專利名稱：一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，特別涉及一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase)即三?；视王；饷?，其功能為催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶的基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈，其催化活性決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。天然的脂肪酶存在穩(wěn)定性差、易失活、無法重復(fù)利用，反應(yīng)后混入產(chǎn)品中，造成產(chǎn)物難分離、純度低、純化困難等問題，將其工業(yè)化生產(chǎn)仍存在著較大困難。研究發(fā)現(xiàn)，磁性固定化脂肪酶具有能回收、可反復(fù)使用、操作生能好、產(chǎn)物易分離、適用于大規(guī)格酶解反應(yīng)器等優(yōu)點(diǎn)，在生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用潛力。但是，磁性固定化脂肪酶活相對(duì)于游離酶要低，這是由于①所固定的酶蛋白的分子狀態(tài)都是游離狀態(tài)或自然狀態(tài)，游離狀態(tài)或自然狀態(tài)的酶分子在固定化過程與磁性固定化載體作用容易失活， 有時(shí)固定化酶的相對(duì)酶活僅為10% (相對(duì)酶活=固定化酶的酶活/所用游離酶的酶活 *100% )；②磁性固定化載體對(duì)酶的“活力稀釋”(dilution of activity)作用，即單位質(zhì)量固定化酶中酶的量大大減少了。針對(duì)這些問題，目前主要的改善措施包括通過優(yōu)化固定化條件來減少游離酶的失活，從而提高磁性固定化酶的活性；或者，采用納米級(jí)的磁性載體，增加比表面積，提高單位質(zhì)量固定化酶中酶的量。近十年間，出現(xiàn)一種嶄新的交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)技術(shù)，它是一種用鹽、有機(jī)溶劑或非離子型聚合物等沉淀酶蛋白制備酶聚集體，再用雙功能試劑對(duì)聚集體進(jìn)行交聯(lián)制備交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)的方法。與游離酶相比，CLEAs技術(shù)獲得的交聯(lián)酶聚集體穩(wěn)定性好、活性高，活性甚至可提高10倍以上。Cao等用非離子多聚體PEG沉淀青霉素G?；?，后通過戊二醛交聯(lián)，所得的CLEAs活力幾乎達(dá)到原酶活的100% (Cao L. Q.，Rantwijk F. V. Cross-linked enzyme aggregates :A simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase. Organic Letters,2000,2(10) :1361-1364.)。 Hubert等人釆用PEG為淀沉劑制備的交聯(lián)蟲漆酶聚集體呈現(xiàn)“超酶活”，酶的活力可達(dá)到游離酶活力的 130% (Hubert Cabana, J. Peter Jones，Spiros N. Agathos. Preparation and characterization of cross-linked laccase aggregates and their application to the elimination of endocrine disrupting chemicals. Journal of Biotechnology, 2007,132(1) :23-31. )。Sangeetha等人研究交聯(lián)枯草桿菌蛋白酶聚集體穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)酶聚集體表現(xiàn)更廣的pH、溫度適應(yīng)性(K. Sangeetha, T. Emilia, Abraham. Preparation and characterization of cross-linked enzyme aggregates (CLEA) of Subtilisin for controlled release applications·International Journal of Biological Macromolecules，2008，43 :314-319.)。但CLEAs的結(jié)構(gòu)相對(duì)而言比較疏散，其用于大規(guī)模酶反應(yīng)器的操作性能明顯差于磁性固定化酶。工業(yè)化大規(guī)模的酶反應(yīng)器為了讓底物與酶催化劑充分接觸，通常采用增加底物流體流動(dòng)的措施，這樣CLEAs的結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，降低CLEAs的酶活。如何獲得高酶活而操作性能好的磁性固化酶是酶生物催化工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵難題，是酶工業(yè)化應(yīng)用的瓶頸問題。磁性固化酶技術(shù)和交聯(lián)酶聚集體技術(shù)是酶固定化的兩種新技術(shù)，研究者對(duì)這兩種技術(shù)都分別在進(jìn)行著不斷地改善與完善工作。但是，由于兩種技術(shù)的自身的限制，將兩種技術(shù)相結(jié)合的酶固定化技術(shù)未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述制備方法得到的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。本發(fā)明的再一目的在于提供所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法，包含以下步驟(1)活化的磁性殼聚糖復(fù)合微球的制備用磷酸鹽緩沖液將磁性殼聚糖復(fù)合微球充分溶脹；接著加入戊二醛溶液進(jìn)行活化，戊二醛的最終體積濃度為0. 03 3. 0% ；(2)磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備將交聯(lián)脂肪酶聚集體置于磷酸鹽緩沖液中，充分振蕩，使交聯(lián)脂肪酶聚集體均勻分布在磷酸鹽緩沖液中；接著加入步驟(1)制備的活化的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體，于400 lOOOr/min的攪拌速度下交聯(lián)5 10小時(shí)；將液體和固體分離，取固體，蒸餾水洗滌，真空冷凍干燥，得到磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。所述的磷酸鹽緩沖液優(yōu)選為摩爾濃度0. 1 1. Omol/L.pH值5. 8 9. 0的磷酸鹽緩沖液；步驟(1)中所述的磁性殼聚糖復(fù)合微球優(yōu)選通過包含如下步驟的制備方法制備得到①將殼聚糖溶解在體積濃度為1. 0 3. 0%醋酸溶液中，得到均一透明的殼聚糖濃度為1. 0 4. 0%的膠體溶液；接著加入!^e3O4納米顆粒，F(xiàn)e3O4納米顆粒的用量相當(dāng)于前述膠體溶液中殼聚糖質(zhì)量的1/4 1，超聲作用下分散10 40min，得到分散均勻的磁性殼聚糖膠體溶液，放置待用；②配制含司班及吐溫的液體石蠟油相溶液；司班與吐溫按質(zhì)量比2 4 1配比， 液體石蠟占液體石蠟油相溶液的質(zhì)量百分比85 95% ；③將步驟①制備的磁性殼聚糖膠體溶液滴入在攪拌狀態(tài)下的液體石蠟油相溶液， 磁性殼聚糖膠體溶液與液體石蠟油相溶液按體積比1 2 4配比；接著攪拌10 40min 后迅速加入戊二醛溶液，控制戊二醛最終濃度為體積百分比0. 1 1. 0%，繼續(xù)攪拌40 120分鐘，調(diào)節(jié)pH值為8 12，于60 80°C條件下反應(yīng)60 120分鐘，最后經(jīng)磁鐵吸附， 洗滌，干燥，得到磁性殼聚糖復(fù)合微球。步驟①中所述的Fii3O4納米顆粒的粒徑范圍優(yōu)選為50 300nm ；步驟①中所述的超聲的頻率優(yōu)選為20 40KHz ；步驟②中所述的司班優(yōu)選為司班-80或司班-65 ；
步驟②中所述的吐溫優(yōu)選為吐溫-80或吐溫-65 ；步驟③中所述的洗滌優(yōu)選為依次用丙酮、石油醚、無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌；步驟③中所述的干燥優(yōu)選為真空干燥；步驟(1)中所述的充分溶脹為磁性殼聚糖復(fù)合微球溶脹至體積不再變大；步驟(1)中所述的磷酸鹽緩沖液的用量?jī)?yōu)選為按每Ig磁性殼聚糖復(fù)合微球配比 20 50mL磷酸鹽緩沖液計(jì)算；步驟(1)中所述的溶脹的時(shí)間優(yōu)選為10 M小時(shí)；步驟(1)中所述的戊二醛的用量?jī)?yōu)選為每IOg磁性殼聚糖復(fù)合微球使用1. 0 5. OmL戊二醛進(jìn)行活化；步驟O)中所述的交聯(lián)脂肪酶聚集體優(yōu)選通過包含如下步驟的制備方法制備得到A、將脂肪酶凍干酶粉溶解于磷酸鹽緩沖液中制成濃度為10 lOOmg/mL酶液，往酶液中滴加有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀，有機(jī)溶劑滴加完畢后于4 10°C下靜置0. 5 4. O小時(shí)，使脂肪酶沉淀；B、接著加入戊二醛溶液，控制戊二醛終濃度為體積百分比0. 1 5. 0%，于4 10°C下攪拌，使脂肪酶交聯(lián)2 5小時(shí)；將所得懸濁液的固體和液體分離，取固體，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌，直至上清液中檢不出脂肪酶，將固體進(jìn)行真空冷凍干燥，得到交聯(lián)脂肪酶聚集體。步驟A中所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選為叔丁醇、丙酮或乙腈中的一種或至少兩種；步驟A中所述的有機(jī)溶劑的濃度為質(zhì)量濃度50 100% ；步驟A中所述的有機(jī)溶劑的用量?jī)?yōu)選為每ImL酶液配比3 30mL有機(jī)溶劑；步驟B中所述的將所得懸濁液的固體和液體分離的方式優(yōu)選為離心；所述的離心的條件優(yōu)選為1500 4000rpm ；所述的磷酸鹽緩沖液優(yōu)選為摩爾濃度0. 1 1. Omol/L.pH值5. 8 9. 0的磷酸鹽緩沖液；步驟O)中所述的磷酸鹽緩沖液的用量?jī)?yōu)選為按每Ig交聯(lián)脂肪酶聚集體配比 10 IOOmg磷酸鹽緩沖液計(jì)算；步驟O)中所述的磁性殼聚糖復(fù)合微球和所述的交聯(lián)脂肪酶聚集體按質(zhì)量比 10 30 1配比；步驟O)中所述的交聯(lián)的溫度優(yōu)選為20 40°C ；步驟O)中所述的將液體和固體分離的方式優(yōu)選為離心；所述的離心的條件優(yōu)選為1500 4000rpm ；一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體，通過上述方法制備得到；所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活在80%以上，為80 85% ；所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體在食品領(lǐng)域、生物領(lǐng)域或醫(yī)藥領(lǐng)域中作為生物酶催化劑進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)本發(fā)明將CLEAs技術(shù)引入磁性固定化酶的制備，實(shí)現(xiàn)磁性載體顆粒大小與 CLEAs大小相匹配，從而將CLEAs替代游離酶固定在磁性固定化載體。這樣，不僅提高了磁性固定化酶的活力，而且改善CLEAs操作性能差的問題，從而獲得一種既具有較高酶活力， 同時(shí)又有良好操作性能的生物酶催化劑。(2)本發(fā)明所提供的制備方法成本低、易于操作，采用復(fù)合有機(jī)溶劑對(duì)酶液進(jìn)行沉淀，使酶保持了很高的活性，并且達(dá)到較好的沉淀效果；得到的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶性質(zhì)穩(wěn)定、可多次重復(fù)利用、適用于大規(guī)模酶反應(yīng)器。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1(1)制備交聯(lián)脂肪酶聚集體稱取脂肪酶凍干酶粉，將其溶解于pH = 5. 8，摩爾濃度為0. lmol/L的50mL磷酸鹽緩沖液中，制成lOmg/mL酶液。取2mL上述酶液置于試管中，并逐滴加入叔丁醇乙腈混合液(質(zhì)量濃度100%的叔丁醇和質(zhì)量濃度100%的乙腈按體積比1 1混合得到)6mL，于 4°C下靜置4. 0小時(shí)，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的終體積濃度為0. 1 %， 于4°C下攪拌5小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將所得懸濁液于3000rpm/min離心lOmin，將離心所得沉淀物用PH = 7. 0，摩爾濃度為0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液充分洗滌，直至上清液中檢不出脂肪酶，經(jīng)真空冷凍干燥，得到交聯(lián)脂肪酶聚集體。(2)制備磁性殼聚糖復(fù)合微球①將殼聚糖(殼聚糖脫乙酰度> 90%，粘度< lOOcps，購(gòu)于上海伯奧生物科技有限公司=溶解在體積濃度為1.0%醋酸溶液中配成均一透明的殼聚糖質(zhì)量濃度為1.0%的膠體溶液，再加入粒徑為IOOnm的!^e3O4納米顆粒O^e3O4顆粒殼聚糖=1 4(w/w))，在 30KHz條件下超聲分散30min，得到分散均勻的磁性殼聚糖膠體溶液，放置待用。②配制含司班及吐溫的液體石蠟油相溶液(司班-802. 4g，吐溫-801. 2g，液體石蠟 80mL)。③緩慢攪拌下將步驟①制備的的磁性殼聚糖膠體溶液滴入步驟②制備的液體石蠟油相溶液中，磁性殼聚糖膠體溶液與液體石蠟油相溶液的體積比為1 4，攪拌IOmin后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為0. 1 %，繼續(xù)攪拌40分鐘，調(diào)節(jié)pH值為 8，并將體系在60°C條件下反應(yīng)60min，最后在磁鐵吸附下得到磁性殼聚糖復(fù)合微球，依次用丙酮、石油醚、無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌，真空干燥得到磁性殼聚糖復(fù)合微球。(3)制備磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體①稱取步驟(1)中制備的交聯(lián)脂肪酶聚集體0. lg，置于10mL，pH = 7. 0，摩爾濃度為0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)充分振蕩使聚集體均勻分布。②取2. Og步驟O)中制備的磁性殼聚糖復(fù)合微球，加到100mL，pH = 7. 0，摩爾濃度為0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡10小時(shí)，用4mL體積濃度為0. 的戊二醛進(jìn)行活化 (戊二醛終濃度為0.03%)。③將上述聚集體及磁性殼聚糖復(fù)合微球充分混合，在溫度20°C下不斷振蕩5小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，于2000rpm/min離心lOmin，用蒸餾水充分洗滌，真空冷凍干燥，得到磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。經(jīng)國(guó)標(biāo)(GB/T23535-2009)中橄欖油乳化法檢測(cè)，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活為80. 2%。每次反應(yīng)結(jié)束后在外加磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行固液分離，將磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體用蒸餾水洗滌三次后，重新加入底物進(jìn)入下一輪反應(yīng)，如此重復(fù)測(cè)定10 次以后，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活仍保留75. 3%。實(shí)施例2(1)制備交聯(lián)脂肪酶聚集體稱取脂肪酶凍干酶粉，將其溶解于pH = 9. 0，摩爾濃度為1. Omol/L的50mL磷酸鹽緩沖液中，制成lOOmg/mL酶液。取2mL上述酶液置于試管中，并逐滴加入叔丁醇丙酮混合液 (質(zhì)量濃度50%的叔丁醇和質(zhì)量濃度50%的丙酮按體積比1 1混合得到)60mL，于10°C 下靜置0. 5小時(shí)，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為5. 0%，于 10°C下攪拌2小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將所得懸濁液在2000rpm/min的條件下離心lOmin，將離心所得沉淀物用PH = 7. 0，摩爾濃度為1. Omol/L磷酸鹽緩沖液充分洗滌，直至上清液中檢不出脂肪酶，經(jīng)真空冷凍干燥，得到交聯(lián)脂肪酶聚集體。(2)制備磁性殼聚糖復(fù)合微球①將殼聚糖溶解在體積濃度為3. 0%醋酸溶液中配成均一透明的殼聚糖質(zhì)量濃度為4. 0%的膠體溶液，再加入粒徑為IOOnm的!^e3O4納米顆粒(F^O4顆粒殼聚糖= 1 l(w/V))，在20KHz條件下超聲分散40min，得到分散均勻的磁性殼聚糖膠體溶液，放置待用。②配制含司班及吐溫的液體石蠟油相溶液(司班-802. 4g，吐溫-801. 2g，液體石蠟 80mL)。③緩慢攪拌下將步驟①制備的的磁性殼聚糖膠體溶液滴入步驟②制備的液體石蠟油相溶液中，磁性殼聚糖膠體溶液與液體石蠟油相溶液的體積比為1 2，攪拌40min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為1.0%，繼續(xù)攪拌120分鐘，調(diào)節(jié)pH值為 12，并將體系在80°C條件下反應(yīng)120min，最后在磁鐵吸附下得到磁性殼聚糖復(fù)合微球，依次用丙酮、石油醚、無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌，真空干燥得到磁性殼聚糖復(fù)合微球。(3)制備磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體①稱取步驟(1)中制備的交聯(lián)脂肪酶聚集體0. lg，置于10mL，pH = 5. 8，摩爾濃度為0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)充分振蕩使聚集體均勻分布。②取2. Og步驟O)中制備的磁性殼聚糖復(fù)合微球，加到40mL，pH = 5. 8，摩爾濃度為0. lmol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡M小時(shí)，直接加入14mL體積濃度為5. 0%的戊二醛進(jìn)行活化(戊二醛終濃度為3. 0% )。③將上述聚集體及磁性殼聚糖復(fù)合微球充分混合，在溫度40°C下不斷振蕩10小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，在2000rpm/min的條件下離心lOmin，用蒸餾水充分洗滌，真空冷凍干燥，得到磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。經(jīng)國(guó)標(biāo)(GB/T23535-2009)中橄欖油乳化法檢測(cè)，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活為81. 9%。每次反應(yīng)結(jié)束后在外加磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行固液分離，將磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體用蒸餾水洗滌三次后，重新加入底物進(jìn)入下一輪反應(yīng)，如此重復(fù)測(cè)定10 次以后，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活仍保留77. 2%。實(shí)施例3(1)制備交聯(lián)脂肪酶聚集體
稱取脂肪酶凍干酶粉，將其溶解于pH = 6. 0，摩爾濃度為0. 8mol/L的50mL磷酸鹽緩沖液中，制成40mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于試管中，并逐滴加入乙腈丙酮混合液(質(zhì)量濃度90%的乙腈和質(zhì)量濃度90%的丙酮按體積比1 1混合得到)20mL，于6°C 下靜置3. 0小時(shí)，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為質(zhì)量濃度 0. 09%，于6°C下攪拌4小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將所得懸濁液在3000rpm/min的條件下離心 lOmin，將離心所得沉淀物用pH = 7. 0，摩爾濃度為0. 4mol/L磷酸鹽緩沖液充分洗滌，直至上清液中檢不出脂肪酶，經(jīng)真空冷凍干燥，得到交聯(lián)脂肪酶聚集體。(2)制備磁性殼聚糖復(fù)合微球①將殼聚糖溶解在體積濃度為2. 0%醋酸溶液中配成均一透明的殼聚糖質(zhì)量濃度為4. 0%的膠體溶液，再加入粒徑為IOOnm的!^e3O4納米顆粒(狗304顆粒殼聚糖= 1 2(w/w))，在30KHz條件下超聲分散40min，得到分散均勻的磁性殼聚糖膠體溶液，放置待用。②配制含司班及吐溫的液體石蠟油相溶液(司班-6 . 8g，吐溫-651. 2g，液體石蠟 80mL)。③緩慢攪拌下將步驟①制備的的磁性殼聚糖膠體溶液滴入步驟②制備的液體石蠟油相溶液中，磁性殼聚糖膠體溶液與液體石蠟油相溶液的體積比為1 3，攪拌20min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為0. 4%，繼續(xù)攪拌80分鐘，調(diào)節(jié)pH值為 10，并將體系在65°C條件下反應(yīng)90min，最后在磁鐵吸附下得到磁性殼聚糖復(fù)合微球，依次用丙酮、石油醚、無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌，真空干燥得到磁性殼聚糖復(fù)合微球。(3)制備磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體①稱取步驟(1)中制備的交聯(lián)脂肪酶聚集體0. lg，置于10mL，pH = 8. 0，摩爾濃度為0. 8mol/L磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)充分振蕩使聚集體均勻分布。②取2. Og步驟O)中制備的磁性殼聚糖復(fù)合微球，加到70mL，pH = 8. 0，摩爾濃度為0. 8mol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡16小時(shí)，用4mL體積濃度為2. O %的戊二醛進(jìn)行活化 (戊二醛終濃度為0. 57%)。③將上述聚集體及磁性殼聚糖復(fù)合微球充分混合，在溫度30°C下不斷振蕩6小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，在2000rpm/min的條件下離心lOmin，用蒸餾水充分洗滌，真空冷凍干燥，得到磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。經(jīng)國(guó)標(biāo)(GB/T23535-2009)中橄欖油乳化法檢測(cè)，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活為83. 2%。每次反應(yīng)結(jié)束后在外加磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行固液分離，將磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體用蒸餾水洗滌三次后，重新加入底物進(jìn)入下一輪反應(yīng)，如此重復(fù)測(cè)定15 次以后，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活仍保留76. 1%。實(shí)施例4(1)制備交聯(lián)脂肪酶聚集體稱取脂肪酶凍干酶粉，將其溶解于pH = 7. 0，摩爾濃度為0. 5mol/L的50mL磷酸鹽緩沖液中，制成60mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于試管中，并逐滴加入乙腈丙酮混合液 (質(zhì)量濃度90%的乙腈和質(zhì)量濃度90%的丙酮按體積比1 1混合得到)20mL和丙酮溶液 (質(zhì)量濃度為85% )30mL，于8°C下靜置2. O小時(shí)，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為質(zhì)量濃度2. 5%，于8°C下攪拌3小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將所得懸濁液在2000rpm/min的條件下離心lOmin，將離心所得沉淀物用pH = 8. 0，摩爾濃度為0. 8mol/L 磷酸鹽緩沖液充分洗滌，直至上清液中檢不出脂肪酶，經(jīng)真空冷凍干燥，得到交聯(lián)脂肪酶聚集體。(2)制備磁性殼聚糖復(fù)合微球①將殼聚糖溶解在體積濃度為2. 5%醋酸溶液中配成均一透明的殼聚糖質(zhì)量濃度為3. 2%的膠體溶液，再加入粒徑為IOOnm的!^e3O4納米顆粒(F^O4顆粒殼聚糖= 1 3(w/w))，在30KHz條件下超聲分散40min，得到分散均勻的磁性殼聚糖膠體溶液，放置待用。②配制含司班及吐溫的液體石蠟油相溶液(司班-803. 6g，吐溫-801. 2g，液體石蠟 80mL)。③緩慢攪拌下將步驟①制備的的磁性殼聚糖膠體溶液滴入步驟②制備的液體石蠟油相溶液中，磁性殼聚糖膠體溶液與液體石蠟油相溶液的體積比為1 3，攪拌35min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為0. 6%，繼續(xù)攪拌100分鐘，調(diào)節(jié)pH值為 11，并將體系在70°C條件下反應(yīng)80min，最后在磁鐵吸附下得到磁性殼聚糖復(fù)合微球，依次用丙酮、石油醚、無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌，真空干燥得到磁性殼聚糖復(fù)合微球。(3)制備磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體①稱取步驟(1)中制備的交聯(lián)脂肪酶聚集體0. lg，置于10mL，pH = 7.0，摩爾濃度為0. 7mol/L磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)充分振蕩使聚集體均勻分布。②取2. Og步驟O)中制備的磁性殼聚糖復(fù)合微球，加到50mL，pH = 7. 0，摩爾濃度為0. 7mol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡20小時(shí)，用4mL體積濃度為3. O %的戊二醛進(jìn)行活化 (戊二醛終濃度為O. 85% )0③將上述聚集體及磁性殼聚糖復(fù)合微球充分混合，在溫度35°C下不斷振蕩8小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，在2000rpm/min的條件下離心lOmin，用蒸餾水充分洗滌，真空冷凍干燥，得到磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。經(jīng)國(guó)標(biāo)(GB/T23535-2009)中橄欖油乳化法檢測(cè)，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活為82. 5%。每次反應(yīng)結(jié)束后在外加磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行固液分離，將磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體用蒸餾水洗滌三次后，重新加入底物進(jìn)入下一輪反應(yīng)，如此重復(fù)測(cè)定10 次以后，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活仍保留76. 5%。實(shí)施例5(1)制備交聯(lián)脂肪酶聚集體稱取脂肪酶凍干酶粉，將其溶解于pH = 6. 5，摩爾濃度為0. 7mol/L的50mL磷酸鹽緩沖液中，制成85mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于試管中，并逐滴加入叔丁醇溶液(質(zhì)量濃度為75% )24mL，于5°C下靜置3. 5小時(shí)，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為質(zhì)量濃度3. 0%，于6. 5°C下攪拌3. 5小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將所得懸濁液在 2000rpm/min的條件下離心lOmin，將離心所得沉淀物用pH = 6. 0，摩爾濃度為0. 7mol/L磷酸鹽緩沖液充分洗滌，直至上清液中檢不出脂肪酶，經(jīng)真空冷凍干燥，得到交聯(lián)脂肪酶聚集體。(2)制備磁性殼聚糖復(fù)合微球①將殼聚糖溶解在體積濃度為1. 5%醋酸溶液中配成均一透明的殼聚糖質(zhì)量濃度為2. 5%的膠體溶液，再加入粒徑為IOOnm的!^e3O4納米顆粒O^e3O4顆粒殼聚糖= 1 3(w/w))，在30KHz條件下超聲分散40min，得到分散均勻的磁性殼聚糖膠體溶液，放置待用。②配制含司班及吐溫的液體石蠟油相溶液(司班-652. 4g，吐溫-651. 2g，液體石蠟 80mL)。③緩慢攪拌下將步驟①制備的的磁性殼聚糖膠體溶液滴入步驟②制備的液體石蠟油相溶液中，磁性殼聚糖膠體溶液與液體石蠟油相溶液的體積比為1 2，攪拌25min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為0. 7%，繼續(xù)攪拌65分鐘，調(diào)節(jié)pH值為 10，并將體系在80°C條件下反應(yīng)90min，最后在磁鐵吸附下得到磁性殼聚糖復(fù)合微球，依次用丙酮、石油醚、無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌，真空干燥得到磁性殼聚糖復(fù)合微球。(3)制備磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體①稱取步驟(1)中制備的交聯(lián)脂肪酶聚集體0. lg，置于10mL，pH = 8. 0，摩爾濃度為0. 6mol/L磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)充分振蕩使聚集體均勻分布。②取2. Og步驟O)中制備的磁性殼聚糖復(fù)合微球，加到80mL，pH = 8. 0，摩爾濃度為0. 6mol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡18小時(shí)，用4mL體積濃度為2. 0 %的戊二醛進(jìn)行活化 (戊二醛終濃度為0. 57%)。③將上述聚集體及磁性殼聚糖復(fù)合微球充分混合，在溫度25°C下不斷振蕩6小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，在2000rpm/min的條件下離心lOmin，用蒸餾水充分洗滌，真空冷凍干燥，得到磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。經(jīng)國(guó)標(biāo)(GB/T23535-2009)中橄欖油乳化法檢測(cè)，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活為75. 1%。每次反應(yīng)結(jié)束后在外加磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行固液分離，將磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體用蒸餾水洗滌三次后，重新加入底物進(jìn)入下一輪反應(yīng)，如此重復(fù)測(cè)定10 次以后，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活仍保留70. %。對(duì)比實(shí)施例1(1)制備脂肪酶溶液稱取脂肪酶凍干酶粉，將其溶解于pH = 6. 5，摩爾濃度為0. 7mol/L的50mL磷酸鹽緩沖液中，制成85mg/mL酶液，放置待用。(2)制備磁性殼聚糖復(fù)合微球①將殼聚糖溶解在體積濃度為1.5%醋酸溶液中配成均一透明的殼聚糖質(zhì)量濃度為2. 5%的膠體溶液，再加入粒徑為IOOnm的!^e3O4納米顆粒(F^O4顆粒殼聚糖= 1 3(w/w))，在30KHz條件下超聲分散40min，得到分散均勻的磁性殼聚糖膠體溶液，放置待用。②配制含司班及吐溫的液體石蠟油相溶液(司班-652. 4g，吐溫-651. 2g，液體石蠟 80mL)。③緩慢攪拌下將步驟①制備的的磁性殼聚糖膠體溶液滴入步驟②制備的液體石蠟油相溶液中，磁性殼聚糖膠體溶液與液體石蠟油相溶液的體積比為1 2，攪拌25min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為0. 7%，繼續(xù)攪拌65分鐘，調(diào)節(jié)pH值為 10，并將體系在80°C條件下反應(yīng)90min，最后在磁鐵吸附下得到磁性殼聚糖復(fù)合微球，依次用丙酮、石油醚、無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌，真空干燥得到磁性殼聚糖復(fù)合微球。
(3)制備磁性固定化脂肪酶①取步驟(1)中制備的脂肪酶液1. 17mL。②取2. Og步驟O)中制備的磁性殼聚糖復(fù)合微球，加到80mL，pH = 8. 0，摩爾濃度為0. 6mol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡18小時(shí)，用4mL體積濃度為2. 0 %的戊二醛進(jìn)行活化 (戊二醛終濃度為0. 57%)。③將上述脂肪酶液及磁性殼聚糖復(fù)合微球充分混合，在溫度25°C下不斷振蕩6小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，在2000rpm/min的條件下離心lOmin，用蒸餾水充分洗滌，真空冷凍干燥，得到磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。經(jīng)國(guó)標(biāo)(GB/T23535-2009)中橄欖油乳化法檢測(cè)，磁性固定化脂肪酶的相對(duì)酶活為40. 1%。每次反應(yīng)結(jié)束后在外加磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行固液分離，將固定化酶用蒸餾水洗滌三次后，重新加入底物進(jìn)入下一輪反應(yīng)，如此重復(fù)測(cè)定10次以后，磁性固定化脂肪酶的相對(duì)酶活仍保留35.7%。對(duì)比實(shí)施例2(1)制備交聯(lián)脂肪酶聚集體稱取脂肪酶凍干酶粉，將其溶解于pH = 7. 0，摩爾濃度為0. 5mol/L的50mL磷酸鹽緩沖液中，制成60mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于試管中，并逐滴加入乙腈丙酮混合液 (質(zhì)量濃度90%的乙腈和質(zhì)量濃度90%的丙酮按體積比1 1混合得到)20mL和丙酮溶液 (質(zhì)量濃度為85% )30mL，于8°C下靜置2. O小時(shí)，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為質(zhì)量濃度12. 5%，于8°C下攪拌3小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將所得懸濁液在2000rpm/min的條件下離心lOmin，將離心所得沉淀物用pH = 8. 0，摩爾濃度為0. 8mol/L 磷酸鹽緩沖液充分洗滌，直至上清液中檢不出脂肪酶，經(jīng)真空冷凍干燥，得到交聯(lián)脂肪酶聚集體。(2)制備磁性殼聚糖復(fù)合微球①將殼聚糖溶解在體積濃度為2. 5%醋酸溶液中配成均一透明的殼聚糖質(zhì)量濃度為3. 2%的膠體溶液，再加入粒徑為IOOnm的!^e3O4納米顆粒(F^O4顆粒殼聚糖= 1 3(w/w))，在30KHz條件下超聲分散40min，得到分散均勻的磁性殼聚糖膠體溶液，放置待用。②配制含司班及吐溫的液體石蠟油相溶液(司班-803. 6g，吐溫-801. 2g，液體石蠟 80mL)。③緩慢攪拌下將步驟①制備的的磁性殼聚糖膠體溶液滴入步驟②制備的液體石蠟油相溶液中，磁性殼聚糖膠體溶液與液體石蠟油相溶液的體積比為1 3，攪拌35min后迅速加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為0. 6 %，繼續(xù)攪拌100分鐘，調(diào)節(jié)pH值為 11，并將體系在70°C條件下反應(yīng)80min，最后在磁鐵吸附下得到磁性殼聚糖復(fù)合微球，依次用丙酮、石油醚、無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌，真空干燥得到磁性殼聚糖復(fù)合微球。(3)制備磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體①稱取步驟(1)中制備的交聯(lián)脂肪酶聚集體0. lg，置于10mL，pH = 7.0，摩爾濃度為0. 7mol/L磷酸鹽緩沖液中，經(jīng)充分振蕩使聚集體均勻分布。②取2. Og步驟O)中制備的磁性殼聚糖復(fù)合微球，加到50mL，pH = 7. 0，摩爾濃度為0. 7mol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡20小時(shí)，用4mL體積濃度為3. O %的戊二醛進(jìn)行活化(戊二醛終濃度為0.85%)。③將上述聚集體及磁性殼聚糖復(fù)合微球充分混合，在溫度35°C下不斷振蕩8小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)，在2000rpm/min的條件下離心lOmin，用蒸餾水充分洗滌，真空冷凍干燥，得到磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。經(jīng)國(guó)標(biāo)(GB/T23535-2009)中橄欖油乳化法檢測(cè)，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活為50. 5%。每次反應(yīng)結(jié)束后在外加磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行固液分離，將磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體用蒸餾水洗滌三次后，重新加入底物進(jìn)入第二輪反應(yīng)，如此重復(fù)測(cè)定10 次以后，磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活仍保留46. 3%。對(duì)比實(shí)施例3(1)制備交聯(lián)脂肪酶聚集體稱取脂肪酶凍干酶粉，將其溶解于pH = 7. 0，摩爾濃度為0. 5mol/L的50mL磷酸鹽緩沖液中，制成60mg/mL酶液。取2mL上述酶液置于試管中，并逐滴加入乙腈丙酮混合液 (質(zhì)量濃度90%的乙腈和質(zhì)量濃度90%的丙酮按體積比1 1混合得到)20mL和丙酮溶液 (質(zhì)量濃度為85 % ) 30mL,于8°C下靜置2. O小時(shí)，使脂肪酶沉淀，后加入戊二醛溶液，使戊二醛的最終體積濃度為質(zhì)量濃度2. 5%，于8°C下攪拌3小時(shí)進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將所得懸濁液在2000rpm/min的條件下離心lOmin，將離心所得沉淀物用pH = 8. 0，摩爾濃度為0. 8mol/L 磷酸鹽緩沖液充分洗滌，直至上清液中檢不出脂肪酶，經(jīng)真空冷凍干燥，得到交聯(lián)脂肪酶聚集體。經(jīng)國(guó)標(biāo)(GB/T23535-2009)中橄欖油乳化法檢測(cè)，交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活為90.5%。每次反應(yīng)結(jié)束后，將含有交聯(lián)脂肪酶聚集體的混合液在eOOOrmp/min的條件下， 離心分離，將分離后得到的交聯(lián)脂肪酶聚集體用蒸餾水洗滌三次后，重新加入底物進(jìn)入下一輪反應(yīng)，如此重復(fù)測(cè)定5次。交聯(lián)脂肪酶聚集體的相對(duì)酶活僅保留56. 3%。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)活化的磁性殼聚糖復(fù)合微球的制備用磷酸鹽緩沖液將磁性殼聚糖復(fù)合微球充分溶脹；接著加入戊二醛溶液進(jìn)行活化，戊二醛的最終體積濃度為0. 03 3. 0% ；(2)磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備將交聯(lián)脂肪酶聚集體置于磷酸鹽緩沖液中，充分振蕩，使交聯(lián)脂肪酶聚集體均勻分布在磷酸鹽緩沖液中；接著加入步驟(1)制備的活化的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體，于400 lOOOr/min的攪拌速度下交聯(lián)5 10小時(shí)；將液體和固體分離，取固體，蒸餾水洗滌，真空冷凍干燥，得到磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于所述的磷酸鹽緩沖液為濃度0. 1 1. Omol/L、pH值5. 8 9. 0的磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的磁性殼聚糖復(fù)合微球通過包含如下步驟的制備方法制備得到①將殼聚糖溶解在體積濃度為ι.O 3. 0%醋酸溶液中，得到均一透明的殼聚糖濃度為1. 0 4. 0%的膠體溶液；接著加入!^e3O4納米顆粒，F(xiàn)e3O4納米顆粒的用量相當(dāng)于前述膠體溶液中殼聚糖質(zhì)量的1/4 1，超聲作用下分散10 40min，得到分散均勻的磁性殼聚糖膠體溶液，放置待用；②配制含司班及吐溫的液體石蠟油相溶液；司班與吐溫按質(zhì)量比2 4 1配比，液體石蠟占液體石蠟油相溶液的質(zhì)量百分比85 95% ；③將步驟①制備的磁性殼聚糖膠體溶液滴入在攪拌狀態(tài)下的液體石蠟油相溶液，磁性殼聚糖膠體溶液與液體石蠟油相溶液按體積比1 2 4配比；接著攪拌10 40min后加入戊二醛溶液，控制戊二醛最終濃度為體積百分比0. 1 1. 0%，繼續(xù)攪拌40 120分鐘， 調(diào)節(jié)pH值為8 12，于60 80°C條件下反應(yīng)60 120分鐘，最后經(jīng)磁鐵吸附，洗滌，干燥， 得到磁性殼聚糖復(fù)合微球。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于步驟①中所述的I^e3O4納米顆粒的粒徑范圍為50 300nm ；步驟①中所述的超聲的頻率為20 40KHz ；步驟②中所述的司班為司班-80或司班-65 ；步驟②中所述的吐溫為吐溫-80或吐溫-65 ；步驟③中所述的洗滌為依次用丙酮、石油醚、無水乙醇和蒸餾水反復(fù)洗滌；步驟③中所述的干燥為真空干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的磷酸鹽緩沖液的用量為按每Ig磁性殼聚糖復(fù)合微球配比20 50mL磷酸鹽緩沖液計(jì)算；步驟(1)中所述的溶脹的時(shí)間為10 M小時(shí)；步驟(1)中所述的戊二醛的用量為每IOg磁性殼聚糖復(fù)合微球使用1. 0 5. OmL戊二醛進(jìn)行活化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于步驟O)中所述的交聯(lián)脂肪酶聚集體為通過包含如下步驟的制備方法制備得到A、將脂肪酶凍干酶粉溶解于磷酸鹽緩沖液中制成濃度為10 lOOmg/mL酶液，往酶液中滴加有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀，有機(jī)溶劑滴加完畢后于4 10°C下靜置0. 5 4. 0小時(shí)，使脂肪酶沉淀；B、接著加入戊二醛溶液，控制戊二醛終濃度為體積百分比0. 1 5. 0%，于4 10°C下攪拌，使脂肪酶交聯(lián)2 5小時(shí)；將所得懸濁液的固體和液體分離，取固體，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌，直至上清液中檢不出脂肪酶，將固體進(jìn)行真空冷凍干燥，得到交聯(lián)脂肪酶聚集體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于步驟A中所述的有機(jī)溶劑為叔丁醇、丙酮或乙腈中的一種或至少兩種；步驟A中所述的有機(jī)溶劑的濃度為質(zhì)量濃度50 100% ；步驟A中所述的有機(jī)溶劑的用量為每ImL酶液配比3 30mL有機(jī)溶劑；步驟B中所述的將所得懸濁液的固體和液體分離的方式為離心；所述的磷酸鹽緩沖液為濃度0. 1 1. Omol/L、pH值5. 8 9. 0的磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法，其特征在于 步驟O)中所述的磷酸鹽緩沖液的用量為按每Ig交聯(lián)脂肪酶聚集體配比10 IOOmg磷酸鹽緩沖液計(jì)算；步驟O)中所述的磁性殼聚糖復(fù)合微球和所述的交聯(lián)脂肪酶聚集體按質(zhì)量比10 30 1配比；步驟O)中所述的交聯(lián)的溫度為20 40°C ； 步驟O)中所述的將液體和固體分離的方式為離心。
9.一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體，通過權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的制備方法得到。
10.權(quán)利要求9所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體的應(yīng)用，其特征在于所述的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體作為生物酶催化劑進(jìn)行應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明首先通過將交聯(lián)脂肪酶聚集體置于磷酸鹽緩沖液中，充分振蕩，使交聯(lián)脂肪酶聚集體均勻分布在磷酸鹽緩沖液中；接著加入戊二醛活化的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體，交聯(lián)；將液體和固體分離，取固體，洗滌，真空冷凍干燥，得到相對(duì)酶活在80％以上的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體。本發(fā)明的制備方法成本低、易于操作。本發(fā)明通過磁性固化酶技術(shù)和交聯(lián)酶聚集體技術(shù)有機(jī)結(jié)合，不僅提高了磁性固定化酶的活力，而且改善CLEAs操作性能差的問題，得到的既具有較高酶活力又有良好操作性能的磁性固定化交聯(lián)脂肪酶聚集體性質(zhì)穩(wěn)定，能作為生物酶催化劑廣泛應(yīng)用，特別適用于大規(guī)模酶反應(yīng)器。
文檔編號(hào)C08L5/08GK102505008SQ20111035311
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者李冰, 李曉璽, 李琳, 蘇健裕, 董守利, 鐘南京, 陳玲 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)