專利名稱：人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是人體及其各種組織細(xì)胞的初始來源。它的研究受到了全世界政府和科學(xué)界的極大重視并已成為世界科學(xué)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的專利權(quán)和專有技術(shù)在生命科學(xué)、藥學(xué)、組織工程、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及醫(yī)療應(yīng)用領(lǐng)域中的潛在價(jià)值不可估量。多潛能干細(xì)胞(pluripotent stem cells)是一類既具有自我更新又具有全能性的干細(xì)胞。自我更新指多潛能干細(xì)胞能夠在體外進(jìn)行無限期的培養(yǎng)和傳代，通過細(xì)胞分裂擴(kuò)增出與自身相同的高度未分化細(xì)胞，維持自己的全能性而不會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而喪失。全能性指在一定的條件下，多潛能干細(xì)胞可以進(jìn)一步分化成各種成體細(xì)胞，進(jìn)而構(gòu)成機(jī)體的各種組織和器官。目前，最受關(guān)注的多潛能干細(xì)胞是(embryonic stem，ES)細(xì)胞和(induced ploiPS)細(xì)胞。ES細(xì)胞是前胚胎囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞在體外特定培養(yǎng)條件下得到的特殊細(xì)胞，理論上具有發(fā)育和分化成為機(jī)體內(nèi)幾乎所有組織細(xì)胞類型的潛能，故又稱為“萬能細(xì)胞”。典型的人體iPS細(xì)胞是采用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過將一組4個(gè)基因 (0ct3/4, Sox2, c-Myc,and Klf4)轉(zhuǎn)入皮膚成纖維細(xì)胞，使其重新編程逆轉(zhuǎn)到細(xì)胞分化前的狀態(tài)，具有與ES細(xì)胞類似的形態(tài)和功能的細(xì)胞。iPS細(xì)胞具有和ES細(xì)胞類似的功能，卻繞開了 ES細(xì)胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多障礙，因此在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊。iPS細(xì)胞作為生命科學(xué)、藥學(xué)、組織工程、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及醫(yī)療應(yīng)用領(lǐng)域研究中最有前景的種子細(xì)胞，將從根本上解決供體細(xì)胞來源不足的問題。體外培養(yǎng)人體iPS細(xì)胞的基本原則是最大限度地抑制分化，維持其自我更新性能，同時(shí)促進(jìn)其快速增殖及維持其正常的二倍體核型。iPS細(xì)胞只有保持未分化性能才具有全能性，所以涉及iPS細(xì)胞的所有研究都首先要以未分化iPS細(xì)胞作為研究起點(diǎn)的種子細(xì)胞，因此，獲取該種子細(xì)胞成為人體多潛能干細(xì)胞研究的關(guān)鍵。由于iPS細(xì)胞的建系效率只有0.02%，所以需要大量擴(kuò)增。目前，人體iPS細(xì)胞培養(yǎng)法的材料通過制備滋養(yǎng)層結(jié)構(gòu)，該滋養(yǎng)層結(jié)構(gòu)來進(jìn)行培養(yǎng)，在該方法中先將滋養(yǎng)層細(xì)胞在組織培養(yǎng)用聚苯乙烯板(tissue-culture polystyrene,TCPS)表面貼壁單層培養(yǎng)擴(kuò)增之后，再將多潛能性干細(xì)胞播種到滋養(yǎng)層細(xì)胞(目前大多使用受射線照射或絲裂霉素處理后胚胎鼠源成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞)之上培養(yǎng)的方法，該方法中人體iPS細(xì)胞培養(yǎng)依賴滋養(yǎng)層細(xì)胞。該方法存在以下問題(1)滋養(yǎng)層細(xì)胞的問題。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞生命期有限，不能在體外長(zhǎng)期傳代，且體外傳代次數(shù)增多，其產(chǎn)生抑制分化因子和促進(jìn)增殖因子的能力會(huì)減弱甚至喪失，在第3 5代時(shí)使用最好，所以只能過一段時(shí)間后解剖孕鼠提取，這增大了體外培養(yǎng)的工作量；( 細(xì)胞分離問題。在滋養(yǎng)層細(xì)胞上擴(kuò)增培養(yǎng)的人體iPS細(xì)胞克隆(cell colony，指圓形或橢圓形的細(xì)胞的聚集體，)需要在顯微鏡下用特殊的工具逐個(gè)挑選，操作難度大。因此，滋養(yǎng)層培養(yǎng)法不但存在操作繁瑣復(fù)雜、耗費(fèi)人力物力、效率低以及難以大量獲取的缺點(diǎn)，而且還存在著異種動(dòng)物交叉感染的危險(xiǎn)性。為了克服滋養(yǎng)層細(xì)胞帶來的問題，開發(fā)了以基質(zhì)膠(Matrigel)作為人體iPS細(xì)胞培養(yǎng)支架的制備方法，該方法制備的培養(yǎng)支架，由于基質(zhì)膠是一種天然水凝膠，主要成分包括層黏連蛋白和膠原IV，同時(shí)含有TGF-β成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，組織纖維酶原活化因子以及其它在Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)腫瘤中自然表達(dá)的生長(zhǎng)因子。在室溫下，Matrigel 可自動(dòng)聚集產(chǎn)生類似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基底膜的生物活性基質(zhì)材料。雖然使用方便，但其不但成分復(fù)雜且含有未知蛋白質(zhì)，依然存在異種動(dòng)物交叉感染的危險(xiǎn)性。因此，需要建立一套能夠達(dá)到安全簡(jiǎn)便且高效穩(wěn)定的人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的培養(yǎng)支架的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，由此制備方法制備出來的水凝膠細(xì)胞支架既不修飾任何從動(dòng)物體內(nèi)抽提的蛋白質(zhì)，也不涉及任何滋養(yǎng)層細(xì)胞的條件下，以合成高分子水凝膠為細(xì)胞培養(yǎng)支架，由于具有合成高分子水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、物理化學(xué)性能穩(wěn)定且易于調(diào)控、無異物感染且易于滅菌且廉價(jià)的優(yōu)勢(shì)，是安全培養(yǎng)人體多潛能干細(xì)胞的理想生物材料，由此能建立安全簡(jiǎn)便擴(kuò)增未分化人體iPS細(xì)胞的軟材料培養(yǎng)體系。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，步驟如下步驟1 首先制備電解質(zhì)高分子單體溶液，即將電解質(zhì)高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 50 1 100混合而得電解質(zhì)高分子單體溶液，溶劑為去離子水或PH值為 6. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液，電解質(zhì)高分子單體包括帶負(fù)電荷的丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸鈉、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、帶正電荷的丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨或者丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨；步驟2 制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍 1 100 1 200混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為去離子水或pH值為6. 0 8. 0 的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括甲基丙烯酸羥乙脂、甲基丙烯酸甲酯、N-乙烯基吡喏烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N，N' 二甲基丙烯酰胺；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質(zhì)高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質(zhì)高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 0.5 1 1.0混合均勻后，加入質(zhì)量濃度為1 10%的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯(lián)劑和質(zhì)量濃度為0. 1% 的2-氧代-1，5-戊二酸引發(fā)劑，其中電解質(zhì)高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0. 1 1 0.5，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.2 1 0.5，再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮?dú)饷撗?0分鐘后加入板狀合成模具中，再用365nm的紫外燈對(duì)板狀合成模具內(nèi)氮?dú)饷撗鹾蟮幕旌先芤涸谑覝叵抡丈?小時(shí)后，再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進(jìn)行高分子水凝膠pH值和離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應(yīng)單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑，然后將高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM泡，該 HEPES 緩沖溶液還包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強(qiáng)度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經(jīng)過12小時(shí)更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達(dá)到溶脹平衡，此時(shí)高分子水凝膠的離子強(qiáng)度和PH值與細(xì)胞培養(yǎng)液一致；步驟5:將達(dá)到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為
1.5mm-2mm的圓柱狀，在溫度為120°C條件下，經(jīng)過20分鐘高壓滅菌之后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板的孔中，這樣培養(yǎng)板和其上的高分子水凝膠就形成了人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支
^K O所述的板狀合成模具是由玻璃板圍成的框架結(jié)構(gòu)構(gòu)成的容器，且該框架結(jié)構(gòu)內(nèi)設(shè)置有硅膠墊，其長(zhǎng)寬高尺寸分別為10cm、IOcm以及0. Icm0本發(fā)明制備出來的制備出來的水凝膠細(xì)胞支架既不修飾任何從動(dòng)物體內(nèi)抽提的蛋白質(zhì)，也不涉及任何滋養(yǎng)層細(xì)胞的條件下，以合成高分子水凝膠為細(xì)胞培養(yǎng)支架，由于具有合成高分子水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、物理化學(xué)性能穩(wěn)定且易于調(diào)控、無異物感染且易于滅菌且廉價(jià)的優(yōu)勢(shì)，是安全培養(yǎng)人體多潛能干細(xì)胞的理想生物材料，由此能建立安全簡(jiǎn)便擴(kuò)增未分化人體iPS細(xì)胞的軟材料培養(yǎng)體系。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的說明。實(shí)施例1:人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，步驟如下步驟1 首先制備電解質(zhì)高分子單體溶液，即將電解質(zhì)高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 50混合而得電解質(zhì)高分子單體溶液，溶劑為去離子水的磷酸鹽緩沖溶液，電解質(zhì)高分子單體包括帶負(fù)電荷的丙烯酸；步驟2 制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍 1 100混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為pH值為6.0的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括甲基丙烯酸羥乙脂；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質(zhì)高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質(zhì)高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 0.5混合均勻后， 加入質(zhì)量濃度為1 %的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯(lián)劑和質(zhì)量濃度為0. 1 %的2-氧代-1， 5-戊二酸引發(fā)劑，其中電解質(zhì)高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0. 1，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.2， 再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮?dú)饷撗?0分鐘后加入板狀合成模具中，再用365nm的紫外燈對(duì)板狀合成模具內(nèi)氮?dú)饷撗鹾蟮幕旌先芤涸谑覝叵抡丈?小時(shí)后， 再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進(jìn)行高分子水凝膠pH值和離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應(yīng)單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑，然后將高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，該 HEPES 緩沖溶液還包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及
2.5 X IOVl的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強(qiáng)度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經(jīng)過12小時(shí)更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達(dá)到溶脹平衡，此時(shí)高分子水凝膠的離子強(qiáng)度和PH值與細(xì)胞培養(yǎng)液一致；步驟5 將達(dá)到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為1. 5mm的圓柱狀，在溫度為120°C條件下，經(jīng)過20分鐘高壓滅菌之后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板的孔中，這樣培養(yǎng)板和其上的高分子水凝膠就形成了人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架。所述的板狀合成模具是由玻璃板圍成的框架結(jié)構(gòu)構(gòu)成的容器，且該框架結(jié)構(gòu)內(nèi)設(shè)置有硅膠墊，其長(zhǎng)寬高尺寸分別為10cm、IOcm以及0. Icm0將Iml 2X IO4Cells細(xì)胞懸浮液滴加于人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的圓柱狀高分子水凝膠表面，逐滴將細(xì)胞懸浮液滴加于高分子水凝膠表面進(jìn)行接種，逐滴中的一滴小于等于0. 1ml，接種完后小心地移置于內(nèi)部溫度為37°C且其內(nèi)CO2體積比為 5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在移動(dòng)過程中避免搖動(dòng)，72小時(shí)后iPS細(xì)胞在高分子水凝膠表面形成了大量穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)致密的橢圓形克隆，長(zhǎng)軸的最大長(zhǎng)度為100ym-200ym，ALP染色結(jié)果為陽性。而作為對(duì)照組的在M孔板表面培養(yǎng)的細(xì)胞鋪展于材料表面，沒有出現(xiàn)克隆，ALP 染色結(jié)果全為陰性。說明水凝膠上培養(yǎng)的細(xì)胞仍然保持著未分化的特性。實(shí)施例2 人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，步驟如下步驟1 首先制備電解質(zhì)高分子單體溶液，即將電解質(zhì)高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 70混合而得電解質(zhì)高分子單體溶液，溶劑為pH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液，電解質(zhì)高分子單體包括甲基丙烯酸；步驟2 制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍 1 150混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為去離子水或pH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液， 中性高分子單體包括甲基丙烯酸甲酯；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質(zhì)高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質(zhì)高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 0.7混合均勻后， 加入質(zhì)量濃度為5%的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯(lián)劑和質(zhì)量濃度為0. 的2-氧代-1， 5-戊二酸引發(fā)劑，其中電解質(zhì)高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.2，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.3， 再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮?dú)饷撗?0分鐘后加入板狀合成模具中，再用365nm的紫外燈對(duì)板狀合成模具內(nèi)氮?dú)饷撗鹾蟮幕旌先芤涸谑覝叵抡丈?小時(shí)后， 再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進(jìn)行高分子水凝膠pH值和離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應(yīng)單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑，然后將高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，該 HEPES 緩沖溶液還包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強(qiáng)度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經(jīng)過12小時(shí)更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達(dá)到溶脹平衡，此時(shí)高分子水凝膠的離子強(qiáng)度和PH值與細(xì)胞培養(yǎng)液一致；步驟5:將達(dá)到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為 1. 5mm-2mm的圓柱狀，在溫度為120°C條件下，經(jīng)過20分鐘高壓滅菌之后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板的孔中，這樣培養(yǎng)板和其上的高分子水凝膠就形成了人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支
^K O所述的板狀合成模具是由玻璃板圍成的框架結(jié)構(gòu)構(gòu)成的容器，且該框架結(jié)構(gòu)內(nèi)設(shè)置有硅膠墊，其長(zhǎng)寬高尺寸分別為10cm、IOcm以及0. Icm0將Iml 2X IO4Cells細(xì)胞懸浮液滴加于人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的圓柱狀高分子水凝膠表面，逐滴將細(xì)胞懸浮液滴加于高分子水凝膠表面進(jìn)行接種，逐滴中的一滴小于等于0. 1ml，接種完后小心地移置于內(nèi)部溫度為37°C且其內(nèi)(X)2體積比為 5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在移動(dòng)過程中避免搖動(dòng)，80小時(shí)后iPS細(xì)胞在高分子水凝膠表面形成了大量穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)致密的橢圓形克隆，長(zhǎng)軸的最大長(zhǎng)度為100ym-200ym，ALP染色結(jié)果為陽性。而作為對(duì)照組的在M孔板表面培養(yǎng)的細(xì)胞鋪展于材料表面，沒有出現(xiàn)克隆，ALP 染色結(jié)果全為陰性。說明水凝膠上培養(yǎng)的細(xì)胞仍然保持著未分化的特性。實(shí)施例3 人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，步驟如下步驟1 首先制備電解質(zhì)高分子單體溶液，即將電解質(zhì)高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 100混合而得電解質(zhì)高分子單體溶液，溶劑為pH值為8. 0的磷酸鹽緩沖溶液， 電解質(zhì)高分子單體包括苯乙烯磺酸鈉；步驟2 制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍 1 200混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為pH值為8.0的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括N-乙烯基吡喏烷酮；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質(zhì)高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質(zhì)高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 1.0混合均勻后， 加入質(zhì)量濃度為10%的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯(lián)劑和質(zhì)量濃度為0. 的2-氧代-1， 5-戊二酸引發(fā)劑，其中電解質(zhì)高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.5，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.5， 再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮?dú)饷撗?0分鐘后加入板狀合成模具中，再用365nm的紫外燈對(duì)板狀合成模具內(nèi)氮?dú)饷撗鹾蟮幕旌先芤涸谑覝叵抡丈?小時(shí)后， 再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進(jìn)行高分子水凝膠pH值和離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應(yīng)單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑，然后將高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，該 HEPES 緩沖溶液還包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強(qiáng)度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經(jīng)過12小時(shí)更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達(dá)到溶脹平衡，此時(shí)高分子水凝膠的離子強(qiáng)度和PH值與細(xì)胞培養(yǎng)液一致；步驟5:將達(dá)到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為2mm的圓柱狀，在溫度為120°C條件下，經(jīng)過20分鐘高壓滅菌之后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板的孔中，這樣培養(yǎng)板和其上的高分子水凝膠就形成了人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架。所述的板狀合成模具是由玻璃板圍成的框架結(jié)構(gòu)構(gòu)成的容器，且該框架結(jié)構(gòu)內(nèi)設(shè)置有硅膠墊，其長(zhǎng)寬高尺寸分別為10cm、IOcm以及0. Icm0
將Iml 2X IO4Cells細(xì)胞懸浮液滴加于人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的圓柱狀高分子水凝膠表面，逐滴將細(xì)胞懸浮液滴加于高分子水凝膠表面進(jìn)行接種，逐滴中的一滴小于等于0. 1ml，接種完后小心地移置于內(nèi)部溫度為37°C且其內(nèi)(X)2體積比為 5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在移動(dòng)過程中避免搖動(dòng)，96小時(shí)后iPS細(xì)胞在高分子水凝膠表面形成了大量穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)致密的橢圓形克隆，長(zhǎng)軸的最大長(zhǎng)度為100ym-200ym，ALP染色結(jié)果為陽性。而作為對(duì)照組的在M孔板表面培養(yǎng)的細(xì)胞鋪展于材料表面，沒有出現(xiàn)克隆，ALP 染色結(jié)果全為陰性。說明水凝膠上培養(yǎng)的細(xì)胞仍然保持著未分化的特性。
權(quán)利要求
1.一種人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于，步驟如下步驟1 首先制備電解質(zhì)高分子單體溶液，即將電解質(zhì)高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 50 1 100混合而得電解質(zhì)高分子單體溶液，溶劑為去離子水或PH值為6.0 8.0的磷酸鹽緩沖溶液，電解質(zhì)高分子單體包括帶負(fù)電荷的丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸鈉、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、帶正電荷的丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、甲基丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨或者丙烯酰氧乙基二甲基芐基氯化銨；步驟2 制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍 1 100 1 200混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為去離子水或pH值為6. 0 8. 0 的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括甲基丙烯酸羥乙脂、甲基丙烯酸甲酯、N-乙烯基吡喏烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N，N' 二甲基丙烯酰胺；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質(zhì)高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質(zhì)高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 0.5 1 1.0混合均勻后，加入質(zhì)量濃度為1 10%的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯(lián)劑和質(zhì)量濃度為0. 的 2-氧代-1，5-戊二酸引發(fā)劑，其中電解質(zhì)高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0. 1 1 0.5，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.2 1 0.5，再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮?dú)饷撗?0分鐘后加入板狀合成模具中，再用365nm的紫外燈對(duì)板狀合成模具內(nèi)氮?dú)饷撗鹾蟮幕旌先芤涸谑覝叵抡丈?小時(shí)后，再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進(jìn)行高分子水凝膠pH值和離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應(yīng)單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑，然后將高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 緩沖溶液浸泡， 該 HEPES 緩沖溶液還包括 5X IO^3M 的 HEPESU. 55X IO^2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強(qiáng)度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經(jīng)過12小時(shí)更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達(dá)到溶脹平衡，此時(shí)高分子水凝膠的離子強(qiáng)度和PH值與細(xì)胞培養(yǎng)液一致；步驟5 將達(dá)到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為1. 5mm-2mm的圓柱狀，在溫度為120°C條件下，經(jīng)過20分鐘高壓滅菌之后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板的孔中，這樣培養(yǎng)板和其上的高分子水凝膠就形成了人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于板狀合成模具是由玻璃板圍成的框架結(jié)構(gòu)構(gòu)成的容器，且該框架結(jié)構(gòu)內(nèi)設(shè)置有硅膠墊，其長(zhǎng)寬高尺寸分別為10cm、IOcm以及0. Icm0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于，步驟如下步驟1 首先制備電解質(zhì)高分子單體溶液，即將電解質(zhì)高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 50混合而得電解質(zhì)高分子單體溶液，溶劑為去離子水的磷酸鹽緩沖溶液，電解質(zhì)高分子單體包括帶負(fù)電荷的丙烯酸；步驟2:制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 100混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為PH值為6. 0的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括甲基丙烯酸羥乙脂；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質(zhì)高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質(zhì)高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 0.5混合均勻后，加入質(zhì)量濃度為1 %的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯(lián)劑和質(zhì)量濃度為0. 1 %的2-氧代-1，5-戊二酸引發(fā)劑，其中電解質(zhì)高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為 1 0. 1，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.2，再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮?dú)饷撗?0分鐘后加入板狀合成模具中， 再用365nm的紫外燈對(duì)板狀合成模具內(nèi)氮?dú)饷撗鹾蟮幕旌先芤涸谑覝叵抡丈?小時(shí)后，再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進(jìn)行高分子水凝膠pH值和離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應(yīng)單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑，然后將高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 緩7中溶液浸泡， 該 HEPES 緩沖溶液還包括 5X KT3M 的 HEPESU. 55X KT2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強(qiáng)度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經(jīng)過12小時(shí)更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達(dá)到溶脹平衡，此時(shí)高分子水凝膠的離子強(qiáng)度和PH值與細(xì)胞培養(yǎng)液一致；步驟5 將達(dá)到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為1. 5mm的圓柱狀，在溫度為120°C條件下，經(jīng)過20分鐘高壓滅菌之后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板的孔中，這樣培養(yǎng)板和其上的高分子水凝膠就形成了人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于，步驟如下步驟1 首先制備電解質(zhì)高分子單體溶液，即將電解質(zhì)高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 70混合而得電解質(zhì)高分子單體溶液，溶劑為pH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液，電解質(zhì)高分子單體包括甲基丙烯酸；步驟2:制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 150 混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為去離子水或PH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括甲基丙烯酸甲酯；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質(zhì)高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質(zhì)高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 0.7混合均勻后，加入質(zhì)量濃度為5%的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯(lián)劑和質(zhì)量濃度為0. 1 %的2-氧代-1，5-戊二酸引發(fā)劑，其中電解質(zhì)高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為 1 0.2，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.3，再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮?dú)饷撗?0分鐘后加入板狀合成模具中， 再用365nm的紫外燈對(duì)板狀合成模具內(nèi)氮?dú)饷撗鹾蟮幕旌先芤涸谑覝叵抡丈?小時(shí)后，再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進(jìn)行高分子水凝膠pH值和離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應(yīng)單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑，然后將高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 緩7中溶液浸泡，該 HEPES 緩沖溶液還包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強(qiáng)度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經(jīng)過12小時(shí)更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達(dá)到溶脹平衡，此時(shí)高分子水凝膠的離子強(qiáng)度和PH值與細(xì)胞培養(yǎng)液一致；步驟5 將達(dá)到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為1. 5mm-2mm的圓柱狀，在溫度為120°C條件下，經(jīng)過20分鐘高壓滅菌之后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板的孔中，這樣培養(yǎng)板和其上的高分子水凝膠就形成了人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，其特征在于，步驟如下步驟1 首先制備電解質(zhì)高分子單體溶液，即將電解質(zhì)高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 100混合而得電解質(zhì)高分子單體溶液，溶劑為PH值為8.0的磷酸鹽緩沖溶液，電解質(zhì)高分子單體包括苯乙烯磺酸鈉；步驟2:制備中性高分子單體溶液，即將中性高分子單體和溶劑按質(zhì)量比范圍1 200 混合而得中性高分子單體溶液，溶劑為PH值為8. 0的磷酸鹽緩沖溶液，中性高分子單體包括N-乙烯基吡喏烷酮；步驟3 制備高分子水凝膠，即將制備而得的電解質(zhì)高分子單體溶液與中性高分子單體溶液按電解質(zhì)高分子單體與中性高分子單體的摩爾比范圍為1 1.0混合均勻后，加入質(zhì)量濃度為10%的N，N'-亞甲基雙丙酰胺交聯(lián)劑和質(zhì)量濃度為0. 1 %的2-氧代-1，5-戊二酸引發(fā)劑，其中電解質(zhì)高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為 1 0.5，而中性高分子單體和所述的N，N'-亞甲基雙丙酰胺的摩爾比范圍為1 0.5，再次混合均勻后將該混合溶液在避光條件下利用氮?dú)饷撗?0分鐘后加入板狀合成模具中， 再用365nm的紫外燈對(duì)板狀合成模具內(nèi)氮?dú)饷撗鹾蟮幕旌先芤涸谑覝叵抡丈?小時(shí)后，再單體聚合為高分子水凝膠；步驟4 進(jìn)行高分子水凝膠pH值和離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，即將所得的高分子水凝膠在去離子水中浸泡，除去高分子水凝膠中微量的未反應(yīng)單體、交聯(lián)劑及引發(fā)劑，然后將高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 緩7中溶液浸泡， 該 HEPES 緩沖溶液還包括 5X IO^3M 的 HEPESU. 55X IO^2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚紅，另外該HEPES緩沖溶液的離子強(qiáng)度I為0. 15M以及pH值為7. 4，并且每經(jīng)過12小時(shí)更新一次所述的HEPES緩沖溶液，直到高分子水凝膠達(dá)到溶脹平衡，此時(shí)高分子水凝膠的離子強(qiáng)度和PH值與細(xì)胞培養(yǎng)液一致；步驟5 將達(dá)到溶脹平衡的高分子水凝膠切成直徑為15mm且厚度范圍為2mm的圓柱狀，在溫度為120°C條件下，經(jīng)過20分鐘高壓滅菌之后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板的孔中，這樣培養(yǎng)板和其上的高分子水凝膠就形成了人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架。
全文摘要
一種人體iPS細(xì)胞未分化擴(kuò)增的水凝膠培養(yǎng)支架的制備方法，制備出來的制備出來的水凝膠細(xì)胞支架既不修飾任何從動(dòng)物體內(nèi)抽提的蛋白質(zhì)，也不涉及任何滋養(yǎng)層細(xì)胞的條件下，以合成高分子水凝膠為細(xì)胞培養(yǎng)支架，由于具有合成高分子水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、物理化學(xué)性能穩(wěn)定且易于調(diào)控、無異物感染且易于滅菌且廉價(jià)的優(yōu)勢(shì)，是安全培養(yǎng)人體多潛能干細(xì)胞的理想生物材料，由此能建立安全簡(jiǎn)便擴(kuò)增未分化人體iPS細(xì)胞的軟材料培養(yǎng)體系。
文檔編號(hào)C08F220/28GK102382797SQ20111019164
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者劉健康, 劉振齊, 陳詠梅 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)