專利名稱：用于預(yù)防腫瘤復(fù)合制劑的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防腫瘤復(fù)合制劑，具體涉及一種用于預(yù)防腫瘤復(fù)合制劑的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝。
背景技術(shù)：
鑒于腫瘤的高發(fā)，而預(yù)防、治療手段有限，以及抗氧化在預(yù)防腫瘤中的重要性，目前市場(chǎng)上迫切需要一種復(fù)合型制劑，起到預(yù)防腫瘤及抗氧化的復(fù)合功效。目前缺乏預(yù)防癌癥和抗氧化的產(chǎn)品，而且所依據(jù)的理論較為單一，缺乏中西醫(yī)的相互驗(yàn)證要么依據(jù)中醫(yī)理論發(fā)掘傳統(tǒng)藥方，缺乏現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持；難以滿足同時(shí)預(yù)防腫瘤及抗氧化的需求?，F(xiàn)有用于預(yù)防腫瘤復(fù)合制劑的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝為粗多糖，粗多糖中的成分未進(jìn)行細(xì)分，有的具有免疫刺激作用，有的具有免疫調(diào)節(jié)作用，混在一起使用，會(huì)產(chǎn)生效應(yīng)抵消，而本發(fā)明對(duì)冬蟲夏草粗多糖的成分進(jìn)行了細(xì)分，以促進(jìn)腫瘤免疫的單一組分為目標(biāo)，效果更顯著。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種用于預(yù)防腫瘤復(fù)合制劑的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝，此冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝，對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中粗多糖中的成分進(jìn)行細(xì)分，篩選出具有促進(jìn)抗腫瘤免疫細(xì)胞增殖的組分，增強(qiáng)了機(jī)體抗腫瘤免疫力效果。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于預(yù)防腫瘤復(fù)合制劑的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝，包括以下步驟
步驟一、取蟲草發(fā)酵提取液濃縮而成的菌粉100g，加入4L H2O,煮沸4h后趁熱紗布過濾除去殘?jiān)?br> 步驟二、將經(jīng)步驟一獲得的濾液加熱濃縮至IL獲得濃縮液；
步驟三、將步驟二的濃縮液收集于IL燒杯中，70°C水浴濃縮至400ml ；
步驟四、將步驟三中濃縮液分裝至8個(gè)50ml的離心管中，在4500 rpm離心速率下處理lOmin，獲得水溶性蟲草多糖溶液；
步驟五、收集經(jīng)步驟四溶液中的上清液約400ml，去除不溶性雜質(zhì)，至2L燒杯中，緩慢加入4倍體積無水乙醇后靜置獲得醇沉液；
步驟六、將步驟五的醇沉液分裝至40個(gè)50ml離心管中，在4500 rpm離心速率下處理IOmin后將所述各個(gè)離心管內(nèi)醇沉多糖收集至4個(gè)50ml離心管中；
步驟七、通過100%乙醇洗經(jīng)步驟六的所述醇沉多糖2次，真空低溫冷凍干燥獲得冬蟲夏草菌絲體多糖；
步驟八、將步驟七的冬蟲夏草菌絲體多糖溶于蒸餾水中，攪拌2小時(shí)后，IOOOOrpm離心速率下處理5分鐘得到上清液，在此上清液中加入100%乙醇，邊加邊攪拌，4°C沉淀小時(shí)后，再在IOOOOrpm離心速率下處理5分鐘沉淀后將此時(shí)沉淀物經(jīng)真空低溫冷凍干燥獲得所述冬蟲夏草菌絲體多糖粉體。上述技術(shù)方案中的進(jìn)一步改進(jìn)方案如下
I、上述方案中，所述步驟二中濾液加熱時(shí)同時(shí)進(jìn)行攪拌操作。2、上述方案中，所述步驟二中在70°C水浴中保持時(shí)間為24h。3、上述方案中，所述步驟五中靜置溫度為4°C，時(shí)間為12h。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果
本發(fā)明用于預(yù)防腫瘤復(fù)合制劑的冬蟲夏草菌絲體多糖粉體提取工藝，對(duì)粗多糖中的成分進(jìn)行細(xì)分，采用多步提取步驟，獲得多種組分，并比較不同組分的生理功效，以促進(jìn)腫瘤免疫的單一組分為目標(biāo)，使獲得的產(chǎn)品在增強(qiáng)抗腫瘤免疫性能方面更顯著。


附圖I為本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)在殺傷腫瘤細(xì)胞性能方面的比較圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
實(shí)施例一種用于預(yù)防腫瘤復(fù)合制劑的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝，包括以下步
驟
步驟一、取蟲草發(fā)酵提取液濃縮而成的菌粉100g，此菌粉由蟲草發(fā)酵液脫水形成，加入4L H2O,煮沸4h，趁熱紗布過濾除去殘?jiān)?。重?fù)3次；
步驟二、收集所有濾液(約5L)加熱濃縮至1L。注意邊加熱邊攪拌，防止粘底；
步驟三、濃縮液收集于IL燒杯中，70°C水浴濃縮至400ml，在該溫度下，溶劑揮發(fā)速度較快，溫度過高，則會(huì)影響多糖活性，防止加熱過程中多糖碳化。需要24h ；
步驟四、濃縮液分裝至8個(gè)50ml的離心管中，4500 rpm離心lOmin，獲得水溶性蟲草多糖溶液；
步驟五、收集上清液約400ml，除去不溶性雜質(zhì)；至2L燒杯中，緩慢加(120ml/分鐘)入4倍體積(4倍體積乙醇處理后獲得的蟲草多糖生物活性好)無水乙醇，至乙醇終濃度(400ml上清液加入1600ml乙醇后，體系的總體積為2L，1600ml除以2L就是終濃度)75%，4°C靜置12h。注意邊加乙醇邊攪拌；
步驟六、2000ml醇沉液分裝至40個(gè)50ml離心管中，4500rpm離心IOmin,傾去上清液，所有醇沉多糖收集至4個(gè)50ml離心管中；
步驟七、100%乙醇洗沉淀物2次，真空低溫冷凍干燥；
步驟八、將冬蟲夏蟲菌絲體多糖5g溶于500ml蒸餾水中，攪拌過夜，IOOOOrpm離心5分鐘，得到500ml上清，在上清中加入100%乙醇500ml，邊、加邊攪拌，4°C沉淀過夜，IOOOOrpm
離心5分鐘，沉淀即為冬蟲夏草菌絲體多糖組分，此時(shí)沉淀物經(jīng)真空低溫冷凍干燥獲得所述冬蟲夏草菌絲體多糖粉體，放置在干燥環(huán)境中保存。如附圖I所示，在放大倍數(shù)40倍的條件下，圖I中(a)為本發(fā)明在殺傷腫瘤細(xì)胞性能方面檢測(cè)圖，圖I中(b)為現(xiàn)有技術(shù)在殺傷腫瘤細(xì)胞性能方面檢測(cè)圖，將腫瘤細(xì)胞系MCA205 (纖維肉瘤細(xì)胞)接種于細(xì)胞培養(yǎng)12孔板中，細(xì)胞接種密度為I X IO5/孔，同時(shí)加入冬蟲夏草菌絲體多糖，濃度均為0. 2mg/ml，多糖分別為本產(chǎn)品(ccg-150冬蟲夏草菌絲體多糖組分)和現(xiàn)有產(chǎn)品(冬蟲夏草菌絲體粗多糖)。培養(yǎng)3天后，顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，本產(chǎn)品組中腫瘤細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞碎片較多，而本發(fā)明組中腫瘤細(xì)胞有部分死亡，視野左下角的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好。經(jīng)兩者比較說明，本發(fā)明對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較好的殺傷作用。
上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防腫瘤復(fù)合制劑的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝，其特征在于包括以下步驟 步驟一、取蟲草發(fā)酵提取液濃縮而成的菌粉lOOg，加入4L H2O,煮沸4h后趁熱紗布過濾除去殘?jiān)? 步驟二、將經(jīng)步驟一獲得的濾液加熱濃縮至IL獲得濃縮液； 步驟三、將步驟二的濃縮液收集于IL燒杯中，70°C水浴濃縮至400ml ； 步驟四、將步驟三中濃縮液分裝至8個(gè)50ml的離心管中，在4500 rpm離心速率下處理lOmin，獲得水溶性蟲草多糖溶液； 步驟五、收集經(jīng)步驟四溶液中的上清液約400ml，去除不溶性雜質(zhì)，至2L燒杯中，緩慢加入4倍體積無水乙醇后靜置獲得醇沉液； 步驟六、將步驟五的醇沉液分裝至40個(gè)50ml離心管中，在4500 rpm離心速率下處理IOmin后將所述各個(gè)離心管內(nèi)醇沉多糖收集至4個(gè)50ml離心管中； 步驟七、通過100%乙醇洗經(jīng)步驟六的所述醇沉多糖2次，真空低溫冷凍干燥獲得冬蟲夏草菌絲體多糖； 步驟八、將步驟七的冬蟲夏草菌絲體多糖溶于蒸餾水中，攪拌2小時(shí)后，IOOOOrpm離心速率下處理5分鐘得到上清液，在此上清液中加入100%乙醇，邊加邊攪拌，4°C沉淀小時(shí)后，再在IOOOOrpm離心速率下處理5分鐘沉淀后將此時(shí)沉淀物經(jīng)真空低溫冷凍干燥獲得所述冬蟲夏草菌絲體多糖粉體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝，其特征在于所述步驟二中濾液加熱時(shí)同時(shí)進(jìn)行攪拌操作。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝，其特征在于所述步驟二中在70°C水浴中保持時(shí)間為24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝，其特征在于所述步驟五中靜置溫度為4°C，時(shí)間為12h。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于預(yù)防腫瘤復(fù)合制劑的冬蟲夏草菌絲體多糖提取工藝，包括取蟲草發(fā)酵提取液濃縮而成的菌粉100g煮沸；將濾液加熱獲得濃縮液；將濃縮液收集于水浴濃縮；將濃縮液分裝至8個(gè)離心管離心獲得水溶性蟲草多糖溶液；收集溶液中的上清液后，緩慢加入4倍體積無水乙醇后靜置獲得醇沉液；在離心將各個(gè)離心管內(nèi)醇沉多糖收集至離心管中；通過乙醇洗所述醇沉多糖2次，真空低溫冷凍干燥獲得冬蟲夏草菌絲體粗多糖；將冬蟲夏草菌絲體粗多糖溶于蒸餾水中，經(jīng)適當(dāng)濃度乙醇再次處理后得到沉淀，將此時(shí)沉淀物經(jīng)真空低溫冷凍干燥獲得所述冬蟲夏草菌絲體多糖粉體。本發(fā)明對(duì)粗多糖中的成分進(jìn)行細(xì)分，篩選出具有促進(jìn)抗腫瘤免疫細(xì)胞增殖的組分，增強(qiáng)了機(jī)體抗腫瘤免疫力效果。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102653567SQ20121011342
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者劉小龍, 吳培華, 陶寧 申請(qǐng)人:劉小龍, 陶寧