專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速制備糖肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，涉及蛋白改性以及制備糖肽的方法，特別涉及一種多肽糖基化接枝的方法。
背景技術(shù)：
大部分天然蛋白質(zhì)都帶有共價(jià)鍵相連的多糖側(cè)鏈，糖蛋白以各種形式廣泛存在于動(dòng)植物和某些微生物中，它在生物體中起著很關(guān)鍵的作用，諸如細(xì)胞信號(hào)識(shí)別、生長(zhǎng)調(diào)控、 細(xì)胞間的信息傳達(dá)，及免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能。因此，糖蛋白引起了人們的廣泛關(guān)注。但分離純化糖蛋白很困難，靠基因工程技術(shù)制備也很受限制，所以在生化，免疫細(xì)胞生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究中必須通過(guò)化學(xué)合成糖蛋白的部分結(jié)構(gòu)——糖肽來(lái)作為模型分子，以供活性和構(gòu)效關(guān)系研究，糖肽合成也就應(yīng)運(yùn)而生。除此之外，糖肽具有明顯的抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、 抗缺氧、促進(jìn)多種細(xì)胞因子、抗乙肝病毒的產(chǎn)生和改善某些老年性疾病癥狀等作用。由于肽鏈較短，糖肽比糖蛋白有更優(yōu)越的乳化性質(zhì)，乳化穩(wěn)定性更好，可用作乳化劑、穩(wěn)定劑等。另外，作為一種生理活性肽，糖肽引起了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。近幾年生命科學(xué)家強(qiáng)烈建議把“大分子擁擠”環(huán)境與pH、離子強(qiáng)度和溶液組成等因素一樣用于研究生物大分子，加入擁擠物質(zhì)逐漸成為一種研究大分子的途徑，從而加深對(duì)分子間相互作用的了解。采用“大分子擁擠環(huán)境”作為溫和的反應(yīng)體系，將生命科學(xué)領(lǐng)域的擁擠理論應(yīng)用于糖基化接枝反應(yīng)中，當(dāng)體系中存在高濃度的生物大分子時(shí)，大分子之間的反應(yīng)遵循分子排斥容積理論，反應(yīng)向溶質(zhì)總體積減小的方向移動(dòng)，即朝結(jié)合方向移動(dòng)。大分子擁擠環(huán)境能夠使蛋白分子在水溶液中同樣處于非聚集或者較少聚集的反應(yīng)狀態(tài)，同時(shí)，促進(jìn)蛋白質(zhì)與多糖的反應(yīng)向著共價(jià)結(jié)合的方向進(jìn)行，所得產(chǎn)物具有優(yōu)越的功能性，有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。作為一種新的有效的方法，解決了傳統(tǒng)方法的弊端(申請(qǐng)?zhí)?201010237456. 1)。比如干熱法，干熱處理前原料水分含量應(yīng)較低，需要干燥，而且在反應(yīng)過(guò)程中需要保持恒定的溫度和濕度，通常是在60°C反應(yīng)1 3周，實(shí)驗(yàn)條件不容易控制，固相反應(yīng)中反應(yīng)物接觸不均勻，反應(yīng)不充分，產(chǎn)物通常帶有淺黃或淺棕的顏色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多肽糖基化接枝方法。本發(fā)明模擬生命科學(xué)領(lǐng)域的大分子擁擠體系，體系中的擁擠試劑可以是惰性高聚物或葡聚糖。該法具有操作方便、反應(yīng)時(shí)間短、所得糖肽功能性?xún)?yōu)越等優(yōu)點(diǎn)，克服了現(xiàn)有蛋白質(zhì)糖基化接枝改性方法難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的缺陷，產(chǎn)品在食品工業(yè)中具有規(guī)?；膽?yīng)用前景。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種快速制備糖肽的方法，包括如下步驟(1)將蛋白酶解成多肽，反應(yīng)結(jié)束后滅酶、離心、取上清液干燥；(2)模擬生命科學(xué)領(lǐng)域的大分子擁擠體系，將擁擠試劑置于反應(yīng)裝置中，加入緩沖溶液，使之充分溶解；
(3)將多糖和步驟(1)得到的多肽加入步驟O)的溶液中，充分?jǐn)嚢璩睾?，加?0. 02% w/w的NaN3防腐，5°C靜置過(guò)夜后，50_70°C攪拌l_8h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至低于 25°C，若擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇2000，則還要除去擁擠試劑；(4)最后離心、取上清液干燥，得到糖肽產(chǎn)品。優(yōu)選地，所述多肽與擁擠試劑的質(zhì)量比為1 1 1 8，多肽與多糖的質(zhì)量比為 1 0. 5 1 4。優(yōu)選地，步驟(1)所述蛋白為大豆分離蛋白、脫脂大豆粉、大豆?jié)饪s蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麥面筋蛋白。優(yōu)選地，步驟(1)所述酶為酸性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶或中性蛋白酶，所述酸性蛋白酶優(yōu)選胃蛋白酶，酶解程度控制在水解度DH < 2.0。優(yōu)選地，所述酶解程度控制是將蛋白配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液，加熱至37 55°C，加入酶，酶解30min，其中，酶與蛋白的質(zhì)量比為1 100。所述擁擠試劑為高分子惰性聚合物，優(yōu)選聚蔗糖70、聚乙二醇2000或葡聚糖。優(yōu)選地，所述多糖為葡聚糖、半乳甘露聚糖、卡拉膠和可溶性淀粉中的一種或者一種以上。優(yōu)選地，所述反應(yīng)裝置為帶恒溫加熱攪拌裝置的密閉容器。優(yōu)選地，所述緩沖溶液是pH5. 5 7. 5的磷酸鹽緩沖液。上述方法制備的糖肽應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)品、抗氧化劑、乳化劑或穩(wěn)定劑等食品添加劑行業(yè)。在食品工業(yè)中，高效率是一個(gè)重要的因素，縮短反應(yīng)時(shí)間可以更好的促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，提高生產(chǎn)效率。蛋白質(zhì)分子中加入酶制劑可以打開(kāi)肽鏈促進(jìn)接枝反應(yīng)的進(jìn)行，從而大大縮短反應(yīng)時(shí)間。采用蛋白酶水解蛋白，能夠有效地打開(kāi)蛋白大分子的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)，同時(shí)將蛋白的長(zhǎng)肽鏈切斷成中長(zhǎng)鏈，使更多的氨基基團(tuán)暴露出來(lái)，通過(guò)酶解蛋白再進(jìn)行糖基化接枝，此時(shí)的產(chǎn)物是糖肽。相對(duì)于球蛋白來(lái)說(shuō)，更多的肽鏈上氨基基團(tuán)與多糖的還原性羰基末端結(jié)合，使蛋白與多糖的Maillard反應(yīng)共價(jià)結(jié)合更為有效的進(jìn)行，縮短了反應(yīng)時(shí)間，所得糖肽比糖蛋白復(fù)合物的功能性更加優(yōu)越。糖肽同時(shí)具有促進(jìn)能量代謝，減肥，抗疲勞，增強(qiáng)肌肉爆發(fā)力、促進(jìn)雙歧桿菌繁殖、降膽固醇、抗過(guò)氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等生理活性功效。本發(fā)明利用蛋白適度酶解成多肽，再利用生命科學(xué)領(lǐng)域中大分子擁擠環(huán)境作為反應(yīng)介質(zhì)，添加擁擠試劑，使多肽和多糖發(fā)生Maillard反應(yīng)，得到具有優(yōu)越的功能性的糖肽共價(jià)結(jié)合物，該發(fā)明反應(yīng)時(shí)間短，操作方便。通過(guò)接枝改性，共價(jià)鍵合的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物既保留了蛋白質(zhì)的表面活性又具有多糖的親水性能，與以次級(jí)力結(jié)合的蛋白質(zhì)-多糖體系相比，對(duì)于環(huán)境條件具有較高的適應(yīng)性，其結(jié)合不受熱或PH值的影響。就乳化性能而言，這種復(fù)合物具有優(yōu)越的乳化性質(zhì)，因此在反應(yīng)過(guò)程中選用乳化活性作為檢測(cè)指標(biāo)。乳狀液中粒度分布是影響乳狀液穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，也是評(píng)價(jià)樣品乳化性的重要指標(biāo)，乳狀液粒子越大，乳析的速率越快，乳化活性越差。乳化活性采用D[4』來(lái)表征，D[4』越小，粒徑越小，乳化活性越強(qiáng)，反之亦然。本發(fā)明利用蛋白適度酶解成多肽，后采用“大分子擁擠環(huán)境”作為生成糖基化蛋白的反應(yīng)體系，使多肽與多糖的反應(yīng)向著共價(jià)結(jié)合的方向進(jìn)行，得到功能性糖肽結(jié)合物。作為功能性糖肽的新的有效的制備方法，具有如下的優(yōu)點(diǎn)
(1)在本發(fā)明中，先將蛋白進(jìn)行適度酶解，自由氨基暴露，特別是芳香族氨基酸暴露，加快了與多糖接枝反應(yīng)的進(jìn)程，提高了效率；(2)該發(fā)明在水溶液中攪拌加熱，克服了干熱反應(yīng)中反應(yīng)不均勻的缺點(diǎn)，不可控制的現(xiàn)象，最大程度地讓多糖和多肽充分接觸；(3)與其他接枝改性方法相比，本發(fā)明具有規(guī)?；膽?yīng)用前景，工業(yè)可操作性強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將大豆蛋白配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液，加熱至37°C，加入胃蛋白酶(酶蛋白質(zhì)量=1 100)，酶解30min后，加熱到100°C保溫:3min滅酶，離心(5000rpm, 20min), 取上清液凍干，此為大豆多肽。將1. Og葡聚糖作為擁擠試劑置于密閉容器中，加入IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩沖溶液，攪拌2h，使之充分溶解，將0. 5g大豆多肽和1. Og葡聚糖加入該含有擁擠試劑的溶液中，充分?jǐn)嚢璩睾?，加?滴NaN3 (0. 02% w/w)防腐，5°C 靜置過(guò)夜后，60°C攪拌4h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至25°C終止反應(yīng)，離心(8000rpm，20min)， 上清液冷凍干燥，得到糖肽產(chǎn)品。取上述糖肽產(chǎn)品制備乳液，分別靜置Id和30d后，采用Mastersizer 2000粒度分布儀測(cè)定體積平均粒徑D[4』的大小，結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)比實(shí)施例1將大豆蛋白配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的溶液，加熱到37°C，加入胃蛋白酶(酶蛋白質(zhì)量=1 100)，酶解30min,后加熱到100°C保溫3min滅酶，離心(5000rpm, 20min)，取上清液凍干，此為大豆多肽。準(zhǔn)確稱(chēng)取0. 5g多肽，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩沖溶液，容器密閉，室溫?cái)嚢韬?，加?滴NaN3 (0. 02% w/w)防腐，置于5°C過(guò)夜后， 恒溫60°C攪拌4h。反應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻至25°C終止反應(yīng)，離心(8000rpm，20min)，上清液冷凍干燥。取上述糖肽產(chǎn)品制備乳液，分別靜置Id和30d后，采用Mastersizer 2000粒度分布儀測(cè)定體積平均粒徑d[4』的大小，結(jié)果見(jiàn)表1。表1實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例1結(jié)合物的性能對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種快速制備糖肽的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將蛋白酶解成多肽，反應(yīng)結(jié)束后滅酶、離心、取上清液干燥；(2)將擁擠試劑置于反應(yīng)裝置中，加入緩沖溶液，使之充分溶解；(3)將多糖和步驟(1)得到的多肽加入步驟( 的溶液中，充分?jǐn)嚢璩睾?，加?.02% w/w的NaN3防腐，5°C靜置過(guò)夜后，50-70°C攪拌l_8h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至低于25°C，若擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇2000，則還要除去擁擠試劑；(4)最后離心、取上清液干燥，得到糖肽產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽與擁擠試劑的質(zhì)量比為1 1 1 8，多肽與多糖的質(zhì)量比為1 0. 5 1 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇 2000或葡聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述蛋白為大豆分離蛋白、脫脂大豆粉、大豆?jié)饪s蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或小麥面筋蛋白；所述酶為酸性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶或中性蛋白酶，酶解程度控制在水解度DH ^ 2. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶解程度控制是將蛋白配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的溶液，加熱至37 55°C，加入酶，酶解30min，其中，酶與蛋白的質(zhì)量比為 1 100。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述多糖為葡聚糖、半乳甘露聚糖、卡拉膠和可溶性淀粉中的一種或者一種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)裝置為帶恒溫加熱攪拌裝置的密閉容器。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述緩沖溶液是pH5.5 7. 5的磷酸鹽緩沖液。
9.一種快速制備的糖肽，其特征在于，該糖肽是由權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述方法制備的。
10.權(quán)利要求9所述的糖肽應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)品、抗氧化劑、乳化劑或穩(wěn)定劑中。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速制備糖肽的方法，包括如下步驟(1)將蛋白酶解成多肽，反應(yīng)結(jié)束后滅酶、離心、取上清液干燥；(2)將擁擠試劑置于反應(yīng)裝置中，加入緩沖溶液，使之充分溶解；(3)將多糖和步驟(1)得到的多肽加入步驟(2)的溶液中，充分?jǐn)嚢?h后，加入0.02％w/w的NaN3防腐，5℃靜置過(guò)夜后，50-70℃攪拌1-8h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至低于25℃，若擁擠試劑為聚蔗糖70、聚乙二醇2000，則還要除去擁擠試劑；(4)最后離心、取上清液干燥，得到糖肽產(chǎn)品。本發(fā)明操作方便，反應(yīng)時(shí)間短，反應(yīng)效率高，所得產(chǎn)物——糖肽具有優(yōu)越的功能性，產(chǎn)品在食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102308904SQ20111020343
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者卓秀英, 楊曉泉, 齊軍茹 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)