量比)中恒溫80士2°C水浴鍋內(nèi)攪拌溶解獲得再生絲素蛋白水溶液。透析處理后形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為3%的絲素蛋白溶液。⑵以辛酸亞錫為催化劑，丙交酯和聚乙二醇(1000)以1:1的比例，在130°C油浴鍋中開環(huán)反應(yīng)M小時合成出PLA-PEG-PLA共聚物。⑶將步驟⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物加入到絲素蛋白溶液在37°C左右靜置。當(dāng)加入的PLA-PEG-PLA共聚物(分子量1000)與絲素蛋白質(zhì)量比為8:1時，制備水凝膠所需的凝膠時間約為10分鐘，所得水凝膠的彈性回復(fù)率為11. 28%。實施例五
⑴天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 05%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純桑蠶絲素蛋白纖維。將該絲素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (質(zhì)量比)中恒溫80士2°C水浴鍋內(nèi)攪拌溶解獲得再生絲素蛋白水溶液。透析處理后形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為5%的絲素蛋白溶液。⑵以辛酸亞錫為催化劑，丙交酯和聚乙二醇(400)以1:1的比例，在130°C油浴鍋中開環(huán)反應(yīng)M小時合成出pla-peg-pla共聚物。⑶將步驟⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物加入到絲素蛋白溶液在37°C左右靜置。當(dāng)加入的PLA-PEG-PLA共聚物(分子量400)與絲素蛋白質(zhì)量比為5:1時，制備水凝膠所需的凝膠時間約為220分鐘，所得水凝膠的彈性回復(fù)率為25. 72%。實施例六
⑴天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 05%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純桑蠶絲素蛋白纖維。將該絲素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (質(zhì)量比)中恒溫80士2°C水浴鍋內(nèi)攪拌溶解獲得再生絲素蛋白水溶液。透析處理后形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為3%的絲素蛋白溶液。⑵以辛酸亞錫為催化劑，丙交酯和聚乙二醇(400)以1:3的比例，在130°C油浴鍋中開環(huán)反應(yīng)M小時合成出PLA-PEG-PLA共聚物。⑶將步驟⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物加入到絲素蛋白溶液在37°C左右靜置。當(dāng)加入的PLA-PEG-PLA共聚物(分子量400，比例1:3)與絲素蛋白質(zhì)量比為5:1 時，制備水凝膠所需的凝膠時間約為460分鐘，所得水凝膠的彈性回復(fù)率為20. 57%。實施例七
⑴將上述實施例一和例二中制備的絲素蛋白水凝膠，PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠和絲素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠均勻鋪在2X2cm的玻璃片上，輻照滅菌，密封保存，備用；
⑵將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)接種在材料上進(jìn)行細(xì)胞相容性實驗。OTH3T3細(xì)胞正常傳代，配置新鮮培液小牛血清馬血清高糖培養(yǎng)基=10 5 85 (體積比)；隨后按照 IXlO4 cell/ml的密度接種細(xì)胞在材料上，培養(yǎng)1 d，2 d，3 d，進(jìn)行H33258染色，熒光倒置顯微鏡(10*10)拍照觀察。⑶水凝膠的細(xì)胞培養(yǎng)熒光顯微鏡圖如附圖所示，圖3為絲素蛋白水凝膠，圖4為 PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠，圖5為絲素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠。圖中光點是黏附在水凝膠上生長的細(xì)胞核染色后發(fā)出，由圖可見，培養(yǎng)3天后細(xì)胞在絲素蛋白和絲素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠上正常黏附生長，并大量增殖到140和100個左右，但在 PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠上只有少量細(xì)胞黏附生長，大約7、個左右，基本上沒有增殖。 可見與PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠相比，絲素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠的細(xì)胞相容性更好，有望應(yīng)用于藥物和生長因子緩釋載體，細(xì)胞培養(yǎng)支架，軟組織修復(fù)等生物醫(yī)用方
權(quán)利要求
1.一種絲素蛋白/共聚物水凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將家蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析處理后形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 30%的絲素蛋白水溶液； 按照質(zhì)量比，丙交酯聚乙二醇=5 1 1 5，通過開環(huán)反應(yīng)制備聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物，其中聚乙二醇的重均分子量為400 10000 ；(2)將聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物加入到絲素蛋白溶液，在35 390C下靜置至少5分鐘直至形成絲素蛋白/聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物水凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述絲素蛋白/共聚物水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟(1) 中，絲素蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為21 6% ；制備聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物時，按照質(zhì)量比，丙交酯聚乙二醇=1 1 3，聚乙二醇的重均分子量為400 1000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述絲素蛋白/共聚物水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟(1) 中，絲素蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為21 4%，制備聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物時，按照質(zhì)量比，丙交酯聚乙二醇=1 1 3，聚乙二醇的重均分子量為400 1000;步驟(2) 中，共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比在3 10 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述絲素蛋白/共聚物水凝膠的制備方法，其特征在于，步驟(1) 中，絲素蛋白水溶液的質(zhì)量濃度為4% 6%，制備聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物時，按照質(zhì)量比，丙交酯聚乙二醇=0.8 1.2 1，聚乙二醇的重均分子量為800 1200 ；步驟 (2)中，共聚物與絲素蛋白的質(zhì)量比在1 3 1。
5.采用權(quán)利要求1、2、3或4所述絲素蛋白/共聚物水凝膠的制備方法制備得到的水凝膠材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種絲素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝膠的制備方法，包括以下步驟(1)制備絲素蛋白水溶液，聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物；(2)將共聚物加入到絲素蛋白溶液在35～39℃靜置形成水凝膠。采用本發(fā)明所述制備方法制備得到的水凝膠具有良好的機械性能、生物相容性；并且，本發(fā)明可以通過調(diào)整加入的PLA-PEG-PLA共聚物的濃度、PEG鏈段的比例和分子量的大小可調(diào)節(jié)水凝膠的凝固時間，還可以通過調(diào)整加入的絲素蛋白溶液的濃度調(diào)節(jié)水凝膠的力學(xué)性能。
文檔編號C08L67/04GK102174203SQ20111007692
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者左保齊, 鐘天翼 申請人:蘇州大學(xué)