專利名稱：一種制備多功能納米載體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種制備多功能納米載體的方法，尤其是利用退溶技術和層層組裝修飾技術相結合制備多功能納米微粒的方法。
背景技術：
藥物納米載體包括脂質體、膠束、納米乳、聚合物納米粒、固體脂質納米粒、柔性囊泡，經(jīng)表面修飾后可獲得可控的生物學性質，進而在治療或診斷上同時執(zhí)行多種重要功能。 納米技術對醫(yī)學發(fā)展具有重要的推動作用，疾病診斷、預防和治療的實際需求對納米技術提出了獲得更先進的藥物傳輸系統(tǒng)和早期檢測與診斷技術的期望，如早期診斷和預警；代謝產(chǎn)物中的生物標志物的發(fā)現(xiàn)及其微量或痕跡量或瞬間的樣品量的檢測技術；適于大量或批量的實用檢測技術平臺；靶向、緩釋、可控的藥物載體等。
理想的納米藥物載體具備以下性質①具有較高的載藥量；②具有較高的包封率；③有適宜的制備及提純方法載體材料可生物降解，毒性較低或沒有毒性具有適當?shù)牧脚c粒形；⑥具有較長的體內循還時間。延長納米粒在體內的循環(huán)時間，能使所載的有效成分濃度增大且循環(huán)時間延長，這樣藥物能更好地發(fā)揮全身治療或診斷作用，增強藥物在病灶靶部位的療效。
近年來，發(fā)展了許多新的納米載體的制備方法，如多嵌段共聚物形成膠束或囊泡、 脂質體、樹枝狀聚合物等。其中，由于蛋白的可降解性和生物相容性，以蛋白質為原料采用退溶法得到尺寸均勻可控的納米粒子的方法被廣泛應用。而這種方法制備的蛋白納米粒子缺乏多功能和良好的穩(wěn)定性，需要對其表面進行修飾以達到多功能性。而以膠體微粒為模板，利用層層自組裝技術在模板粒子上組裝聚合物超薄膜，具有結構和性能可控、易賦予各種獨特功能等特點。尤其是各種活性基團為下一步接枝靶向分子奠定了基礎。納米微粒及其表面包覆的多層膜的滲透性以及包埋物質的釋放性能可以通過環(huán)境條件如溫度、離子種類和離子強度、PH值、溶液性質、光、電、聲等進行控制。因此在藥物控制釋放、酶的包埋與催化反應、組織工程等領域顯示了十分重要的應用前景。結合退溶技術和層層組裝技術可以使充分發(fā)揮各自優(yōu)勢，制備出多功能納米載體。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種通過退溶技術和層層組裝修飾技術制備多功能納米載體的方法。
本發(fā)明的制備多功能納米載體的方法，包括以下步驟1)將濃度為100mg/mL的蛋白質水溶液,調至pH=7;在磁力攪拌下，以0. 5mL/min的速度加入乙醇，蛋白質水溶液與乙醇的體積比I :4，持續(xù)攪拌，然后加入0.8 % w/v戊二醛交聯(lián)劑，戍二醒與蛋白質質量比為I U g :lmg,反應6小時,離心洗漆,凍干,得到蛋白質納米粒子;2)將相對分子質量為2000的一端帶有羧基、一端帶有醛基的聚乙二醇加入lOmg/mL的相對分子質量為15000的聚烯丙基胺或者相對分子質量為15000聚賴氨酸溶液中，保持二者的質量比為4. 3 :1，調節(jié)混合溶液pH值為8. 5，反應6小時后透析，凍干，得到聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH或聚賴氨酸-g-聚乙二醇-COOH ；3)將聚陽離子、聚陰離子和聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH分別溶解于IMNaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚電解質溶液；或者將聚陽離子、聚陰離子和聚賴氨酸-g-聚乙二醇-COOH分別溶解于IM NaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚電解質溶液；4)取步驟I)制備的蛋白質納米粒子分散于水中，得到濃度為0.5% w/w蛋白質粒子懸浮液，于離心管中超聲分散，離心除去上清液；往離心管中加入ImL三蒸水，超聲分散；加入步驟3)配制的聚陽離子溶液0. 5mL，孵化15min，期間輕微振蕩離心管；離心去上清，水洗， 得到吸附聚陽離子的蛋白質納米粒子懸浮液，然后加入步驟3)配制的0. 5mL聚陰離子溶液，孵化15min，期間輕微振蕩，離心去上清，水洗；重復以上過程，在納米粒子表面交替吸附帶相反電荷的聚電解質，組裝2個雙層后得到表面為聚陰離子的核殼結構的納米粒子；5)將步驟4)所得的核殼結構的納米粒子分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5mL 步驟3)配制的聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH或者聚賴氨酸-g_聚乙二醇-C00H，反應 15min,期間輕微振蕩，然后離心去上清，水洗，得到表面為聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH 或聚賴氨酸-g_聚乙二醇-COOH的納米粒子；6)將步驟5)所得的微粒分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5mL I. 5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺溶液，孵化15min ;再加入0. 5mL I. 5mg/mL的N- 二甲胺基丙基-N，-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和6 ii g/mL適配體分子,反應20min,離心去上清,水洗,得到多功能納米載體。
本發(fā)明中所說的蛋白質是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或明膠；所說聚陽離子是聚烯丙基胺鹽酸鹽、聚二烯丙基二甲基季銨鹽、殼聚糖、膠原、聚賴氨酸、陽離子化葡聚糖、 陽離子化聚丙烯酸酯或聚乙烯亞胺；所說聚陰離子是聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、硫酸軟骨素、硫酸肝素、透明質酸、硫酸葡聚糖、DNA或羧甲基纖維素鈉。
本發(fā)明的原理是在蛋白質溶液中，逐漸滴加蛋白質的不良溶劑乙醇，蛋白質則會逐漸沉淀出來，形成微小的納米粒子，通過化學交聯(lián)使納米粒子的結構得以穩(wěn)定，從而得到在水中能夠穩(wěn)定存在的納米粒子；通過層層組裝可以提高納米粒子的膠體穩(wěn)定性，減少聚集及大顆粒的形成；最后通過組裝接枝有聚乙二醇(PEG)的聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-C00H，可以進一步減少粒子間的聚集，同時利用PEG端基的羧基在N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)/N-二甲胺基丙基-N’ -乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)作用下，共價偶聯(lián)靶向分子適配體，該適配體對癌細胞有高親和性，可實現(xiàn)粒子的靶向傳遞。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明材料來源廣泛，可控性好，靈活性好，適合多種多功能粒子的制備；得到的納米微粒，具有良好的穩(wěn)定性和靶向癌細胞等特點，有良好的應用前景。


圖I是牛血清白蛋白(BSA)納米粒子的透射電鏡照片。
圖2是(PAH/PSS)2多層膜修飾BSA納米粒子干燥后的透射電鏡照片。
圖3是(PAH/PSS) 2/PAH-g-PEG-C00H多層膜修飾BSA納米粒子干燥后的透射電鏡照片。
圖4 是(PAH/PSS)2/PAH-g-PEG-AS1411 (AS1411，一種適配體)多層膜修飾 BSA 納米粒子干燥后的透射電鏡照片。
圖5是(PLL/h印arin) 2/PLL_g_PEG多層膜修飾BSA納米粒子干燥后的透射電鏡照片。
具體實施方式
以下結合實例進一步說明本發(fā)明，但這些實例并不用來限制本發(fā)明。
實施例I1)將濃度為lOOmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)水溶液，調至pH=7;在磁力攪拌下，以0.5mL/min的速度加入乙醇，水溶液與乙醇的體積比I :4，持續(xù)攪拌，然后加入0. 8% w/v戊二醒，使交聯(lián)劑與BSA的質量比為I y g lmg,反應6小時，離心洗滌3次，凍干，得到BSA納米粒子，其透射電鏡圖見圖I ;2)將一定量的相對分子質量為2000的一端帶有羧基、一端帶有醛基的聚乙二醇加入 10mg/mL的相對分子質量為15000的聚烯丙基胺溶液中，保持二者的質量比為4. 3 :1，調節(jié)溶液PH值為8. 5，反應6小時后透析，凍干，得到聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH ；3)將聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)、聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)和聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH分別溶解于IM NaCl溶液中，各配成2mg/mL的溶液；4)取一定量步驟I)制備的蛋白質納米粒子分散于水中，得到濃度為0.5% w/w蛋白質粒子懸浮液，于離心管中超聲分散，離心除去上清液；往離心管中加入ImL三蒸水，超聲分散；加入步驟3)配制的PAH溶液0. 5mL，孵化15min，期間輕微振蕩離心管；離心去上清，水洗，得到吸附PAH的蛋白質納米粒子懸浮液，然后加入步驟3)配制的0. 5mL PSS溶液，孵化 15min,期間輕微振蕩，離心去上清，水洗；重復以上過程，在BSA納米粒子表面交替吸附PAH 和PSS，組裝2個雙層后得到PSS為表面層的核殼結構的納米粒子，其透射電鏡圖見圖2 ；5)將步驟4)所得的微粒分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5 mL 2mg/mL聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH水溶液，孵化15min，期間輕微振蕩，然后離心去上清，水洗三次，得到包覆PEG的納米粒子，其透射電鏡圖見圖3 ；6)將步驟5)所得的納米粒子分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5mL I. 5mg/mL N-輕基琥拍酰亞胺溶液,孵化15min ;加入0. 5mL I. 5mg/mL的碳二亞胺和6 ii g/mL氨基修飾的適配體，反應20min，離心去上清，水洗三次，得到多功能納米粒子，其透射電鏡圖見圖4。
實施例2步驟同實例1，但在步驟2)中是將相對分子質量為2000的一端帶有羧基、一端帶有醛基的聚乙二醇加入lOmg/mL的相對分子質量為15000聚賴氨酸溶液中，保持二者的質量比為4. 3 調節(jié)混合溶液pH值為8. 5,反應6小時后透析,凍干,合成的是聚賴氨酸-g_聚乙二醇-COOH ;在步驟3) -5)中使用聚賴氨酸(PLL)溶液代替2mg/mL的PAH溶液，肝素 (11印&1^11)溶液代替PSS溶液，聚賴氨酸-g-聚乙二醇-COOH溶液代替聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH溶液，所得多功能納米微粒的透射電鏡圖見圖5。
實施例3步驟同實例1，但在步驟3)和4)中使用聚賴氨酸溶液代替PAH溶液，肝素溶液代替PSS溶液。
實施例4步驟同實例I，但在步驟3)和4)中使用殼聚糖溶液代替PAH溶液，硫酸軟骨素溶液代替PSS溶液。
實施例5步驟同實例1，但在步驟I中用人血清白蛋白代替牛血清白蛋白，在步驟3)和4)中使用聚乙烯亞胺溶液代替PAH溶液，透明質酸溶液代替PSS溶液。
實施例6步驟同實例1，但在步驟I)中用明膠代替牛血清白蛋白，在步驟3)和4)中使用陽離子化葡聚糖溶液代替PAH溶液，DNA溶液代替PSS溶液。
表I是具有不同最外層的粒子在不同介質中的穩(wěn)定性對比。
表ITopHfiPBSMedium (10%FBS)BSA214(0. 06)634(0. 26)247(0.18)PSS222(0. 10)agglomeration487(0. 21)PAH699(0. 19)agglomeration443(0. 24)PAH(15)-g-PEG(2)9267(0. 18)435(0. 19)267(0. 19)PAH(15)-g-PEG(2)25.6290(0. 11)284(0. 08)253(0. 23)PAH-g-PEG-COOH41.7296(0. 12)287(0. 10)260(0. 20)PAH-g-PEG41.7-Apt290(0. 12)288(0. 11)265(0. 19)Heparin527(0. 11)Agglomeration550(0. 19)PLL-g-PEG5.3278————PLL-g-PEGn. 9277————PLL-g-PEG20.4266————
權利要求
1.一種制備多功能納米載體的方法，包括以下步驟1)將濃度為100mg/mL的蛋白質水溶液,調至pH=7;在磁力攪拌下，以0. 5mL/min的速度加入乙醇，蛋白質水溶液與乙醇的體積比I :4，持續(xù)攪拌，然后加入0.8 % w/v戊二醛交聯(lián)劑，戍二醒與蛋白質質量比為I U g :lmg,反應6小時,離心洗漆,凍干,得到蛋白質納米粒子;2)將相對分子質量為2000的一端帶有羧基、一端帶有醛基的聚乙二醇加入lOmg/mL的相對分子質量為15000的聚烯丙基胺或者相對分子質量為15000聚賴氨酸溶液中，保持二者的質量比為4. 3 :1，調節(jié)混合溶液pH值為8. 5，反應6小時后透析，凍干，得到聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH或聚賴氨酸-g-聚乙二醇-COOH ；3)將聚陽離子、聚陰離子和聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH分別溶解于IMNaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚電解質溶液；或者將聚陽離子、聚陰離子和聚賴氨酸-g-聚乙二醇-COOH分別溶解于IM NaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚電解質溶液；4)取步驟I)制備的蛋白質納米粒子分散于水中，得到濃度為0.5% w/w蛋白質粒子懸浮液，于離心管中超聲分散，離心除去上清液；往離心管中加入ImL三蒸水，超聲分散；加入步驟3)配制的聚陽離子溶液0. 5mL，孵化15min，期間輕微振蕩離心管；離心去上清，水洗， 得到吸附聚陽離子的蛋白質納米粒子懸浮液，然后加入步驟3)配制的0. 5mL聚陰離子溶液，孵化15min，期間輕微振蕩，離心去上清，水洗；重復以上過程，在納米粒子表面交替吸附帶相反電荷的聚電解質，組裝2個雙層后得到表面為聚陰離子的核殼結構的納米粒子；5)將步驟4)所得的核殼結構的納米粒子分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5 mL 步驟3)配制的聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH或者聚賴氨酸-g_聚乙二醇-C00H，反應 15min,期間輕微振蕩，然后離心去上清，水洗，得到表面為聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH 或聚賴氨酸-g_聚乙二醇-COOH的納米粒子；6)將步驟5)所得的微粒分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5mL I. 5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺溶液，孵化15min ;再加入0. 5mL I. 5mg/mL的N- 二甲胺基丙基-N，-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和6 ii g/mL適配體分子,反應20min,離心去上清,水洗,得到多功能納米載體。
2.根據(jù)權利要求I所述的制備多功能納米載體的方法，其特征是所說的蛋白質是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或者明膠。
3.根據(jù)權利要求I所述的制備多功能納米載體的方法，其特征是所說的聚陽離子是聚烯丙基胺鹽酸鹽、聚二烯丙基二甲基季銨鹽、殼聚糖、膠原、聚賴氨酸、陽離子化葡聚糖、陽離子化聚丙烯酸酯或聚乙烯亞胺。
4.根據(jù)權利要求I所述的制備多功能納米載體的方法，其特征是所說的聚陰離子是聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、硫酸軟骨素、硫酸肝素、透明質酸、硫酸葡聚糖、 DNA或羧甲基纖維素鈉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過退溶技術和層層組裝修飾技術制備多功能納米載體的方法。在攪拌條件下，在蛋白質的水溶液中,逐漸滴加不良溶劑乙醇，使蛋白質從溶液中逐漸析出并沉淀出來納米粒子；加入戊二醛交聯(lián)劑穩(wěn)定納米粒子結構后，用水洗滌；在納米粒子表面交替沉積多層聚電解質膜，最外層沉積接枝有短鏈聚氧乙烯的聚電解質，得到聚電解質修飾的納米粒子；進一步在聚氧乙烯的羧基端固定靶向分子適配體，從而得到多功能納米載體。本發(fā)明制備方法簡單、材料來源廣泛、生產(chǎn)效率高，得到的納米粒子具有良好的穩(wěn)定性和靶向癌細胞等特點，有良好的應用前景。
文檔編號C08G81/00GK102532580SQ201210024989
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月6日 優(yōu)先權日2012年2月6日
發(fā)明者仝維鋆, 謝黎黎, 高長有 申請人:浙江大學