專利名稱：高度生物相容性的雙重熱凝膠化脫乙酰殼多糖/氨基葡糖鹽組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本說明書涉及用氨基糖碳酸鹽緩沖溶液、氨基糖磷酸鹽緩沖溶液或磷酸化氨基糖緩沖液中和的脫乙酰殼多糖溶液。
背景技術(shù)：
水凝膠作為用于生物醫(yī)學應(yīng)用如組織工程和治療劑遞送的生物材料，持續(xù)得到增加的關(guān)注。此外，原位形成水凝膠或表現(xiàn)出隨溫度增大其粘度(也稱為熱敏性)的特定能力的那些水凝膠相對于預先形成的水凝膠是優(yōu)選的，因為細胞和生物活性化合物如藥物可以在凝膠化之前容易地與前體溶液混合，從而產(chǎn)生均勻加載的凝膠。另外，原位凝膠化有利于施用并且允許用于最小程度侵入性手術(shù)和用于充分填充復雜形狀的損傷空腔。脫乙酰殼多糖是一種通過殼多糖的部分至大量堿N-脫乙酰化獲得的氨基多糖，殼多糖也稱為聚(N-乙酰基-D-氨基葡糖)，其是一種在甲殼類動物的外骨骼如蝦、蟹和龍蝦殼中發(fā)現(xiàn)的天然生物聚合物。脫乙酰殼多糖含有游離胺(-NH2)基團并且可以通過N-乙?；?D-氨基葡糖單元和D-氨基葡糖單元的比例來表征，該比例表示為完全乙酰化的聚合物殼多糖的脫乙酰度(DDA)。脫乙酰殼多糖的性質(zhì)，如溶解度和粘度，受表示脫乙?；瘑误w的百分數(shù)的脫乙酰度(DDA)和分子量(Mw)的影響。

已經(jīng)在大量報告(美國專利號4，572，906 ;4，956，350 ;5，894，070 ;5，902，798 ；6，124, 273 ;和TO98/22114)中提出在各種制劑中，脫乙酰殼多糖單獨以及與其他成分一起，刺激皮、角膜和硬組織的修復。最常引述為有益于傷口修復過程的脫乙酰殼多糖的性質(zhì)是它的生物可降解性、粘著性、防止脫水以及作為細菌侵入的屏障。脫乙酰殼多糖令人感興趣的止血潛能還導致其直接用于減少移植物和傷口部位處的出血(美國專利4，532，134)。一些研究聲稱脫乙酰殼多糖的止血活性僅來源于其凝集紅血細胞的能力，而其他研究認為其聚陽離子胺特征可以激活血小板釋放凝血酶并且引發(fā)典型的凝血連鎖，由此導致其與血纖蛋白原和純化的自體血小板聯(lián)合用作止血劑(美國專利5，773，033)。脫乙酰殼多糖經(jīng)常存在的一個技術(shù)難題是在生理pH和離子強度下的低溶解度，由此限制其以溶液狀態(tài)的應(yīng)用。因此，典型地，脫乙酰殼多糖的溶解經(jīng)由在pH范圍為3.0至5.6的酸性水溶液中胺基團的質(zhì)子化而實現(xiàn)。這樣的脫乙酰殼多糖溶液直至pH接近6.2時仍保持可溶，在PH接近6.2時，胺基團的中和減少鏈間靜電排斥作用并且允許氫鍵、疏水和范德華相互作用的吸引力在pH接近6.3至6.4時引起聚合物沉淀。將多元醇-磷酸二代鹽(即，甘油-磷酸鹽)與脫乙酰殼多糖水溶液混合可以增大溶液的PH同時避免沉淀。當存在這些特定的鹽時，基本濃度(0.5-3% )和高分子量( >幾百kDa)的脫乙酰殼多糖溶液在低溫或室溫保持為液體，持續(xù)長時間，具有在生理學可接受的中性區(qū)6.8至7.2中的pH。這個方面有利于將脫乙酰殼多糖與細胞以保持它們的存活力的方式混合。一個另外的重要性質(zhì)是，當被加熱至適當溫度時，這樣的脫乙酰殼多糖/多元醇-磷酸鹽(C/PP)水溶液發(fā)生固化或凝膠化，這允許將混合的脫乙酰殼多糖/細胞溶液注射到身體部位中，例如在那里可以在皮下空間中形成軟骨結(jié)節(jié)。因此，脫乙酰殼多糖被認為是能夠促進傷口愈合、藥物吸收和組織重建的生物可降解的、生物相容的、抗菌的和止血的生物聚合物。由于以上提及的固有性質(zhì)，脫乙酰殼多糖還已經(jīng)在眾多的化妝品和藥物應(yīng)用中被廣泛開發(fā)。因此，考慮到脫乙酰殼多糖的巨大潛力，對于改善已知的熱敏性脫乙酰殼多糖水凝膠的性質(zhì)存在持續(xù)的需求，該脫乙酰殼多糖水凝膠對于更寬泛范圍的生物醫(yī)學應(yīng)用仍然被認為具有極大前景。美國專利號6，344，488公開了通過用多元醇或糖、磷酸化多元醇或磷酸化糖的單磷酸二代鹽，特別地例如β_甘油磷酸鹽(β-GP)中和商購的脫乙酰度在70至95%范圍內(nèi)的脫乙酰殼多糖而制備的PH依賴的溫度受控脫乙酰殼多糖組合物。由于其特有的性質(zhì)，熱凝膠化脫乙酰殼多糖-GP系統(tǒng)已經(jīng)引起了顯著的生物醫(yī)學興趣。然而，為了實現(xiàn)在體溫下快速凝膠化以及避免在施用后水凝膠的快速清除，需要高濃度的β-GP，特別是對于具有70至85%的DDA的脫乙酰殼多糖(Chenite等，2000, Biomaterials (生物材料),21:2155-2161 ;和 Chenite 等，2001, Carbohydrate Polymers (碳水化合物聚合物)，46:39-47)。這導致非常高的重量克分子滲透濃度(osmolarity)，高于生理學細胞外流體的重量克分子滲透濃度的兩倍(Crompton等,2007, Biomaterials (生物材料),28:441-449 ;和Hoemann 等，2005, Osteoarthritis Cartilage (骨關(guān)節(jié)炎軟骨)，13:318-329)。理想地,水凝膠應(yīng)與細胞外流體等滲；并且其重量克分子滲透濃度應(yīng)該為大約300m0sm。無論在體外還是在體內(nèi)，重量克分子滲透濃度都是調(diào)節(jié)水凝膠與細胞的生物相容性的一個非常重要的因素。此外，在試圖改善脫乙酰殼多糖-GP系統(tǒng)的凝膠化性質(zhì)中，特別是對于等滲組合物，美國專利申請公開號2009/0202430提出添加乙二醛作為化學交聯(lián)劑。在另一描述中，在試圖改善并且穩(wěn)定血塊中，脫乙酰殼多糖-GP系統(tǒng)的特定組合物已與血液組合(美國專利號7，148，209和美國專利申請公開號2010/0178355)。美國專利申請?zhí)?009/0270514和2010/0113618分別描述了通過使用(NH4)2HPO4溶液或NaOH溶液代替β-GP來制備熱凝膠化脫乙酰殼多糖溶液。然而，使用磷酸銨鹽或如在美國專利申請?zhí)?009/0270514中公開的衍生自有機堿的所有鹽可能對細胞和活組織是有害的或可損傷的，即使它們處于通常導致等滲熱凝膠化脫乙酰殼多糖溶液的濃度。美國專利申請?zhí)?010/0113618限于具有在30至60%范圍內(nèi)的脫乙酰度(DDA)的再乙酰化脫乙酰殼多糖。此外，預先加入NaOH溶液與高濃度1，3-丙二醇，1,3-丙二醇是一種可能對細胞和活組織是潛在有毒的有機試劑。盡管通過使用聚糖(polyose)或多元醇代替1，3_丙二醇提供輕微的改善，如在美國專利申請?zhí)?009/0004230公開的，但是毒性問題仍未解決，所以該系統(tǒng)不可能是用于細胞、敏感蛋白或活組織的適當基質(zhì)。
還公知的是，碳酸氫鹽如NaHCO3的溶液(一種弱堿)，可以用來升高脫乙酰殼多糖溶液的pH在6.5附近而不引起任何沉淀，但是所得到的溶液在O至50°C的溫度范圍內(nèi)不能變成均質(zhì)的水凝膠。事實上，可以觀察到假凝膠化，在由CO2釋放引起的溶液表面處發(fā)生，如由最近研究所報道的(Liu等,2011, Int.J.Pharm.,414:6-15)。在這種情形中，為了實現(xiàn)整個樣品的凝膠化，必需攪動該溶液并且將未凝膠化的溶液從樣品的底部帶到表面。這產(chǎn)生非均質(zhì)的水凝膠。因此，仍然存在這樣的需求:提供具有更好生物相容性性質(zhì)的改善的熱凝膠化脫乙酰殼多糖溶液，其對細胞和活組織沒有毒性。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本說明書，現(xiàn)在提供一種生物相容性熱凝膠化組合物，其包含脫乙酰殼多糖和緩沖溶液。在一個實施方案中，所述組合物在pH6.5至7.6下并且在約15°C至約22°C的溫度下是液體，并且當被加熱到約25至約60°C的溫度范圍時形成凝膠。本文公開的組合物還可以在被冷卻到約8°C至約1°C的溫度、大約4°C的溫度時形成凝膠。本文還提供一種制備脫乙酰殼多糖的熱凝膠化組合物的方法，所述方法包括以下步驟:將脫乙酰殼多糖溶解在酸性溶液中以獲得脫乙酰殼多糖水溶液；以及將緩沖溶液與所述脫乙酰殼多糖水溶液混合，以獲得本文所述的脫乙酰殼多糖的熱凝膠化組合物。在一個實施方案中，在制備期間中，將溫度保持在15°C至22°C (室溫范圍)。根據(jù)本公開內(nèi)容，還提供一種用于將材料或化合物遞送至需要其的受試者的方法，所述方法包括以下步驟:將本文所述的熱凝膠化組合物與所述材料或化合物混合；以及將所混合的組合物和材料和/或化合物施用至所述受試者。

本發(fā)明還提供一種治療、修復、再生、代替或替換哺乳動物或人體內(nèi)的組織或器官的方法，所述方法包括施用本文所述的組合物的步驟。本發(fā)明還提供本文所述的組合物的用途，其用于治療、修復、再生、代替或替換哺乳動物或人體內(nèi)的組織或器官。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述緩沖溶液是氨基糖碳酸鹽溶液、氨基糖磷酸鹽溶液或磷酸化氨基糖溶液。在另一個實施方案中，所述緩沖溶液是氨基葡糖碳酸鹽溶液、氨基葡糖磷酸鹽溶液或氨基葡糖-6-磷酸鹽溶液。本文所述的熱凝膠化組合物可以具有6.7至7.2的pH。在另一個實施方案中，所述熱凝膠化組合物在15°C至22°C的溫度下處于液體狀態(tài)。在另一個實施方案中，所述熱凝膠化組合物當被加熱至37°C的溫度或被冷卻至大約4 °C的溫度時變成凝膠。脫乙酰殼多糖的濃度可以在0.1%至5.0%或1.0%至約3.0%的范圍內(nèi)；氨基葡糖碳酸鹽、氨基葡糖磷酸鹽或氨基葡糖-6-磷酸鹽的濃度可以在0.002M至0.100M的范圍內(nèi)。在一個優(yōu)選的實施方案中，脫乙酰殼多糖與氨基葡糖碳酸鹽的比率、脫乙酰殼多糖與氨基葡糖磷酸鹽的比率和/或脫乙酰殼多糖與氨基葡糖-6-磷酸鹽的比率大約為I至3。在該比率與熱凝膠化組合物的pH和凝膠化溫度之間存在直接的關(guān)系。在另一個實施方案中，脫乙酰殼多糖具有在70%至100%范圍內(nèi)的脫乙酰度(DDA)和在50kDa至IOOOkDa范圍內(nèi)的分子量(Mw);優(yōu)選80%至99%的DDA，和200kDa至500kDa 的 Mw。在另一個實施方案中，所述熱凝膠化組合物可以還包含至少一種材料或化合物，諸如例如但不限于，細胞、干細胞、肽、生長因子、人血液、富血小板血漿、核苷酸、藥物和/或成像劑。在另一個實施方案中，所述組合物的重量克分子滲透濃度為270m0smol/kg至340m0smol/kg。在另一個實施方案中，所述組合物注射到患者的組織缺陷中，然后在所述組織缺陷中凝膠化。在一個備選實施方案中，所述組合物在被注射到患者的組織缺陷中之前預先凝膠化。在另一個實施方案中，施用所述組合物以全部或部分地治療、修復、再生、代替或替換哺乳動物或人體內(nèi)的組織或器官。在另一個實施方案中，所述組合物注射到關(guān)節(jié)內(nèi)以治療或改善身體關(guān)節(jié)功能，或者修復軟骨缺陷。在另一個實施方案中，所述材料或化合物是濃度組成(comprising)為1.0%至40.0 %的磷酸鈣粒子。所述磷酸鈣粒子可以 是雙相磷酸鈣、磷酸四鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、磷酸二隹丐、磷酸一韓、無定形磷酸韓、磷酸八韓、氟化磷酸韓、含銀磷酸韓(strontied calciumphosphate)或它們的混合物。特別地，所述雙相磷酸鈣粒子的尺寸為50至1000微米。還特別地，所述雙相磷酸鈣包含20 %至85 %的磷酸三鈣；和80 %至15 %的羥磷灰
O在另一個實施方案中，所述組合物作為均質(zhì)凝膠進行注射和施用。特別地，所述均質(zhì)凝膠具有I分鐘至30分鐘的凝結(jié)時間，并且變成復合固體支架。附圖簡述已經(jīng)這樣整體上描述了本發(fā)明的性質(zhì)，現(xiàn)在將參考附圖:

圖1舉例說明本文所述的pH值約6.7 (脫乙酰殼多糖DDA = 98%)的熱凝膠化組合物的彈性模量和粘性模量隨溫度的演變。圖2顯示進行進行雙重熱凝膠化的本文所述的熱凝膠化組合物。此典型圖象舉例說明對于用氨基葡糖碳酸鹽緩沖溶液或用氨基葡糖磷酸鹽緩沖溶液中和的脫乙酰殼多糖溶液(DDA = 80%或98% )獲得的雙重熱凝膠化。詳細描述提供了一種用氨基糖碳酸鹽緩沖溶液、用氨基糖磷酸鹽緩沖溶液或用磷酸化氨基糖緩沖溶液中和的脫乙酰殼多糖水溶液。所得到的熱凝膠化脫乙酰殼多糖組合物是高度生物相容性的、等滲的，并且具有在加熱至體溫后迅速變成凝膠的能力。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述脫乙酰殼多糖溶液用氨基糖碳酸鹽緩沖溶液、用氨基葡糖磷酸鹽緩沖溶液或用氨基葡糖-6-磷酸二代鹽緩沖溶液中和。本說明書公開用氨基葡糖碳酸鹽、氨基葡糖磷酸鹽和/或氨基葡糖-6-磷酸鹽的緩沖溶液中和的熱凝膠化脫乙酰殼多糖水凝膠的制備。氨基葡糖碳酸鹽和氨基葡糖磷酸鹽是這樣的鹽:其中陽離子只是帶正電荷的氨基葡糖，其為脫乙酰殼多糖本身中的重復單元。氨基葡糖或氨基葡糖-6-磷酸鹽在人組織和關(guān)節(jié)中大量存在，并且提高所述熱凝膠化脫乙酰殼多糖溶液的生物相容性和生物活性。本文所述的熱凝膠化脫乙酰殼多糖溶液是中性的和高度生物相容性的，并且可以用于寬泛的生物醫(yī)學應(yīng)用，用作可注射水凝膠，用于藥物、蛋白和生長因子的受控和延時遞送、可注射填料、可注射復合物、作為組織粘合劑和傷口敷料材料，以及作為組織工程應(yīng)用的支架。本文描述了具有生理pH、在加熱至大約體溫后能夠發(fā)生熱凝膠化的脫乙酰殼多糖溶液的制備。在一個方面，通過在室溫，優(yōu)選在15至22°C，強烈攪拌下，混合適量的氨基葡糖碳酸鹽溶液或氨基葡糖磷酸鹽溶液與脫乙酰殼多糖溶液而制備熱凝膠化或熱固化脫乙酰殼多糖溶液。所得到的溶液，甚至在pH為6.7至7.2時，已被發(fā)現(xiàn)在室溫保持為液體，并且當被加熱至37°C以上時變成水凝膠。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)發(fā)生凝膠化所需要的時間主要取決于最終溶液的溫度和PH，其又取決于稱為“緩沖溶液”的氨基葡糖磷酸氫鹽(glucosaminehydrogen phosphate)的量和脫乙酰殼多糖溶液的濃度。在一個方面中，有效熱凝膠化脫乙酰殼多糖溶液的最終PH應(yīng)該為至少約6.7。在一個單獨的實施方案中，熱凝膠化脫乙酰殼多糖溶液還能夠在冷卻至8至1°C的溫度后形成水凝膠。本文所述的熱凝膠化脫乙酰殼多糖組合物與細胞、敏感蛋白和活組織是高度生物相容的，因為氨基葡糖碳酸鹽或氨基葡糖磷酸鹽用作緩沖溶液，氨基葡糖的優(yōu)點被保留。氨基葡糖是一種由葡萄糖和谷氨酰胺(一種氨基酸)天然合成的氨基糖。其在人關(guān)節(jié)中是大量存在的，在那里，其是生物化學合成多種化合物包括糖脂、糖蛋白、糖胺聚糖、透明質(zhì)酸鹽(酯)和蛋白聚糖的關(guān)鍵前體。所有這些化合物存在于軟骨和其他關(guān)節(jié)組件中，在那里，它們發(fā)揮對于關(guān)節(jié)回彈和潤滑的重要作用。隨年齡增長，氨基葡糖身體逐漸失去其將葡萄糖和谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為氨基葡糖的能力，這是由于較低水平的轉(zhuǎn)化酶氨基葡糖合酶。這種逐漸降低已經(jīng)被提議為有助于退行性關(guān)節(jié)病如骨關(guān)節(jié)炎(OA)的主要因素之一。臨床組研究和患者的要求支持這樣的事實:在一定時間段內(nèi)日常補充氨基葡糖可以對OA患者具有有益效果。明顯地，氨基葡糖可能通過刺激糖胺聚糖的體內(nèi)生物合成而改善關(guān)節(jié)回彈。甲殼類動物的外骨骼，如蝦、蟹和龍蝦殼，通常是商購氨基葡糖的來源，其通過將脫乙酰殼多糖分解或降解成單體單元而獲得。臨床研究和患者的要求支持這樣的事實:在一定時間段內(nèi)日常補充氨基葡糖可以對OA患者具有有益效果。從安全角度看，人研究已經(jīng)一致地報道了施用氨基葡糖不影響葡萄糖或胰島素的血衆(zhòng)水平、胰島素敏感性或葡萄糖氧化(Scroggie等,2003, Archivesof Internal Medicine (內(nèi)科醫(yī)學學報)，163: 1587-1 590 ；Pouwels 等，2001, J.Clin.Endocrinol.Metab.(臨床內(nèi)分泌學和代謝學雜志)，86:2099-2103 ;和 Monauni 等，2000，Diabetes (糖尿病)，49 =926-935) 0這表明，即使在患有2型糖尿病的患者中，氨基葡糖對血糖代謝沒有顯著影響。
Anderson與同事綜述了對超過3000名患者記錄的臨床試驗數(shù)據(jù)，并且陳述了口服施用氨基葡糖在治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛中是中度至高度有效的，并且對血液、尿或糞便參數(shù)沒有不利影響(Anderson等，2005, Food and Chemical Toxicology (食品和化學毒性學)，43:187-201)。此外，該綜述概述了關(guān)于向大鼠、小鼠、兔、狗和馬口服施用非常高劑量的氨基葡糖的結(jié)果，如在接近20種動物研究中報道的。估算的LD5tl對大鼠超過5000mg/kg，并且對小鼠和兔超過8000mg/kg。該研究還表明，攝入在300至2149mg/kg體重范圍內(nèi)的高劑量氨基葡糖對大鼠、兔或狗中的血糖水平?jīng)]有影響。此外，在五十四名患有膝關(guān)節(jié)病的門診患者中，進行雙盲臨床試驗，目的是相比于0.9% NaCl安慰劑，評價關(guān)節(jié)內(nèi)氨基葡糖的功效和耐受性。每名患者每周進行一次關(guān)節(jié)內(nèi)注射，持續(xù)五周。在治療開始前和在最后一次注射后四周，記錄疼痛、關(guān)節(jié)的主動和被動活動性、腫脹以及總體和局部的不耐性癥狀。與安慰劑相比，氨基葡糖在顯著更大的程度上減少疼痛，并且導致顯著更多無疼痛的患者。在氨基葡糖治療后，關(guān)節(jié)彎曲的角度顯著增大。在兩種治療下主動活動性均增加，在氨基葡糖施用后具有更有利的趨勢。在氨基葡糖后，膝蓋腫脹沒有減輕，而在安慰劑后膝蓋腫脹加重(盡管不是顯著的)。在治療期間和之后，沒有局部或總體不耐性癥狀。氨基葡糖施用能夠加速關(guān)節(jié)病患者的恢復，沒有導致副作用，并且能夠部分地恢復關(guān)節(jié)功能。另外，在治療結(jié)束后，臨床恢復不減退，而是至少持續(xù)一個月。因此，表明在骨關(guān)節(jié)病管理中對于所選部位，氨基葡糖治療是值得的(Vajaradul等，1981,Clin Ther.(臨床治療)，3:336-343)。脫乙酰殼多糖已經(jīng)登記至GRAS(通常認為是安全的)。已經(jīng)在體外以及體內(nèi)、在動物和人中廣泛分析了脫乙酰殼多糖組合物和材料。在體外，已經(jīng)用多種細胞系測試了脫乙酰殼多糖組合物，所述細胞系包括Caco-2細胞、HT29-H、CCRF-CEM(人淋巴母細胞白血病)和L132(人胚肺細胞)、MCF7和C0S7細胞(Kean等，2010，Advanced DrugDelivery Reviews (高級藥物遞送綜述)，62:3_11 ;Richardson等，1999, Int.J.Pharm.(國際藥學雜志)，178:231-243 ；Schipper 等，1996，Pharm.Res.(藥學研究)，13:1686-1692 ；Schipper 等，1999, Eur.J.Pharm.Sc1.(歐洲藥物科學雜志),8:335-343 ;和 Zhang,等，2008，Biomaterials (生物材料)，29:1233-1241)。在體內(nèi)，已經(jīng)在多種動物模型中并且通過若干施用途徑檢測了脫乙酰殼多糖組合物和材料。已經(jīng)在小 鼠模型(免疫原性)、大鼠模型、豚鼠模型和兔模型(亞急性毒性)中對脫乙酰殼多糖安全地進行了研究。分別在小鼠中的急性毒性測試中沒有記錄到脫乙酰殼多糖的“顯著毒性作用”，在兔和豚鼠中沒有眼睛或皮膚刺激。在相同的研究中，還推斷脫乙酰殼多糖不是致熱的。相比于對照，將大鼠鼻黏膜暴露于0.5% (w/v)的脫乙酰殼多糖溶液超過I小時沒有引起黏膜細胞形態(tài)的顯著變化。從所報道的大多數(shù)研究來看，似乎脫乙酰殼多糖表現(xiàn)出最低毒性作用，并且這證明選擇其作為安全的藥物遞送材料是合適的。脫乙酰殼多糖/b-甘油磷酸鹽系統(tǒng)已經(jīng)在動物模型和人中在體外和在體內(nèi)進行了研究，并且已表現(xiàn)出安全且無毒的特性(Hirano 等，1991，Agric.Biol.Chem.,55:2623-2625 ;0no 等，2000，J.Biomed.Mater.Res.(生物醫(yī)學材料研究雜志)，49:289-295 ；Azad 等，2004, J.Biomed.Mater.Res.B App1.Biomater.(生物醫(yī)學材料研究雜志B應(yīng)用生物材料)，69 =216-222 ；Ishihara 等，2001, Wound Repair Regen.(傷口修復再生)，9:513-52 ;和 Illum 等，1994,Pharm.Res.(藥學研究)，11:1186-1189)。在人中，涉及對具有渺茫手術(shù)希望的患者經(jīng)皮注射脫乙酰殼多糖-166欽復合物以治療肝細胞癌的2期臨床試驗報道了安全且有效的結(jié)果。已經(jīng)在八十名進行長期穩(wěn)定的血液透析治療的腎衰竭患者中研究了脫乙酰殼多糖的效果。在為期I周的對照治療后檢測患者。一半的患者每天三次服用30個脫乙酰殼多糖片(45mg脫乙酰殼多糖/片)。攝入脫乙酰殼多糖有效地降低總血清膽固醇水平(從10.14+/-4.40到5.82+/-2.19mM)，并且增加血清血紅素水平(從58.2+/-12.1到68+/-9.0g L-1)。在該治療期期間，沒有觀察到臨床有問題的癥狀。結(jié)果表明，脫乙酰殼多糖對于腎衰竭患者可能是一種有效的治療，盡管還應(yīng)該進一步研究作用的機制。脫乙酰殼多糖還進行鼻內(nèi)施用以在矯形手術(shù)后將嗎啡遞送到患者體內(nèi)，并且表明提供一種靜脈內(nèi)(IV)嗎啡的安全且較少侵入性的備選方案。進行對于負載慶大霉素的脫乙酰殼多糖棒的藥物遞送系統(tǒng)(DDS)的臨床和藥物代謝動力學研究，目的是評估其功效并且對于其臨床應(yīng)用提供進一步的數(shù)據(jù)。十八(18)個慢性骨髓炎病例通過手術(shù)壞死組織切除術(shù)進行治療，其中在制備的骨腔中植入負載慶大霉素的脫乙酰殼多糖棒。所有18個病例隨訪24.8個月(在6-34個月的范圍內(nèi))，16名患者接受了初始治愈并且沒有任何復發(fā)。因此，可以推斷負載慶大霉素的脫乙酰殼多糖DDS是用于治療慢性骨髓炎的一種簡單且有效的方法，同時無需進行第二次手術(shù)以去除藥物載體。在中國，對于12名患者，在肘關(guān)節(jié)松解術(shù)后，觀察到脫乙酰殼多糖安全地防止或減少肘關(guān)節(jié)粘連。在髕骨手術(shù)后在人中再次研究防止膝關(guān)節(jié)粘連(Kim等，2006，Clin.Cancer Res.(臨床癌癥研究),12:543~548:.Ting 等，1997, J Pharm Pharmacol.(藥物藥理學雜志)，49 (7):721-723 ;Stoker 等，2008，Pain Med.(疼痛醫(yī)學)，9:3_12 ;和 Chen 等，1998, Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery(中國修復和重建手術(shù)雜志)，12:355-358)。在美國正在進行(募集)或終止一些涉及用于藥物遞送或醫(yī)學植入物目的的脫乙酰殼多糖組合物或材料的多種臨床試驗。在患者中進行了或已經(jīng)進行了脫乙酰殼多糖材料的臨床研究，用以管理難 治的自發(fā)性鼻出血，并且評估其對鼻黏膜的治愈作用，研究用在牙科手術(shù)程序中的敷料的止血安全性和功效，檢測在診斷性經(jīng)皮冠狀血管造影術(shù)后脫乙酰殼多糖襯墊作為手動擠壓的附件以更好地控制血管通路出血部位并且減少止血時間，研究脫乙酰殼多糖組合物作為手術(shù)室和住院病人情形中慢性傷口的安全有效的清創(chuàng)術(shù)治療和將傷口細菌再次建群最小化，研究使用脫乙酰殼多糖組合物進行糖尿病性神經(jīng)性足部潰瘍的傷口修復的治療益處，比較脫乙酰殼多糖組合物相對于常規(guī)治療在糖尿病性神經(jīng)性足部潰瘍治療中的功效，研究用于減輕與干眼綜合征相關(guān)的癥狀的新的脫乙酰殼多糖衍生物，以及研究當與單獨的微小骨折相比時，用脫乙酰殼多糖組合物治療膝蓋中的受損軟骨是否將增加軟骨修復組織的數(shù)量和質(zhì)量。此外，在患者中進行或已經(jīng)進行了脫乙酰殼多糖材料的臨床研究，以確定脫乙酰殼多糖，分子量為40kDa的短鏈脫乙酰殼多糖，在降低具有輕度至中度升高的膽固醇水平(藥物)的患者中的LDL-膽固醇水平是否是安全且有效的，以及比較兩種劑量水平的具有脫乙酰殼多糖佐劑/賦形劑的Norwalk VLP疫苗的安全性和免疫原性。本文還公開了使用溶液或固體形式的天然氨基葡糖-6-磷酸鹽來制備脫乙酰殼多糖的高度生物相容性熱凝膠化溶液。氨基葡糖-6-磷酸鹽是導致氨基葡糖的天然氨基葡糖生物合成的途徑中的中間產(chǎn)物，被認為是所有含氮糖類的生物化學前體(Roseman,2001,J.Biol.Chem.(生物化學雜志)，276:41527-41542)，其是參與生物學識別的糖蛋白和寡糖的重要組分。具體地，氨基葡糖-6-磷酸鹽由果糖-6-磷酸和谷氨酰胺合成(Ghosh等，1960，J.Biol.Chem.(生物化學雜志)，235:1265-1273)，作為己糖胺生物合成途徑的第一步。這個途徑的終產(chǎn)物是尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡糖或UDP-GlcNAc，一種然后用于制備糖胺聚糖(glycosaminiglycans)、蛋白聚糖和糖脂的核苷酸糖。本文考慮了任何磷酸化氨基糖可以如上所述使用。此外，與將其內(nèi)容通過引用結(jié)合在本文中的美國專利號6，344，488相反，其教導使用多元醇和糖的單磷酸鹽(磷酸化多元醇和糖)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠區(qū)分本公開內(nèi)容是涉及使用與糖和/或多元醇不同的氨基糖。糖是指許多碳水化合物，如單糖、二糖或寡糖。單糖還稱為“簡單糖思)”，具有式CnH2nOn，其中η為3至7。葡萄糖，其具有分子式C6H12O6，是最重要的單糖。碳水化合物實際上僅是多羥基醛，稱為醛糖，或多羥基酮，稱為酮糖，而多元醇僅是含有多個羥基基團的醇。本領(lǐng)域，如在美國專利號6，344，488中描述的脫乙酰殼多糖組合物，涵蓋作為單糖的糖，如單磷酸二元糖、單硫酸糖和單羧酸糖。本文涵蓋的氨基糖是這樣的糖:其中羥基基團被氨基基團取代。含胺糖的衍生物，如N-乙?；被咸?，盡管不是正式地包含胺，但也被認為是氨基糖。磷酸化是將磷酸根(PO4)基團化學添加到蛋白、糖或其他有機分子上。如本文使用的，氨基葡糖-6-磷酸鹽是指在碳6上磷酸化的氨基葡糖。如本文使用的，“氨基糖碳酸鹽溶液”或“氨基糖磷酸鹽溶液”是指含有在需要用來平衡帶負電荷的CO32-和PO43-以使總電荷為零的抗衡離子中的帶正電荷的氨基-糖(+NH3-糖)的溶液。
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如本文使用的，“磷酸化氨基糖溶液”是指其中帶負電荷的離子是氨基糖-磷酸根(氨基糖-O-PO32O的溶液。術(shù)語“凝膠化溫度”用來指在約25°C至約70°C，優(yōu)選37°C至約60°C范圍內(nèi)的任意溫度，并且更優(yōu)選在約生理溫度或37°C。表述“原位凝膠化”在本文中是指在哺乳動物或人環(huán)境的特定部位，例如任意組織(肌肉、骨、韌帶、軟骨)和器官內(nèi)，在注射如本文教導的液體脫乙酰殼多糖溶液后形成凝膠。原位凝膠化允許完全且準確地填充組織缺陷或體腔。脫乙酰殼多糖混合物的凝膠化由生理溫度誘導。本文所教導的脫乙酰殼多糖凝膠是用于藥物遞送系統(tǒng)的理想材料。這樣的原位原位凝膠狀形成載體(vehicle)，其中在凝膠化之前結(jié)合固體顆?；蛩苄蕴砑觿梢跃植?、直接施用到要治療或診斷的身體部位?？咕鷦?、抗真菌劑、留體或非留體抗炎齊L1、抗癌藥、抗纖維化藥、抗病毒劑、抗青光眼劑(ant1-glucoma)、縮瞳藥和抗膽堿能藥(ant1-cholinergies)、抗精神病藥、抗組胺藥和解充血劑、麻醉劑和抗寄生蟲劑可以結(jié)合在所述組合物和凝膠中。以類似方式，多肽或無活性藥物試劑可以結(jié)合在所述組合物或凝膠中用于恢復、重建或再生目的。通過參考下述實施例將更容易理解本公開內(nèi)容,給出這些實施例是為了示例實施方案而不是限制其范圍。實施例1
脫乙酰殼多糖-緩沖溶液的混合物的制備1.脫乙酰殼多糖溶液的制備通過將具有中等分子量的醫(yī)用級脫乙酰殼多糖溶解在HCl水溶液中來制備脫乙酰殼多糖溶液(2.00% w/v)。HCl相比于脫乙酰殼多糖氨基基團(NH2)的的比率(稱為溶液中脫乙酰殼多糖的質(zhì)子化度)保持在70%。將該溶液使用高壓滅菌鍋在121°C滅菌30分鐘。冷卻后，通過在受控無菌環(huán)境下添加無菌水來補償由高壓滅菌鍋過程弓I起的水損失。然后，將溶液無菌地過濾通過金屬燒結(jié)料，分配在5.0mL等分試樣中并且在4°C儲存。使用約3mL的額外等分試樣來測量脫乙酰殼多糖溶液的pH。使用DDA為約80%和98%的脫乙酰殼多糖制備的IOOmL溶液的特性概括在表I中。M I脫乙酰殼多糖溶液(IOOmL)的特性
權(quán)利要求
1.一種生物相容性熱凝膠化組合物，所述組合物包含: a)脫乙酰殼多糖溶液；和 b)緩沖溶液； 其中所述組合物是生物相容性的、等滲的，并且隨時間或者通過降低或升高溫度變成凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物相容性熱凝膠化組合物，所述組合物在pH為6.5至7.6并且在溫度為約15°C至約22°C下是液體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物相容性熱凝膠化組合物，當被加熱到約25°C至約60°C的溫度范圍或被冷卻到約8°C至約1°C的溫度范圍時，所述組合物形成凝膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述緩沖溶液是氨基糖碳酸鹽溶液、氨基糖磷酸鹽溶液或磷酸化氨基糖溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述緩沖溶液是氨基葡糖碳酸鹽溶液、氨基葡糖磷酸鹽溶液或氨基葡糖-6-磷酸鹽溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述熱凝膠化組合物具有的pH為6.7至7.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中當被加熱至37 0C的溫度時，所述熱凝膠化組合物變成凝膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7 中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中脫乙酰殼多糖的濃度范圍為0.1 %至5.0%。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中氨基葡糖碳酸鹽的濃度范圍為 0.002M 至 0.1OOM0
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中脫乙酰殼多糖的濃度范圍為1.0%至約3.0%。
11.根據(jù)權(quán)利要求5或9所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中脫乙酰殼多糖與氨基葡糖碳酸鹽的比率為I至3。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中氨基葡糖磷酸鹽的濃度范圍為 0.002M 至 0.1OOM0
13.根據(jù)權(quán)利要求8或12所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中脫乙酰殼多糖與氨基葡糖磷酸鹽的比率為I至3。
14.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中氨基葡糖-6-磷酸鹽的濃度范圍為0.002M至0.1OOM0
15.根據(jù)權(quán)利要求5或14所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中脫乙酰殼多糖與氨基葡糖-6-磷酸鹽的比率大約為I至3。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述脫乙酰殼多糖具有范圍在70%至100%的脫乙酰度(DDA)和范圍在50kDa至IOOOkDa的分子量(Mw)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述脫乙酰殼多糖具有80% 至 99% 的 DDA 和 200kDa 至 500kDa 的 Mw。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，所述組合物還包含選自由下列各項組成的組中的至少一種材料或化合物:細胞、干細胞、肽、生長因子、人血液、富血小板血漿、核苷酸、骨、骨來源材料、磷酸鈣、碳酸鈣、生物玻璃、陶瓷、藥物和成像劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述組合物的重量克分子滲透濃度為270m0smol/kg至340m0smol/kg。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述組合物被注射到患者的組織缺陷中，然后在所述組織缺陷中凝膠化。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述組合物在被注射到患者的組織缺陷中之前預先凝膠化。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中施用所述組合物以全部或部分地治療、修復、再生、代替或替換哺乳動物或人體內(nèi)的組織或器官。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述組織或器官包括關(guān)節(jié)軟骨、纖維軟骨、半月板、椎間盤、骨組織、肌肉組織、神經(jīng)和脊髓軟組織、皮膚或皮組織?！?br> 24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述組合物被注射到關(guān)節(jié)內(nèi)以治療或改善身體關(guān)節(jié)功能或者修復軟骨缺陷。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述材料或化合物是濃度組成為1.0%至40.0 %的磷酸鈣粒子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述磷酸鈣粒子是雙相磷酸鈣、磷酸四鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、磷酸二鈣、磷酸一鈣、無定形磷酸鈣、磷酸八鈣、氟化磷酸鈣、含鍶磷酸鈣或它們的混合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述雙相磷酸鈣粒子的尺寸為50至1000微米。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述雙相磷酸鈣包含: a)20 %至85 %的磷酸三鈣；和 b)80%至15%的輕磷灰石。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-28中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述組合物作為均質(zhì)凝膠被注射和施用。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述均質(zhì)凝膠具有的凝結(jié)時間為I分鐘至30分鐘，并且變成復合固體支架。
31.根據(jù)權(quán)利要求25-30中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中所述組合物另外包含選自由下列各項組成的組中的生物活性劑:成骨劑、骨誘導劑、骨形成蛋白、細胞因子和生長因子。
32.根據(jù)權(quán)利要求25-31中任一項所述的生物相容性熱凝膠化組合物，其中在牙科、上頜面、脊柱或矯形手術(shù)或創(chuàng)傷程序期間施用所述組合物以治療、填充或修復骨或骨質(zhì)缺陷。
33.一種制備脫乙酰殼多糖的生物相容性熱凝膠化組合物的方法，所述方法包括以下步驟: a)將脫乙酰殼多糖溶解在酸性溶液中以獲得脫乙酰殼多糖水溶液；和 b)將緩沖溶液與所述脫乙酰殼多糖水溶液混合， 其中所述組合物是生物相容性的、等滲的，并且隨時間或者通過升高或降低溫度變成凝膠。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述脫乙酰殼多糖在15至22°C的溫度下進行溶解。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的方法，其中所述組合物處于液體狀態(tài)，具有的pH為6.7 至 7.2。
36.根據(jù)權(quán)利要求33-35中任一項所述的方法，所述組合物在被加熱到30至50°C的溫度范圍時形成凝膠。
37.根據(jù)權(quán)利要求33-35中任一項所述的方法，所述組合物在被冷卻到8至1°C的溫度范圍時形成凝膠。
38.根據(jù)權(quán)利要求33-37中任一項所述的方法，其中所述緩沖溶液是下列各項的溶液:氨基糖碳酸鹽、氨基糖磷酸鹽或磷酸化氨基糖。
39.根據(jù)權(quán)利要求33-38中任一項所述的方法，其中所述緩沖溶液是氨基葡糖碳酸鹽溶液、氨基葡糖磷酸鹽溶液或氨基葡糖-6-磷酸鹽溶液。
40.根據(jù)權(quán)利要求33-39中任一項所述的方法，其中所述熱凝膠化組合物在被加熱至37 °C時形成凝膠。
41.根據(jù)權(quán)利要求33-40中任一項所述的方法，其中脫乙酰殼多糖的濃度范圍為0.1%至 5.0%。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述氨基葡糖碳酸鹽的濃度范圍為0.002M至0.100M0
43.根據(jù)權(quán)利要求33-42中任一項所述的方法，其中脫乙酰殼多糖的濃度范圍為為1.0%至約 3.0%。
44.根據(jù)權(quán)利要求39或42所述的方法，其中脫乙酰殼多糖與氨基葡糖碳酸鹽的比率為I至3。
45.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中氨基葡糖磷酸鹽的濃度范圍為0.002M至0.1OOM0
46.根據(jù)權(quán)利要求39或45所述的方法，其中脫乙酰殼多糖與氨基葡糖磷酸鹽的比率大約為I至3。
47.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中氨基葡糖-6-磷酸鹽的濃度范圍為0.002M至0.1OOM0
48.根據(jù)權(quán)利要求39或47所述的方法，其中脫乙酰殼多糖與氨基葡糖-6-磷酸鹽的比率大約為I至3。
49.根據(jù)權(quán)利要求33-48中任一項所述的方法，其中所述脫乙酰殼多糖具有范圍在70%至100%的脫乙酰度(DDA)和范圍在50kDa至IOOOkDa的分子量(Mw)。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述脫乙酰殼多糖具有80%至99%的DDA和200kDa 至 500kDa 的 Mw。
51.根據(jù)權(quán)利要求33-50中任一項所述的方法，其中所述組合物的重量克分子滲透濃度為 270m0smol/kg 至 340m0smol/kg。
52.一種用于將材料或化合物遞送至需要其的受試者的方法，所述方法包括以下步驟:a)將根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項所述的熱凝膠化組合物與所述材料或化合物混合；和 b)向所述受試者施用所述混合的組合物和材料或化合物。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述材料或化合物選自由下列各項組成的組:細胞、干細胞、肽、生長因子、人血液、富血小板血漿、核苷酸、骨和骨來源材料、磷酸鈣、碳酸鈣、生物玻璃和陶瓷、藥物和成像劑。
54.一種治療、修復、再生、代替或替換哺乳動物或人體內(nèi)的組織或器官的方法，所述方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項所述的組合物的步驟。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中將所述組合物注射到所述哺乳動物或人體中，然后凝膠化。
56.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述組合物在被注射到哺乳動物或人體中之前預先凝膠化。
57.根據(jù)權(quán)利要求54-56中任一項所述的方法，其中所述組織或器官包括關(guān)節(jié)軟骨、纖維軟骨、半月板、椎間盤、骨組織、肌肉組織、神經(jīng)和脊髓軟組織、皮膚或皮組織。
58.根據(jù)權(quán)利要求54-57中任一項所述的方法，其中所述組合物被注射到關(guān)節(jié)內(nèi)以治療或改善身體關(guān)節(jié)功能或者修復軟骨缺陷。
59.根據(jù)權(quán)利要求1-32中任一項所述的組合物的用途，其用于治療、修復、再生、代替或替換哺乳動物或人體內(nèi)的組織或器官。
60.根據(jù)權(quán)利要求59 所述的用途，其中將所述組合物配制用于注射到所述哺乳動物或人體中，然后凝膠化。
61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的用途，其中將所述組合物配制成在被注射到所述哺乳動物或人體中之前預先凝膠化。
62.根據(jù)權(quán)利要求59-61中任一項所述的用途，其中所述組織或器官包括關(guān)節(jié)軟骨、纖維軟骨、半月板、椎間盤、骨組織、肌肉組織、神經(jīng)和脊髓軟組織、皮膚或皮組織。
63.根據(jù)權(quán)利要求59-62中任一項所述的用途，其中將所述組合物配制用于關(guān)節(jié)內(nèi)注射以治療或改善身體關(guān)節(jié)功能或者修復軟骨缺陷。
全文摘要
本發(fā)明內(nèi)容涉及一種用氨基糖碳酸鹽緩沖溶液或氨基糖磷酸鹽緩沖溶液或磷酸化氨基糖緩沖溶液中和的脫乙酰殼多糖溶液。所得到的熱凝膠化脫乙酰殼多糖組合物是高度生物相容性的、等滲的，并且具有在加熱至體溫后迅速變成凝膠的能力。本發(fā)明提供一種新型的基于脫乙酰殼多糖的組合物，其適用于藥物遞送、細胞遞送及組織和器官的修復或再生以及其他臨床治療。
文檔編號C08L5/08GK103189435SQ201180051987
公開日2013年7月3日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者阿代拉蒂夫·陳奈特, 阿民·塞爾曼尼 申請人:奧利高醫(yī)療公司