專利名稱：一種生物醫(yī)學(xué)用超順磁性復(fù)合微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種微生物技術(shù)與高分子磁微球結(jié)合，用于腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的功能性超順磁性復(fù)合微球的制備方法。
背景技術(shù)：
對(duì)于癌癥患者，細(xì)胞在初期發(fā)生病變和癌細(xì)胞在形成時(shí)，組織和血液中便會(huì)存在微量癌細(xì)胞?！と绻茉缙诎l(fā)現(xiàn)細(xì)胞癌變，治愈率可達(dá)80%，這是世界衛(wèi)生組織的權(quán)威性結(jié)論。故及時(shí)簡(jiǎn)單的檢測(cè)出循環(huán)血液中的微量的癌細(xì)胞，對(duì)預(yù)防腫瘤細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)散對(duì)癌癥患者的治療具有重要意義。目前關(guān)于擴(kuò)散腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的檢測(cè)技術(shù)有熒光標(biāo)記法、HE染色法、免疫組織化學(xué)法、PCR技術(shù)、流式細(xì)胞儀等檢測(cè)手段，但是這些方法檢測(cè)過程復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間和精力，對(duì)檢測(cè)人員的要求高，檢測(cè)成本高，對(duì)病人帶來的痛苦大。利用具有超順磁性帶有特異性抗體的磁性微球，在外加磁場(chǎng)下，能夠快速的將吸附有特異性抗原的微量細(xì)胞進(jìn)行富集和分離，富集到的細(xì)胞用顯微鏡或特異性的檢測(cè)試紙就能判斷出組織或血液中是否有病原存在。本發(fā)明制備出的磁微球具備以上功能，具有很好的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述問題，提供一種簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案用于腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的磁性復(fù)合微球，其粒徑為納米到微米級(jí)，具有高的比表面積，能夠偶聯(lián)高含量的單克隆抗體，能夠更好的與特異性抗原結(jié)合，而對(duì)于沒有抗原的細(xì)胞沒有任何作用；又因?yàn)閺?fù)合微球具有超順磁性，在外加磁場(chǎng)下能夠快速簡(jiǎn)單的進(jìn)行分離。根據(jù)要檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞選擇不同的單克隆抗體偶聯(lián)到磁性微球表面，根據(jù)抗原抗體的特異靶向識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)抗原。借助外加磁場(chǎng)很容易的將吸附腫瘤細(xì)胞的磁性微球分離出來，在光學(xué)顯微鏡下就可以觀察到磁性微球是否吸附了腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明采用的免疫導(dǎo)向技術(shù)具有高度專ー性、特異性有望于用于多種腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。本發(fā)明的主要目的是提供一種能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞的磁性微球的制備方法可以偶聯(lián)肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌等任何一種細(xì)胞抗體的磁性復(fù)合微球的制備方法主要由以下步驟組成ー種生物醫(yī)學(xué)用超順磁性復(fù)合微球的制備方法，其特征在于(I)采用共沉淀法制備的超順磁性Fe3O4納米粒子；制備方法為按O. 5mol/L分別配 FeCl3 · 6H20 和 FeCl2 · 4H20 溶液，按[Fe3+] : [Fe2+] =L 5 2:1 的配比分別量取 FeCl3 · 6H20和FeCl2 · 4H20溶液，配成混合液，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，50°C 80°C下加入氨水，調(diào)節(jié)體系pH=擴(kuò)11，攪拌均勻后待體系冷卻至室溫，用去離子水洗滌至中性得到Fe3O4納米粒子；(2)取洗滌至中性的Fe3O4分散到去離子水中，氮?dú)獗Ｗo(hù)升溫至60°C 80°C，加入Fe3O4總質(zhì)量22. 39Γ55. 8%的油酸，反應(yīng)3(T60min，冷卻至室溫，加入油酸質(zhì)量30% 50%的十_■燒基苯橫酸納；(3)將100份分散介質(zhì)，相對(duì)分散介質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%-2. 5%的分散劑分散到四ロ燒瓶中，升溫?cái)嚢柚练稚┤芙?；將體積份數(shù)為1(Γ30份的磁流體，7^10份單體，O. Tl份ニこ烯基苯交聯(lián)劑，單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)O. 6°/Γ4%的引發(fā)劑混合，超聲分散均勻；氮?dú)獗Ｗo(hù)下，升溫至65 80°C，控制轉(zhuǎn)速在30(T800rpm下，將上述超聲分散均勻的混合物滴加入四ロ燒瓶中，反應(yīng)4 10h ;反應(yīng)結(jié)束后用こ醇和去離子水洗滌產(chǎn)物，室溫真空干燥得表面羧基化的超順磁性復(fù)合微球備用；所述的單體為苯こ烯或甲基丙烯酸甲酯中的一種或兩者混合物，與甲基丙烯酸或丙烯酸中的ー種；引發(fā)劑為過氧化苯甲?；蜻^硫酸鉀中的一種或兩者混合物；分散介質(zhì)為こ醇或去離子水中的ー種或兩者復(fù)合；分散劑為聚こ烯醇或聚こ烯基吡咯烷酮。
(4)偶聯(lián)抗體的磁微球的制備方法為取一定量權(quán)利要求I步驟(3)中制備的磁微球，浸泡到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸水溶液中，室溫過夜；將處理后的磁微球用磷酸鹽緩沖液洗滌，除去微球表面的醋酸，最后用磷酸鹽緩沖液稀釋磁微球，用移液器吸取200 μ L上述磷酸鹽緩沖液稀釋的磁微球懸浮液，按照微球與熒光二抗質(zhì)量比為100:1的配比，按照微球與熒光二抗質(zhì)量比為100:1的配比，將FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG溶液與磁微球懸濁液混合，在4°C 37°C恒溫?fù)u床中150r/min震蕩2h 24h。實(shí)驗(yàn)中的熒光二抗替換為肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌等任何一種細(xì)胞抗體或抗原。本發(fā)明合成的磁性復(fù)合微球的粒徑范圍在10 150 μ m之間,磁含量可達(dá)30%,微球的飽和磁化強(qiáng)度可達(dá)18. 35 emu/g，且具有超順磁性，在外加磁場(chǎng)下30s就可將磁微球從溶液中完全分離，撤除磁場(chǎng)微球磁性消失且可被重新分散。磁微球表面含有親水基團(tuán)羧基，羧基可以與抗體偶合。通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡用波長(zhǎng)為488nm的激發(fā)，可看到磁微球發(fā)綠光，實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明制備的磁微球表面羧基可以成功偶聯(lián)抗體。本發(fā)明合成的微球，磁含量較高，具有超順磁性，表面羧基基團(tuán)具有活性，并且磁微球制備エ藝簡(jiǎn)單，陳本較低，在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)等方面具有很廣的應(yīng)用前景。


圖I本發(fā)明超順磁性復(fù)合微球光學(xué)顯微鏡照片圖2本發(fā)明超順磁性微球包被熒光二抗后a.顯微鏡照片b.熒光照片圖3本發(fā)明超順磁性微球包被熒光二抗激光共聚焦顯微鏡照片圖4本發(fā)明超順磁性微球熱失重曲線圖5本發(fā)明超順磁性微球微球磁滯回線圖6本發(fā)明超順磁性微球紅外譜圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一按O. 5mol/L分別配制IOOmL標(biāo)準(zhǔn)FeCl3 · 6H20和FeCl2 · 4H20溶液，取63mL Fe3+溶液和37mL Fe2+溶液置于250ml四ロ燒瓶中。氮?dú)獗Ｗo(hù)下高速攪拌，水浴加熱體系至80°C，迅速加入濃氨水，調(diào)節(jié)體系pH=10。此時(shí)體系立即變?yōu)辄\色，水解產(chǎn)生大量的黑色Fe3O4納米粒子。反應(yīng)lh，繼續(xù)通氮?dú)庵馏w系冷卻至室溫，用去離子水洗滌多次至上清液的pH值至中性。稱取凈含量為3g的Fe3O4納米粒子，分散到IOOmL去離子水中，氮?dú)獗Ｗo(hù)升溫至80°C，加入I. 34g油酸，反應(yīng)40min，冷卻至室溫，加入O. 67g十二烷基苯磺酸鈉，攪拌半小吋，制得磁流體，將制備出的磁流體密封保存。取20ml磁流體，6mL苯こ烯，2mL甲基丙烯酸，O. 7mL ニこ烯基苯，O. 28g過氧化苯甲酰，將上述物質(zhì)混合超聲20min。在四ロ燒瓶中加入IOOmL去離子水，Ig聚こ烯醇。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，升溫至75°C,控制轉(zhuǎn)速為500rpm下,將上述超聲結(jié)束的混合物滴加入四ロ燒瓶中，反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束分別用こ醇和去離子水洗滌3次，室溫真空干燥備用。取制備的磁性復(fù)合微球3mg浸泡到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 1%的醋酸中，室溫過夜。用PBS緩沖液(PBS，pH=7. 1 · 4)洗滌除去微球表面的醋酸，最后用PBS稀釋磁微球至濃度為50mg/mL，用移液器吸取200 μ L上述PBS磁微球懸浮液，加入O. 5mg/mL 200 μ LFITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG。在25°C恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為150r/min，震蕩12h。實(shí)施例ニ 本實(shí)施方式與實(shí)施例一的不同點(diǎn)在于按O. 5mol/L分別配制IOOmL標(biāo)準(zhǔn) FeCl3 · 6H20 和 FeCl2 · 4H20 溶液，取 60mL Fe3+ 溶液和 40mL Fe2+ 溶液置于 250ml 四ロ燒瓶中。氮?dú)獗Ｗo(hù)下高速攪拌，水浴加熱體系至50°C,迅速加入濃氨水,調(diào)節(jié)體系pH=9。此時(shí) 體系立即變?yōu)辄\色，水解產(chǎn)生大量的黒色Fe3O4納米粒子。反應(yīng)lh，繼續(xù)通氮?dú)庵馏w系冷卻至室溫，用去離子水洗滌多次至上清液的PH值至中性。稱取凈含量為3g的Fe3O4納米粒子，分散到IOOmL去離子水中，氮?dú)獗Ｗo(hù)升溫至60°C，加入I. 67g油酸，反應(yīng)30min，冷卻至室溫，加入O. 5g十二燒基苯磺酸鈉,攪拌半小時(shí),制得磁流體。實(shí)施例三本實(shí)施方式與實(shí)施例一的不同點(diǎn)在于按O. 5mol/L分別配制IOOmL標(biāo)準(zhǔn) FeCl3 · 6H20 和 FeCl2 · 4H20 溶液，取 66. 5mL Fe3+ 溶液和 33. 5mL Fe2+ 溶液置于 250ml 四ロ燒瓶中。氮?dú)獗Ｗo(hù)下高速攪拌，水浴加熱體系至75°C，迅速加入濃氨水，調(diào)節(jié)體系pH=lI。此時(shí)體系立即變?yōu)楹谏?，水解產(chǎn)生大量的黑色Fe3O4納米粒子。反應(yīng)60min，繼續(xù)通氮?dú)庵馏w系冷卻至室溫，用去離子水洗滌多次至上清液的pH值至中性。稱取凈含量為3g的Fe3O4納米粒子，分散到IOOmL去離子水中，氮?dú)獗Ｗo(hù)升溫至70°C，加入O. 67g油酸，反應(yīng)lh，冷卻至室溫，加入O. 26g十二燒基苯磺酸鈉,攪拌半小時(shí),制得磁流體。
實(shí)施例四本實(shí)施方式與實(shí)施例ニ的不同點(diǎn)在于取IOmL磁流體,6mL苯こ烯，2mL甲基丙烯酸甲酷，2mL甲基丙烯酸，2mLニこ烯基苯，O. 15g過氧化苯甲酰和O. 05g過硫酸鉀。在四ロ燒瓶中加入80mL去離子水和20mLこ醇，2. 4g聚こ烯醇。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，升溫至80°C，控制轉(zhuǎn)速在800rpm下，將上述超聲結(jié)束的混合物滴加入四ロ燒瓶中，反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后分別用こ醇和去離子水洗滌3次，室溫真空干燥備用。取制備的磁性復(fù)合微球3mg浸泡到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 1%的醋酸中，室溫過夜。用PBS緩沖液洗滌除去微球表面的醋酸，最后用PBS稀釋磁微球至濃度為50mg/mL，用移液器吸取200 μ L上述PBS磁微球懸浮液，加入O. 5mg/mL 200 μ L FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG。在37°C恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為150r/min，震蕩2h。實(shí)施例五本實(shí)施方式與實(shí)施例三的不同點(diǎn)在于取30mL磁流體,6mL苯こ烯，2mL甲基丙烯酸甲酷，ImL丙烯酸，ImL ニこ烯基苯，O. 05g過氧化苯甲酰，將上述物質(zhì)混合分散20min。在四ロ燒瓶中加入IOOmLこ醇，O. 4g聚こ烯吡咯烷酮。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，升溫至65°C，控制轉(zhuǎn)速在300rpm下，將上述超聲結(jié)束的混合物滴加入四ロ燒瓶中，反應(yīng)10h。反應(yīng)結(jié)束后分別用去こ醇和去離子水洗滌3次，室溫真空干燥備用。取制備的磁性復(fù)合微球3mg浸泡到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 1%的醋酸中，室溫過夜。用PBS緩沖液洗滌除去微球表面的醋酸，最后用PBS稀釋磁微球至濃度為50mg/mL，用移液器吸取200 μ L上述PBS磁微球懸浮液，加入O. 5mg/mL 200 μ L FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG。在4°C恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為150r/min，震蕩24h。附圖為具體實(shí)施例五條件下制備的微球的測(cè)試結(jié)果，其余條件下制備出的微球與具體實(shí)施例五制備出的微球只是在微球粒徑大小，粒徑分布，微球的磁含量，飽和磁化強(qiáng)度 和表面羧基含量上有區(qū)別，但是所有條件下制備出的磁微球均能用于腫瘤細(xì)胞檢測(cè)，且實(shí)施例中的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG可被肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌等任何一種細(xì)胞抗體或抗原所替代。
權(quán)利要求
1.ー種生物醫(yī)學(xué)用超順磁性復(fù)合微球的制備方法，其特征在于包括步驟 (O采用共沉淀法制備的超順磁性Fe3O4納米粒子；制備方法為按O. 5mol/L分別配FeCl3 · 6H20 和 FeCl2 · 4H20 溶液，按[Fe3+] : [Fe2+J=L 5 2:1 的配比分別量取 FeCl3 · 6H20 和FeCl2 · 4H20溶液，配成混合液，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，50°C 80°C下加入氨水，調(diào)節(jié)體系pH=擴(kuò)11，攪拌均勻后待體系冷卻至室溫，用去離子水洗滌至中性得到Fe3O4納米粒子； (2)取洗滌液至中性的Fe3O4納米粒子分散到去離子水中，氮?dú)獗Ｗo(hù)升溫至60°C 80°C，加入Fe3O4總質(zhì)量22. 39Γ55. 8%的油酸，反應(yīng)3(T60min，冷卻至室溫，加入油酸質(zhì)量30% 50%的十二烷基苯磺酸鈉，得到表面被改性的Fe3O4 納米粒子磁流體。
(3)將100份分散介質(zhì)，相對(duì)分散介質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O.59Γ2. 5%的分散劑分散到四ロ燒瓶中，攪拌至分散劑溶解；將體積份數(shù)為1(Γ30份的磁流體，7 10份單體，O. Tl份こ乙烯基苯交聯(lián)劑，單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)O. 6°/Γ4%的引發(fā)劑混合，超聲分散均勻；氮?dú)獗Ｗo(hù)下，升溫至65 80°C，控制轉(zhuǎn)速在30(T800rpm下，將上述超聲分散 均勻的混合物滴加入四ロ燒瓶中，反應(yīng)4 10h ;反應(yīng)結(jié)束后用こ醇和去離子水洗滌產(chǎn)物，室溫真空干燥得表面羧基化的超順磁性復(fù)合微球備用； 所述的單體為苯こ烯或甲基丙烯酸甲酯中的一種或兩者混合物，與甲基丙烯酸或丙烯酸中的ー種；引發(fā)劑為過氧化苯甲?；蜻^硫酸鉀中的一種或兩者混合物；分散介質(zhì)為こ醇或去離子水中的ー種或兩者復(fù)合；分散劑為聚こ烯醇或聚こ烯基吡咯烷酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法制備的ー種生物醫(yī)學(xué)用超順磁性復(fù)合微球的應(yīng)用，其特征在于取超順磁性復(fù)合微球，浸泡到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸水溶液中，室溫過夜；將處理后的磁微球用磷酸鹽緩沖液洗滌，除去微球表面的醋酸，最后用磷酸鹽緩沖液稀釋磁微球，按照微球與熒光二抗質(zhì)量比為100:1的配比，將FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG溶液與磁微球懸濁液混合，在4°C 37°C恒溫?fù)u床中150r/min震蕩2h 24h。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其中熒光二抗替換為肝癌、肺癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌任何一種細(xì)胞抗體或抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)學(xué)用超順磁性復(fù)合微球的制備方法。首先，采用共沉淀法制備具有超順磁性的Fe3O4納米粒子，制備出的Fe3O4納米粒子經(jīng)表面活性劑修飾，分散到去離子水中形成水基磁流體。其次，制備表面具有羧基官能團(tuán)的無機(jī)/有機(jī)核殼微球，所述的超順磁性復(fù)合微球?yàn)闊o機(jī)/有機(jī)核殼結(jié)構(gòu)，具有復(fù)合物材料的特性和生物學(xué)效應(yīng)，微球表面具有活性官能團(tuán)，可以與多種生物活性物質(zhì)結(jié)合。本發(fā)明方法制備的磁微球表面含有活性羧基基團(tuán)，且具有超順磁性，磁含量大，在外加磁場(chǎng)下很容易被磁化分離，移除磁場(chǎng)微球磁性立即消失。本發(fā)明制備的磁微球可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及分離操作。此方法實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，快速、成本低。
文檔編號(hào)C08F292/00GK102718931SQ20121015701
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者于坤, 幺崇正, 楊冬芝, 聶俊 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)