專利名稱：一種豬硫酸軟骨素的提取工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種豬硫酸軟骨素的提取工藝，尤其涉及一種利用復合蛋白酶從豬軟 骨中提取硫酸軟骨素的方法，屬于生物工程領域。
背景技術：
硫酸軟骨素(Chondroition Sulfate, CS)是來自于動物軟骨組織的一類重要的酸 性黏多糖，屬于糖胺聚糖類物質(zhì)，主要分布于動物的軟骨、喉骨、鼻骨、牛、馬中膈和氣管中， 其他如腿骨、韌帶、皮膚、角膜等組織中也含有。硫酸軟骨素主要由D-葡萄糖醛酸和N-乙 酰-D-氨基半乳糖以β _1，3糖苷鍵連接形成二糖，而二糖單位之間以β_1，4糖苷鍵連接 形成生物大分子。根據(jù)結構中硫酸基的位置不同，可將硫酸軟骨素分為A、C、D、E、K、M、L等 多種異構體。硫酸軟骨素用途廣泛，可用做藥物，主要用在治療頭疼、偏頭痛的藥物中，可防治 因鏈霉素引起的聽覺障礙及肝炎的輔助治療，因其具有降血脂、抗凝血活性，也用于高血脂 癥、冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的防治。隨著對其理化性質(zhì)及生理功能研究的深 入，發(fā)現(xiàn)CS還具有抗炎、抗癌、抗HIV等活性，對神經(jīng)細胞、黏膜細胞、腎細胞等具有保護作 用，且CS無明顯的毒副作用。同時，硫酸軟骨素在食品、化妝品中的用途也很廣。目前，CS 生產(chǎn)工藝簡單，主要用堿提取，生產(chǎn)周期長，提取率低，顏色較深，質(zhì)量不穩(wěn)定，濃堿容易使 CS發(fā)生降解，影響其生物活性，并且廢料容易對環(huán)境造成污染。而酶法提取，提取率較高，純 度也較高，生產(chǎn)周期較短，提取條件溫和，無須脫色，無堿提取帶來的污染，是比較理想的制 備方法。我國是畜牧業(yè)發(fā)達的國家，隨著人民生活水平的提高，對肉、蛋、奶等傳統(tǒng)產(chǎn)品的 需求數(shù)量不斷增加，養(yǎng)殖業(yè)前景十分廣闊。但是動物屠宰后，占畜禽副產(chǎn)品比例很大的畜骨 沒有得到很好的利用。除用作動物飼料外，在食品中的應用很少。況且，與傳統(tǒng)的畜產(chǎn)品加 工業(yè)相比，如肉蛋奶的加工，相去甚遠。從普通畜骨創(chuàng)造高價值的產(chǎn)品，是我國畜產(chǎn)副產(chǎn)品 加工的薄弱環(huán)節(jié)，軟骨是動物骨骼中的一部分，其中的蛋白多糖具有廣泛的生理功能。硫酸 軟骨素是單瓣多糖的組成成分之一。近年來，CS大量出口美國或歐洲，已成為出口量最大的生化醫(yī)藥產(chǎn)品之一，年出口 量約2000噸，且相當部分外貿(mào)公司因得不到質(zhì)量合格產(chǎn)品而發(fā)愁。因此，研究新的生產(chǎn)工 藝及其工藝條件，使質(zhì)量穩(wěn)定和產(chǎn)率提高，進一步提高硫酸軟骨素的產(chǎn)率和純度，開展硫酸 軟骨素在國內(nèi)的應用研究和開拓市場將是很有意義的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前豬硫酸軟骨素的提取工藝主要為堿提取，生產(chǎn)周期長， 提取率低，顏色較深，質(zhì)量不穩(wěn)定，濃堿容易使硫酸軟骨素發(fā)生降解，影響其生物活性，并且 廢料容易對環(huán)境造成污染等問題，而提供一種豬硫酸軟骨素的提供工藝，縮短生產(chǎn)周期，提 高硫酸軟骨素的提取率和純度，降低生產(chǎn)成本。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下一種豬硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)預處理將新鮮的豬軟骨去油脂、肉渣，剪成長度為1 3. 5cm的小碎塊；(2)酶解將處理好的豬軟骨碎塊放入反應釜中，其中豬軟骨的質(zhì)量含水量為 75% 82%，按軟骨濕重料液體積比1 3 1 6 (kg/L)的比例加入蒸餾水，加入中重量 占軟骨碎塊濕重0. 4% -1. 2%的堿性復合蛋白酶，用堿溶液調(diào)節(jié)pH值至8. 0 9. 0，溫度控 制在45 65°C之間，機械攪拌4 12小時，得酶解液；(3)吸附脫色將步驟O)中的酶解液過濾或離心除渣，得濾液或上清液，用酸溶 液將濾液或上清液調(diào)節(jié)PH值至3 7，加入吸附劑攪拌吸附1 2小時，溫度控制在45 ^°C，趁熱過濾得吸附濾液；(4)蛋白鹽析將步驟(3)中的濾液，用酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4 6，按該濾液體積 的1 5% (kg/L)加入等重的硫酸鹽，繼續(xù)升溫并控制溫度在75 90°C，攪拌20 40分 鐘，使蛋白變性沉淀，停止加熱，趁熱過濾得濾液；(5)醇沉結晶將步驟(4)中的濾液用酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3 7，向濾液中加入體 積百分含量為95% 100%的乙醇，使乙醇的最終體積分數(shù)達到液體總體積的70 85%， 靜置沉淀8 12小時，得沉淀物；(6)真空干燥將步驟(5)中的沉淀物，用脫水劑洗滌3 5次，于55 65°C下真 空干燥6 12小時，粉碎即得所述硫酸軟骨素成品。優(yōu)選步驟(1)中所述的豬軟骨為豬鼻骨、喉骨、軟肋、氣管或月牙骨中的一種或多 種。優(yōu)選步驟O)中所述的堿液為氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，所述的堿液濃度為 1. 0 4. Omol/L O優(yōu)選步驟O)中所述的復合酶是胰蛋白酶與堿性內(nèi)切蛋白酶的復合，其質(zhì)量比為 1 1 1 5 ；或者是微生物堿性蛋白酶與堿性內(nèi)切蛋白酶的復合，其質(zhì)量比為1 1 1 4;或者是胰蛋白酶與微生物堿性蛋白酶的復合，其質(zhì)量比為1 1 1 5。優(yōu)選步驟(3)中所述的吸附劑為高嶺土和活性炭，高嶺土和活性炭所用質(zhì)量分別 占濾液體積0. 5% 3% (kg/L)和 5% (kg/L)等重。優(yōu)選步驟(3)、(4)和(5)中所述的酸為鹽酸或硫酸，酸溶液的濃度為2.0 6.0mol/Lo優(yōu)選步驟(4)中所用硫酸鹽為硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸銨。步驟(5)中所用脫水劑 為無水乙醇或丙酮。有益效果(1)利用堿性復合蛋白酶提取豬硫酸軟骨素，提取條件溫和，生產(chǎn)周期短，成本低， 減少堿的用量，同時減輕下游提純的難度，減輕了對環(huán)境的污染，易于工業(yè)化生產(chǎn)。(2)采用單因子實驗、析因?qū)嶒灐㈨憫娣治鰧嶒炏嘟Y合的靜態(tài)優(yōu)化方法，優(yōu)化提 取工藝，發(fā)現(xiàn)溫度、酶加量和PH值對硫酸軟骨素的提取率影響最為顯著。(3)并以上述三因素為自變量，以硫酸軟骨素的提取率為響應值，進行響應面法 分析，建立了提取條件與提取率之間的數(shù)學模型，通過響應面交互作用分析與優(yōu)化，確定了 適宜的硫酸軟骨素提取條件為酶解溫度為45 65°C，堿性復合蛋白酶的用量為0. 4% 1. 2%，pH 值為 8. 0 9. 0。(4)在較高溫度下，利用硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸銨進行鹽析，引起蛋白質(zhì)變性，能夠 使酶解液中的蛋白質(zhì)沉淀比較完全，提高了硫酸軟骨素的純度。
具體實施例方式以下結合實例來進一步解釋本發(fā)明，但實施案例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例1(1)預處理將新鮮的豬鼻骨去油脂、肉渣，剪成長度為2. Ocm的小碎塊；(2)酶解將處理好的含水率為82%的豬鼻骨5. Okg放入反應釜中，并加入20. OL 蒸餾水，加入0.04kg的胰蛋白酶與堿性內(nèi)切蛋白酶按質(zhì)量比為1 1復合的復合蛋白酶， 用3. Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8. 5，溫度控制在55°C，機械攪拌6小時，得到酶 解液；(3)吸附脫色將步驟(3)中的酶解液過濾，得濾液22. 6L，并用4. Omol/L鹽酸調(diào) 節(jié)pH值至6.0，加入0. Ilkg高嶺土和0. 68kg活性炭攪拌吸附1小時，溫度控制在50°C，趁 熱過濾得吸附濾液22. 0L；(4)蛋白鹽析將步驟(3)中的22. OL吸附濾液，用4. Omol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至 4. 0，加入0. 44kg的硫酸鈉，繼續(xù)升溫并控制溫度在80°C，攪拌30分鐘，使蛋白變性沉淀，停 止加熱，趁熱過濾得濾液21. 6L ；(5)醇沉結晶將步驟⑷中的21. 6L濾液用4. 0mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6. 0，加 入64. 8L無水乙醇至體積分數(shù)為75%，靜置沉淀8小時；(6)真空干燥將步驟(5)中的沉淀物，用無水乙醇洗滌3次，58°C下真空干燥8小 時，粉碎即得2. 05kg硫酸軟骨素成品。樣品檢測結果分析見表1。實施例2(1)預處理將新鮮的豬喉骨與氣管去油脂、肉渣，剪成長度為3. Ocm的小碎塊；(2)酶解將處理好的含水率為79%的豬喉骨與氣管碎塊8. Okg放入反應釜中，并 加入40. OL蒸餾水，加入0.08kg的微生物堿性蛋白酶與堿性內(nèi)切蛋白酶按質(zhì)量比為1 3 復合的復合蛋白酶，用1. 0mol/L的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至8. 0，溫度控制在58°C，機械 攪拌8小時，得到酶解液；(3)吸附脫色將步驟O)中的酶解液離心除渣，得上清液45. 0L，并用6. Omol/L 鹽酸調(diào)節(jié)PH值至4. 0，加入0. 68kg高嶺土和0. 90kg活性炭攪拌吸附1. 5小時，溫度控制在 47°C，趁熱過濾得吸附濾液44. 5L ；(4)蛋白鹽析將步驟(3)中的吸附濾液44. 5L，用6. Omol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至 6. 0，加入1. 78kg硫酸銨，繼續(xù)升溫并控制溫度在90°C，攪拌20分鐘，使蛋白變性沉淀，停止 加熱，趁熱過濾得濾液43. 8L；(5)醇沉結晶將步驟⑷中的43. 8L濾液，用6. Omol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7. 0，加 入184. 4L95%的乙醇至體積分數(shù)為80%，靜置沉淀9小時；(6)真空干燥將步驟(5)中的沉淀物，用丙酮洗滌5次，60°C下真空干燥10小時， 粉碎即得3. 36kg硫酸軟骨素成品。樣品檢測結果分析見表2。
實施例3(1)預處理將新鮮的豬軟肋與月牙骨去油脂、肉渣，剪成長度為1.5cm小碎塊；(2)酶解將處理好的含水率為75%的豬軟肋與月牙骨10. Okg放入反應釜中，并 加入30. OL蒸餾水，加入0.09kg的胰蛋白酶與微生物堿性蛋白酶按質(zhì)量比1 3復合的復 合蛋白酶，用2. Omol/L的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至8. 7，溫度控制在60°C，機械攪拌12小 時，得到酶解液；(3)吸附脫色將步驟O)中的酶解液過濾，得濾液35. 8L，用2. Omol/L硫酸調(diào)節(jié) pH值至5. 0，加入0. 72kg高嶺土和0. 54kg活性炭攪拌吸附2小時，溫度控制在45°C，趁熱 過濾得吸附濾液35. 2L ；(4)蛋白鹽析將步驟(3)中的35. 2L濾液，用2. Omol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至5. 0，加 入1. 06kg硫酸鉀，繼續(xù)升溫并控制溫度在75°C，攪拌40分鐘，使蛋白變性沉淀，停止加熱， 趁熱過濾得濾液34. 4L ；(5)醇沉結晶將步驟(4)中的34. 4L濾液，用2. 0mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至4. 5，加 入194. 9L無水乙醇至體積分數(shù)為85%，靜置沉淀12小時；(6)真空干燥將步驟(5)中的沉淀，用無水乙醇洗滌4次，65°C下真空干燥9小 時，粉碎即得4. 05kg硫酸軟骨素成品。樣品檢測結果分析見表3。實施例4(1)預處理將新鮮的豬喉骨去油脂、肉渣，剪成長度為2. 5cm的小碎塊；(2)酶解將處理好的含水率為80 %的豬喉骨碎塊15. Okg放入反應釜中，并加入 90. OL蒸餾水，加入0.18kg的微生物堿性蛋白酶與堿性內(nèi)切蛋白酶按質(zhì)量比為1 1復合 的復合蛋白酶，用4. 0mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至9. 0，溫度控制在50°C之間，機械攪拌 10小時，得酶解液；(3)吸附脫色將步驟⑵中酶解液離心除渣，得上清液120. 0L，用3. Omol/L硫酸 調(diào)節(jié)PH值至4. 5，加入0. 30kg高嶺土和0. 12kg活性炭攪拌吸附1小時，溫度控制在55°C， 趁熱過濾得吸附濾液119. 0L；(4)蛋白鹽析將步驟(3)中的119. OL濾液，用3. 0mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至5. 5， 加入0. 36kg硫酸鈉，繼續(xù)升溫并控制溫度在85°C，攪拌25分鐘，使蛋白變性沉淀，停止加 熱，趁熱過濾得濾液118. 0L；(5)醇沉結晶將步驟⑷中的118. OL濾液，用3. 0mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值至3. 5， 加入觀9. 8L95%的乙醇至體積分數(shù)為70%，靜置沉淀10小時；(6)真空干燥將步驟(5)中的沉淀，用丙酮洗滌4次，55°C下真空干燥12小時， 粉碎即得6. 12kg硫酸軟骨素成品。樣品檢測結果分析見表4。將上述提取工藝制得的硫酸軟骨素進行分析，結果如下表1實施例1樣品檢測結果分析
權利要求
1.一種豬硫酸軟骨素的提取工藝，其具體步驟如下(1)預處理將新鮮的豬軟骨去油脂、肉渣，剪成長度為1 3.5cm的小碎塊；(2)酶解將處理好的豬軟骨碎塊放入反應釜中，其中豬軟骨的質(zhì)量含水率為75% 82%，按軟骨濕重料液體積比1 3 1 6kg/L的比例加入蒸餾水，加入占軟骨碎塊濕重 0. 4% -1. 2%的堿性復合蛋白酶，用堿溶液調(diào)節(jié)pH值至8. 0 9. 0，溫度控制在45 65°C 之間，機械攪拌4 12小時，得酶解液；(3)吸附脫色將步驟O)中的酶解液過濾或離心除渣，得濾液或上清液，用酸溶液將 濾液或上清液調(diào)節(jié)PH值至3 7，加入吸附劑攪拌吸附1 2小時，溫度控制在45 55°C， 趁熱過濾得吸附濾液；(4)蛋白鹽析將步驟(3)中的濾液，用酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4 6，按該濾液體積的1 5% (kg/L)加入等重的硫酸鹽，繼續(xù)升溫并控制溫度在75 90°C，攪拌20 40分鐘，使蛋 白變性沉淀，停止加熱，趁熱過濾得濾液；(5)醇沉結晶將步驟(4)中的濾液用酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3 7，向濾液中加入體積質(zhì) 量百分濃度為95% 100%的乙醇，使乙醇的最終體積分數(shù)達到液體總體積的70 85%， 靜置沉淀8 12小時，得沉淀物；(6)真空干燥將步驟(5)中的沉淀物，用脫水劑洗滌3 5次，于55 65°C下真空干 燥6 12小時，粉碎即得所述硫酸軟骨素成品。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種豬硫酸軟骨素的提取工藝，其特征在于在步驟(1)中 所述的豬軟骨為豬鼻骨、喉骨、軟肋、氣管或月牙骨中的一種或多種。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種豬硫酸軟骨素的提取工藝，其特征在于在步驟O)中 所述的堿溶液為氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液；堿溶液的濃度為1. 0 4. 0mol/Lo
4.根據(jù)權利要求1所述的一種豬硫酸軟骨素的提取工藝，其特征在于在步驟O)中 所述的復合酶是胰蛋白酶與堿性內(nèi)切蛋白酶的復合，其質(zhì)量比為1 1 1 5;或者是微 生物堿性蛋白酶與堿性內(nèi)切蛋白酶的復合，其質(zhì)量比為1 1 1 4;或者是胰蛋白酶與 微生物堿性蛋白酶的復合，其質(zhì)量比為1 1 1 5。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種豬硫酸軟骨素的提取工藝，其特征在于在步驟(3)中 所述的吸附劑為高嶺土和活性炭；高嶺土和活性炭所用質(zhì)量分別占濾液體積的0.5% 3% kg/L 和 5% kg/L。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種豬硫酸軟骨素的提取工藝，其特征在于在步驟( 、(4) 和(5)中所述的酸溶液為鹽酸或硫酸溶液，酸溶液的濃度為2. 0 6. 0mol/Lo
7.根據(jù)權利要求1所述的一種豬硫酸軟骨素的提取工藝，其特征在于在步驟中 所用硫酸鹽為硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸銨。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種豬硫酸軟骨素的提取工藝，其特征在于在步驟(6)中 所用脫水劑為無水乙醇或丙酮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬硫酸軟骨素的提取工藝。該提取工藝包括原料的預處理、酶解、吸附脫色、蛋白鹽析、醇沉結晶、真空干燥等。本發(fā)明的方法以硫酸軟骨素的提取率為指標，采用單因子實驗、析因?qū)嶒灐㈨憫娣治鰧嶒炏嘟Y合的靜態(tài)優(yōu)化方法，優(yōu)化了提取工藝，工藝條件合理，具有良好的功效穩(wěn)定性。該法優(yōu)點是，只需要一步酶解反應即可把硫酸軟骨素從豬軟骨中提取出來，提取條件溫和、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品色澤潔白、提取率高、純度高、無堿提取帶來的污染，有利于環(huán)保，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C08B37/08GK102134288SQ20111009839
公開日2011年7月27日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權日2011年4月19日
發(fā)明者楊文革, 胡永紅, 陳召國 申請人:南京工業(yè)大學