專利名稱：一種從長雙歧桿菌nq-1501中提取完整肽聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從長雙歧桿菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方法，尤其涉及一種應(yīng)用化學(xué)方法提取來自益生菌的完整肽聚糖的方法。
背景技術(shù)：
癌癥是威脅人類生命的重要疾病之一。世界衛(wèi)生組織和各國政府的衛(wèi)生部門都把攻克癌癥作為一項(xiàng)重要的工作。研究開發(fā)新型、高效的抗腫瘤新藥不僅具有良好的經(jīng)濟(jì)效益，更會(huì)帶來巨大的社會(huì)效益。一般情況下，抗腫瘤藥物因原料稀少或科技含量較高價(jià)格都很昂貴，因此研究生產(chǎn)出一種療效顯著、價(jià)格低廉的抗癌藥物是社會(huì)所需。國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過研究明確闡明長雙歧桿菌是生理性有益菌，它對維持人體健康起重要的作用，包括生物學(xué)屏蔽、合成多種維生素、控制內(nèi)毒素血癥、抑制腐敗細(xì)菌、致病菌在腸道中生長繁殖，提供營養(yǎng)，提高機(jī)體免疫力、預(yù)防和治療與抗生素有關(guān)的腹瀉、便秘、抗腫瘤、預(yù)防癌變、抗感染等。在以小鼠為模型的研究中表明長雙歧桿菌對肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌及艾氏腹水瘤等腫瘤具有一定的抑制作用。接下來的研究證明長雙歧桿菌的抑制腫瘤活性與其細(xì)胞壁中的完整肽聚糖密切相關(guān)，同時(shí)作為提取自長雙歧桿菌細(xì)胞壁的天然產(chǎn)物， 其不會(huì)有任何毒副作用關(guān)于完整肽聚糖的提取方法已有文獻(xiàn)報(bào)道，最早也是最為廣泛的提取方法是 1985年kkine研究兩歧雙歧桿菌對荷瘤小鼠腫瘤凋亡試驗(yàn)，從熱處理過的嬰兒雙歧桿菌 (B. infantis Reuter)中分離得到三種化學(xué)物質(zhì)，經(jīng)形態(tài)鑒定它們分別是具有生物活性的細(xì)胞壁制劑。分別是1)經(jīng)超聲波處理后的細(xì)胞破碎樣中提取出的細(xì)胞壁成分(CWS) ；2) 從完整細(xì)菌細(xì)胞分離、不經(jīng)過物理破碎、保持完整性的細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的物質(zhì)(WPG) ；3)用超聲波處理過的WPG，他們分別用這三種物質(zhì)給荷瘤小鼠皮下注射，研究這三種經(jīng)過不同方法提取的物理形態(tài)不同的細(xì)胞壁制劑的抗腫瘤效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種制劑都有不用程度的抑瘤效果，只有CWS沒有腫瘤凋亡活性。腫瘤凋亡活性證明細(xì)胞壁物理形態(tài)的完整程度與抑瘤作用大小成正相關(guān)性，完整程度高，活性就高，而抑瘤作用大小也與細(xì)胞壁的完整程度有關(guān)。Sekine等人的這個(gè)試驗(yàn)為后人對雙歧桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性與其抗腫瘤作用的相關(guān)性提供了有力的依據(jù)，物理結(jié)構(gòu)上具有完整性的細(xì)胞壁制劑也可能成為一種高效的體內(nèi)抗腫瘤藥物。1997年國內(nèi)的樂軍和胡宏首次用自己培養(yǎng)的雙歧桿菌1101采用kkine等人創(chuàng)立的提取雙歧桿菌完整肽聚糖的方法成功提取出此菌的完整肽聚糖，此后國內(nèi)很多關(guān)于雙歧桿菌完整肽聚糖所需樣品都由他們實(shí)驗(yàn)室提供。1998年國內(nèi)孟凡倫等參照Park等人提取肽聚糖的方法從SB900乳酸鏈球菌中提取出其細(xì)胞壁成分肽聚糖。2005年宋曉玲等在孟凡倫試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，在實(shí)驗(yàn)室提取出雙歧桿菌(Bifidobacterium thermopHi lum)的肽聚糖粗產(chǎn)品，采用此法一天即可由細(xì)菌培養(yǎng)物中獲取粗制肽聚糖。盡管他們用的方法比較簡單，時(shí)間短，但是所提取出的肽聚糖并不是完整肽聚糖?？偨Y(jié)上述幾種提取肽聚糖的方法，采用kkine等人建立的復(fù)合酶法提取雙歧桿菌完整肽聚糖，由于條件溫和整個(gè)純化過程中不使用任何物理和化學(xué)方法，能夠得到細(xì)胞骨架完整的肽聚糖。因?yàn)殡p歧桿菌的很多功能都與其細(xì)胞壁的完整性有關(guān)，特別是其抑制腫瘤作用和細(xì)胞凋亡活性功能，所以用這種方法提取的雙歧桿菌常用于肽聚糖結(jié)構(gòu)、組分分析和生物學(xué)功能的研究。但這種方法的缺點(diǎn)是試驗(yàn)步驟繁瑣、耗時(shí)長，一套流程結(jié)束至少需要2周以上的時(shí)間，在處理的過程中極容易污染，不能用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。而采用孟凡倫和宋曉玲等的三氯化乙酸裂解法制備的肽聚糖雖然具有制備方法簡單，步驟少，制備周期短，1-3天即可從細(xì)菌培養(yǎng)物中獲取粗制肽聚糖的優(yōu)點(diǎn)，但制備的肽聚糖空間結(jié)構(gòu)被破壞，其細(xì)胞壁骨架外形不再為袋狀結(jié)構(gòu)而呈皺褶緊縮狀，而且用此方法制得的完整肽聚糖純度較低。因此完整肽聚糖一直因?yàn)樘崛》椒]有突破而不能應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，因而也只能局限于實(shí)驗(yàn)室研究。而本發(fā)明制備完整肽聚糖的方法由于條件溫和，且整個(gè)純化過程中不使用任何物理與化學(xué)方法破壞細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，因此分離得到了細(xì)胞骨架完整的肽聚糖，通過透射電鏡觀察所提取到的細(xì)胞骨架呈袋狀結(jié)構(gòu)，這與kkine所報(bào)道的一致，但kkine法制備的肽聚糖雖然也完整，但因其周期長、步驟繁多，極易在提取過程中受到污染，僅停留在實(shí)驗(yàn)室提取完整肽聚糖階段。孟凡倫也曾采用TCA提取肽聚糖，其制備方法和步驟簡單，制備周期僅為3天，但因其TCA作用時(shí)間略長，所提取物是破壞了細(xì)胞壁完整結(jié)構(gòu)的粗肽聚糖，呈皺褶緊縮狀。雙歧桿菌的抗腫瘤作用與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)，其細(xì)胞壁是抑制腫瘤生長的主要成分，因此，完整肽聚糖的臨床試驗(yàn)必須要求保持細(xì)胞壁的完整結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有了關(guān)于完整肽聚糖制備方法的記載，例如“A new morphologically characterized cell wall preparaing(whole peptidoglycan)from Bifidobacterium infantis with a higher efficacy on the regression of an es tablished tumor in mice”，但是所述制備方法具有工藝復(fù)雜、操作周期長、不適合工業(yè)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)。本發(fā)明人在此發(fā)明申請之前對于完整肽聚糖的制備方法也有很長時(shí)間的研究，并且以論文或?qū)＠暾埖男问蕉啻伟l(fā)表過相應(yīng)成果。例如“長雙歧桿菌細(xì)胞壁完整肽聚糖分離鑒定的研究”，《食品與發(fā)酵工業(yè)》，相對于上面記載的國外技術(shù)已有了較大的改進(jìn)，但是但在整個(gè)生產(chǎn)周期上還是相對冗長，特別是酶解步驟需要耗時(shí)超過48個(gè)小時(shí)，這占到了整個(gè)制備過程的大部分時(shí)間，特別不利于大規(guī)模工藝生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量控制，并且需要用甲醇脫去TCA，溶劑使用量大，成本高。又例如，專利申請“2009102538723，一種完整肽聚糖及其制備方法”也是在上述期刊文獻(xiàn)基礎(chǔ)上的一個(gè)改進(jìn)技術(shù)，雖然已經(jīng)較大程度縮短了整個(gè)工藝周期，但是還是需要用甲醇脫去TCA，并且溶劑使用量大，并且所用的胃蛋白酶購買成本或制備成本相對于中性蛋白酶要高很多，從而造成整個(gè)工藝成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于能夠從益生菌長雙歧桿菌NQ-1501中提取完整肽聚糖，因所提取肽聚糖空間結(jié)構(gòu)完整，與不完整肽聚糖相比，更能有效抑制腫瘤生長，可廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物。
并且本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)周期短、溶劑使用少、生產(chǎn)成本低廉的完整肽聚糖制備方法。本發(fā)明的目的由如下技術(shù)方案實(shí)施通過脫脂去除細(xì)胞膜上的脂肪類物質(zhì)，再利用三氯乙酸抽提磷壁酸使細(xì)胞膜通透性增加，有利于下一步的酶更好的作用于細(xì)胞內(nèi)容物，然后用酶解液去除細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，最后通過離心清洗去除雜質(zhì)后凍干即獲得的完整肽聚糖，通過透射電鏡觀察可見其細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)完整。本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)施(1)菌體的洗滌取長雙歧桿菌NQ-1501菌株濕菌體100克，加入生理鹽水1000毫升混合均勻后， 8000克力離心10分鐘，棄去上清液，得到濕菌體；(2)脫脂步驟將所述長雙歧桿菌NQ-1501濕菌體與氯仿2000毫升混合均勻，在30°C下攪拌M 小時(shí)脫脂，8000克力離心10分鐘，棄去上清液，得到沉淀；(3)磷壁酸的去除取收集到的所述沉淀，與三氯乙酸1000毫升混合均勻后，于70°C水浴加熱4 小時(shí)，通過8000克力離心30分鐘，棄去上清液，取得沉淀物；(4)酶解a、配制酶解液pH7. 2Tris_鹽酸緩沖液1000毫升中分別加入胰蛋白酶和中性蛋白酶，調(diào)節(jié)酶濃度至250NFU/mL ；b、取所述沉淀物，加入酶解液中混合均勻，在30°C下攪拌12小時(shí)，通過8000克力離心30分鐘，棄去上清，收集沉淀；C、所述一次酶解沉淀物，加入無菌水1000毫升搖勻，8000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到清洗后的沉淀物；(5)凍干保存步驟所述清洗后的沉淀物，加入無菌水1000毫升搖勻，進(jìn)行真空冷凍干燥至白色絮狀粉末，即為長雙歧桿菌NQ-1501完整肽聚糖成品。一種從長雙歧桿菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方法，所述步驟(1)菌體的洗滌步驟中的所述長雙歧桿菌NQ-1501菌株，該菌株可從內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司公開銷
售中獲得。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、由于制備方法條件溫和、且整個(gè)純化過程中不使用任何物理與化學(xué)方法破壞細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，因此分離得到了細(xì)胞骨架完整的肽聚糖。因能提取完整肽聚糖，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，具有良好的抗腫瘤作用。2、本發(fā)明調(diào)整了脫脂和去磷壁酸的工藝步驟的先后順序，現(xiàn)有技術(shù)中均是先使用三氯乙酸除去磷壁酸，然后再用甲醇去三氯乙酸，然后再用丙酮進(jìn)行脫脂，從而造成需要使用較大量的甲醇，提高了生產(chǎn)成本，本發(fā)明發(fā)明人驚喜的發(fā)現(xiàn)當(dāng)先使用氯仿進(jìn)行脫脂，然后再使用三氯乙酸去除磷壁酸時(shí)并不需要事后使用甲醇，并且也不會(huì)影響后面的酶解步驟， 但是如果僅僅是調(diào)換了脫脂和除磷酸壁的順續(xù)，而仍舊使用丙酮進(jìn)行脫脂，則會(huì)對除磷酸壁產(chǎn)生影響。
3、本發(fā)明發(fā)明人還驚喜的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的脫脂和除磷酸壁后更有利于酶解的過程，在同樣使用胰蛋白酶和中性蛋白酶的情況下同樣可以以較短的時(shí)間獲得高品質(zhì)的產(chǎn)品，從而大大降低了生產(chǎn)成本。4、本發(fā)明的制備方法實(shí)用性強(qiáng)、操作簡單、周期短、步驟簡便合理，具有成本低、產(chǎn)率高、適宜規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明藥物，這些實(shí)施例僅用于舉例說明的目的，并沒有限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 通過脫脂去除細(xì)胞膜上的脂肪類物質(zhì)，然后再通過三氯乙酸抽提長雙歧桿菌 NQ-1501菌株的磷壁酸使細(xì)胞膜通透性增加，有利于外界物質(zhì)更好的作用于細(xì)胞內(nèi)容物，用酶解液去除細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，最后通過離心清洗去除雜質(zhì)后凍干即獲得的完整肽聚糖，通過透射電鏡觀察可見其細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)完整。長雙歧桿菌NQ-1501菌株可從內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司公開銷售中獲得。該完整肽聚糖的制備方法包括以下步驟(1)菌體的洗滌取長雙歧桿菌NQ-1501菌株濕菌體100克，加入生理鹽水1000毫升混合均勻后， 8000克力離心10分鐘，棄去上清液，得到濕菌體；(2)脫脂步驟將所述長雙歧桿菌NQ-1501濕菌體與氯仿2000毫升混合均勻，在30°C下攪拌M 小時(shí)脫脂，8000克力離心10分鐘，棄去上清液，得到沉淀；(3)磷壁酸的去除取收集到的所述沉淀，與1 %三氯乙酸1000毫升混合均勻后，于70°C水浴加熱4 小時(shí)，通過8000克力離心30分鐘，棄去上清液，取得沉淀物；(4)酶解a、配制酶解液pH7. 2Tris_鹽酸緩沖液1000毫升中分別加入胰蛋白酶和中性蛋白酶，調(diào)節(jié)酶濃度至250NFU/mL ；b、取所述沉淀物，加入酶解液中混合均勻，在30°C下攪拌12小時(shí)，通過8000克力離心30分鐘，棄去上清，收集沉淀；C、所述一次酶解沉淀物，加入無菌水1000毫升搖勻，8000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到清洗后的沉淀物；(5)凍干保存步驟所述清洗后的沉淀物，加入無菌水1000毫升搖勻，進(jìn)行真空冷凍干燥至白色絮狀粉末，即為長雙歧桿菌NQ-1501完整肽聚糖成品。實(shí)施例2 本發(fā)明公開的一種從長雙歧桿菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方的結(jié)構(gòu)完整性檢測將本發(fā)明實(shí)施例1中的原菌體及所制得的完整肽聚糖通過電鏡透視檢測。結(jié)果見附

圖1、2，完整肽聚糖仍保留原菌體的完整外部結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3 應(yīng)用壓片技術(shù)，以葡萄糖、乳糖、微晶纖維素、脫脂奶粉等輔料為原料制備顆粒，再混合完整肽聚糖粉末(實(shí)施例1獲得)及硬脂酸鎂進(jìn)行壓片，最終得到長雙歧桿菌NQ-1501 完整肽聚糖片劑。其生產(chǎn)辦法包括以下步驟(1)配制藥用輔料按葡萄糖0. 125克，微晶纖維素0.05克，羧甲淀粉鈉0.033克， 蔗糖0. 0025克，枸櫞酸0. 003克，脫脂奶粉0. 0625克，乳糖0. 1875克。(2)原料混合將完整肽聚糖34. 4克與上述輔料混合。然后加入硬脂酸鎂0. 0015 克，混合后便可得到直接壓片的原料。(3)壓片將混合的原料投入壓片機(jī)壓片。表1、完整肽聚糖片劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
外觀乳白色片劑微生物限度①非致病性雜菌總數(shù)<500CFU/克； ②真菌總數(shù)<70CFU/克； ③大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、志賀菌和沙門菌、金黃色葡萄菌不得檢出；理化指標(biāo)干燥失重< 6. 0%; 崩解時(shí)限<15分鐘； 重量差異0.5 ±0.5 χ 4%異常毒性從第1天灌胃起觀察至第7天,小鼠應(yīng)健康存活， 體重增加。實(shí)施例4:應(yīng)用膠囊技術(shù)，以乳糖、硬脂酸鎂等輔料為原料，再混合完整肽聚糖粉末(實(shí)施例 1獲得)，裝入明膠空心膠囊，最終得到長雙歧桿菌NQ-1501完整肽聚糖膠囊。其生產(chǎn)辦法包括以下步驟(1)配制藥用輔料乳糖25克。(2)原料混合將完整肽聚糖0. 85克與上述輔料混合。然后加入硬脂酸鎂0. 15 克，混合后便可得到原料。(3)包裝將混合的原料裝入明膠空心膠囊中。
表2、完整肽聚糖膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
1.一種從長雙歧桿菌NQ-1501中提取完整肽聚糖的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)菌體的洗滌取長雙歧桿菌NQ-1501菌株濕菌體100克，加入生理鹽水1000毫升混合均勻后，8000 克力離心10分鐘，棄去上清液，得到濕菌體；(2)脫脂步驟將所述長雙歧桿菌NQ-1501濕菌體與氯仿2000毫升混合均勻，在30°C下攪拌M小時(shí)脫脂，8000克力離心10分鐘，棄去上清液，得到沉淀；(3)磷壁酸的去除取收集到的所述沉淀，與1 %三氯乙酸1000毫升混合均勻后，于70°C水浴加熱4小時(shí)， 通過8000克力離心30分鐘，棄去上清液，取得沉淀物；(4)酶解a、配制酶解液pH7.2Tris-鹽酸緩沖液1000毫升中分別加入胰蛋白酶和中性蛋白酶， 調(diào)節(jié)各個(gè)酶濃度至250NFU/mL ；b、取所述沉淀物，加入酶解液中混合均勻，在30°C下攪拌12小時(shí)，通過8000克力離心 30分鐘，棄去上清，收集獲得一次酶解沉淀；c、在所述一次酶解沉淀物中加入無菌水1000毫升搖勻，8000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到清洗后的沉淀物；(5)凍干保存步驟在所述清洗后的沉淀物中加入無菌水1000毫升搖勻，進(jìn)行真空冷凍干燥至白色絮狀粉末，即得長雙歧桿菌NQ-1501完整肽聚糖成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法提取的長雙歧桿菌NQ-1501完整肽聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長雙歧桿菌NQ-1501完整肽聚糖制備的制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制劑，其中所述制劑是片劑、膠囊劑或散劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種長雙歧桿菌NQ-1501提取完整肽聚糖的方法，通過脫脂去除細(xì)胞膜上的脂肪類物質(zhì)，抽提磷壁酸使細(xì)胞膜通透性增加，用酶解液去除細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，最后通過離心清洗去除雜質(zhì)后凍干即獲得的完整肽聚糖。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提取的完整肽聚糖細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，具有良好的抗腫瘤作用；制備方法實(shí)用性強(qiáng)、操作簡單、周期短、步驟簡便合理，具有成本低、產(chǎn)率高、適宜規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還涉及由所述方法制備的完整肽聚糖及其進(jìn)而制備的藥物制劑。
文檔編號C08B37/00GK102321187SQ20111023189
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者付艷茹, 馮謙, 劉彥民, 劉斌, 夏少明, 張春霞, 韓至, 黃少磊, 龔虹 申請人:內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司