專利名稱：虎皮蘭多糖及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物活性成份的提取，具體地說是虎皮蘭多糖及其制備方法和應用。
背景技術：
虎皮蘭tri/ksciate)又名金邊虎皮蘭,典型的龍舌蘭科虎尾蘭屬植物。這種植物源自于非洲西部，是一種常綠多年生草本植物，在熱帶、亞熱帶均有分布，對環(huán)境的適應能力強?；⑵ぬm具有根狀莖，葉片堅挺直立，姿態(tài)剛毅，劍型的葉片，深綠色葉片邊緣伴有黃色帶狀條紋。它品種較多，株形和葉色變化較大，精美別致，是一種適合盆栽的室內觀賞 性植物，即使在低光照、少水分條件下依然可生存。此外，由于虎皮蘭葉片中含有大量麻質纖維，葉片韌性強，可用于造紙加工業(yè)和優(yōu)質纖維品種的開發(fā)中。同時，虎皮蘭還是一種能凈化室內環(huán)境的觀葉植物。經(jīng)NASA研究發(fā)現(xiàn)，虎皮蘭能夠提高室內空氣質量，被動吸收類似氮氧化合物及甲醛等有害氣體，常作為一種室內環(huán)保型觀葉植物深受大眾喜愛。另外，藥理作用方面，金邊虎皮蘭味甘微辛，性平，無毒，具有潤肺、化痰止咳之功，可用于化痰定喘，治咳嗽吐血、治哮喘等。近年來研究表明，虎皮蘭中含有大量的蛋白質、鈣、粗纖維、色素及各種人體所必需的營養(yǎng)元素，虎皮蘭中的氨基酸種類齊全、含量豐富，所含多種人體必需的微量元素，維生素C含量較高，重金屬元素的含量低于我國食品重金屬殘留限量國家標準。多糖(polysaccharides)又稱多聚糖,是由多個單糖單位、如醒糖或酮糖通過苷鍵連接在一起的多聚物。多糖按其在生物體內的功能可分為兩類一類水不溶性的，用于形成動植物的支持介質，如植物中的纖維素、動物中的甲殼素等；另一類是動植物的貯存養(yǎng)料，在酶的催化作用下水解釋放單糖來提供能量，如淀粉、糖原等。其中，由一種單糖組成的多糖稱作均多糖，由兩種以上單糖組成的多糖稱作雜多糖。多糖廣泛存在于高等植物、微生物(真菌、細菌)、藻類等細胞壁中，以及動物細胞膜中，目前對其研究較多的是植物多糖和真菌類多糖。自從1936年Shear發(fā)現(xiàn)了多糖抑制腫瘤活性以來，科學家相繼提出一些高等植物多糖和真菌類生物多糖也具有明顯的抗腫瘤活性。20世紀50年代，隨著我國中藥和天然藥物化學的發(fā)展，中藥多糖顯著的免疫活性，為中藥免疫藥理學提供了依據(jù)。70年代以來，隨著對新藥物資源的探索與研究，人們對多糖及其復合物作用的認識逐步深入，多糖作為能量來源與構成材料，存在于細胞膜結構中，并參與細胞的各種生命活動，從而有了后繼對于多糖其他生物活性的研究，如抗腫瘤、免疫調節(jié)、抗菌抗病毒、抗氧化、降血脂、抗輻射等作用，近年來，又發(fā)現(xiàn)多糖在控制細胞的分裂和分化，調節(jié)自身的生長和衰老方面起著決定性作用。因此，針對多糖的分離純化、化學組成和結構分析，以及生物活性測定等方面展開一系列深入研究，并對其進行化學修飾，通過研究多糖構效關系，從而提高多糖的活性，為尋求和探索靶向抗腫瘤藥物的研制提供堅實的理論基礎。
日本對植物多糖的提取純化技術有日新月異的發(fā)展，分別從新工藝、新資源、新用途上對多糖的利用進行改進。在歐美一些國家，一些特殊的真菌多糖以及多糖蛋白結合物作為傳統(tǒng)醫(yī)藥被用于多種疾病如肝炎、高血壓、高血脂和胃癌的治療中。我國在多糖方面的研究起步晚，尚未形成多糖生物化學及藥用相關方面的研究戰(zhàn)略和機構。依賴于我國比較豐富的中草藥資源和完備的傳統(tǒng)中醫(yī)理論，近年來對植物多糖的研究也有了一定的進展。至今為止我國已對上百種多糖進行了結構分析和生物活性鑒定，已上市銷售的幾種多糖也取得了良好的經(jīng)濟效益。近年來，天津藥業(yè)生物科技有限公司通過對草本植物有效功效部位生物活性化提取，將傳統(tǒng)提取的多糖混合物轉化成具有生物活性的多糖分子一GPS，該種多糖的純度達到98%以上，從而使中國天然植物多糖提取技術達到世界領先水平。經(jīng)國家權威機構藥理、藥效研究證明這種活性多糖具有激活、增強和調節(jié)人體免疫能力和抵制腫瘤、抗炎、抗病毒、修復自身免疫性疾病的功效。近年來，真菌類多糖由于其潛在功能在化工、制藥、食品等行業(yè)引起廣泛關注。香菇多糖、靈芝多糖等藥理作用以及分離、純化技術已成為國內眾多領域的研究熱點，其中，銀耳多糖、槐耳(Trametesrobin iophila)、云芝多糖(Coriolan)的發(fā)開利用較多，已分別作為國家中藥一類、二類新藥投入生產(chǎn)。隨著多糖基礎研究步伐的加快，菌類多糖類制品將會在藥物、保健品、食品、化妝品、環(huán)保材料等方面取得相應發(fā)展。盡管國內對多糖在分離純化，生物活性和藥理等方面的研究取得一定進展，然而對多糖的結構和構效關系的研究仍沒有較大突破。因此，多學習借鑒別國先進的相關專利技術，在一定程度上可以使我們了解當今世界多糖的研究前沿，同時也為加深多糖生物學基礎性研究和探索，加快多糖工程產(chǎn)業(yè)規(guī)模化的興起，以及開展新藥研發(fā)提供有益的借鑒。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供虎皮蘭多糖TPS、TPS-H和TPS-A。虎皮蘭多糖TPS、TPS-H和TPS-A，它是由下述方法制得
虎皮蘭干粉經(jīng)石油醚、乙醇溶液回流除雜，在采用熱水浸提，收集提取液，經(jīng)減壓濃縮后加入乙醇使多糖沉淀，離心，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，真空冷凍干燥，得虎皮蘭水溶性多糖粗品，再經(jīng)酶法結合Sevage法脫蛋白，獲得虎皮蘭多糖TPS ；
將虎皮蘭多糖TPS過DEAE-52柱層析純化，依次用去離子水和0. 05、0. I、0. 2、0. 3mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，分別收集第I、II、III、IV、V洗脫峰，取第I或II洗脫峰濃縮、透析至AgNO3檢測無白色沉淀產(chǎn)生為止，冷凍干燥；收集的第I洗脫峰，再經(jīng)SephadexG-IOO柱分別層析純化即為，虎皮蘭多糖TPS-H ；
收集的第II洗脫峰，再經(jīng)S^hadexG-IOO柱分別層析純化，即為虎皮蘭多糖TPS-A ；
本發(fā)明的又一個目的是虎皮蘭多糖在生產(chǎn)治療人肺癌、人鼻咽癌或人皮膚T細胞淋巴瘤藥物的應用。所述的虎皮蘭多糖為虎皮蘭多糖TPS、TPS-H或TPS-A ；
優(yōu)選虎皮蘭多糖TPS-A。本發(fā)明提供的虎皮蘭多糖及其制備方法和應用，虎皮蘭多糖是將虎皮蘭葉經(jīng)干燥、粉碎、過篩，加入一定體積的石油醚、乙醇回流除雜，提取液經(jīng)抽濾得濾渣，濾渣風干備用。采用熱水浸提法提取虎皮蘭的多糖，粗多糖經(jīng)酶法結合Sevag法脫蛋白。脫蛋白后的\虎皮蘭多糖TPS，依次經(jīng)DEAE-52柱層析和S印hdex G-IOO柱層析分離純化，分別得到四種均一組分TPS-A、TPS-B, TPS-C、TPS-H, TPS、TPS-H、TPS-A 對人肺癌細胞 A549、人鼻咽癌細胞系CNE和人皮膚T細胞淋巴瘤Hut 102的生長有明顯的抑制作用，其中TPS-A效果最佳；對人結腸癌細胞LoVo細胞無抑制作用，對人正常肝細胞L02無殺傷效果，為其在靶向抗腫瘤藥物的研制中提供了科學依據(jù)。


圖I為DEAE-52柱分離純化虎皮蘭多糖洗脫結果；
圖2為S印hadexG-100柱層析分離純化虎皮蘭多糖TPS-H洗脫結果； 圖3為S印hadexG-100柱層析分離純化虎皮蘭多糖TPS-A洗脫結果；
圖4為S印hadexG-100柱層析分離純化虎皮蘭多糖TPS-B洗脫結果；
圖5為S印hadexG-100柱層析分離純化虎皮蘭多糖TPS-C洗脫結果；
圖6為虎皮蘭多糖TPS-H的紫外光譜掃描結果；
圖7為虎皮蘭多糖TPS-A的紫外光譜掃描結果；
圖8為虎皮蘭多糖TPS-B的紫外光譜掃描結果；
圖9為虎皮蘭多糖TPS-C的紫外光譜掃描結果；
圖10為本發(fā)明虎皮蘭多糖A549細胞活性試驗結果；
圖11本發(fā)明虎皮蘭多糖CNE細胞活性試驗結果；
圖12本發(fā)明虎皮蘭多糖Hut 102細胞活性試驗結果；
圖13為TPS-A對L02細胞影響的倒置顯微鏡下觀察結果，其中，I :對照組；2 :加樣組； 圖14為TPS-A對A549細胞影響的倒置顯微鏡下觀察結果，其中，I :對照組；2 :加樣
組；
圖15為TPS-A對CNE細胞影響的倒置顯微鏡下觀察結果，其中，I :對照組；2 :加樣組； 圖16為TPS-A對Hutl02細胞影響的倒置顯微鏡下觀察結果，其中，I :對照組；2 :加樣組。
具體實施例方式實施例I
I)取虎皮蘭干粉，經(jīng)石油醚提取，90°C回流至提取液基本無顏色，后用80%乙醇60°C回流2h。2)采用DK-98-1恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)提取，在條件提取溫度為90°C，提取時間為160min，固液比為1:30下采用熱水浸提。3)提取液經(jīng)RE-52C旋轉蒸發(fā)儀(上海青浦儀器廠)減壓濃縮，加3倍體積的95%乙醇4°C沉淀過夜。4)沉淀經(jīng)DL-5-B離心機離心(上海安亭科學儀器廠)，依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，最后經(jīng)FD-1B-50真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)冷凍干燥，即得虎皮蘭粗多糖。實施例2熱水浸提得到的粗多糖采用酶法結合Sevage法脫蛋白
I)將待脫蛋白的多糖溶液調PH8. 0，以2%的量加入胰蛋白酶，37°C條件下作用2h，間隔攪拌，然后升至80°C滅酶。2)將處理過的提取液4000r/min離心IOmin,取上清液濃縮,用Sevag法脫蛋白，重復3次。3)用透析法將脫蛋白后的虎皮蘭多糖濃縮液，放4°C用蒸餾水透析48h，中間更換數(shù)次，透析后濃縮，3倍95%乙醇沉淀，離心后真空冷凍干燥，即得初步純化虎皮蘭多糖TPS。實施例3脫蛋白后的多糖過DEAE-52柱層析純化
I)選用規(guī)格為3. 2cmX 40cm的層析柱，用3-5倍柱體積的去離子水在恒定壓力下走柱，以lml/min的流速通過層析柱。

2)取脫蛋白后的粗多糖溶于少量蒸餾水，采用0. 5g上樣量，上樣體積為10ml。3 )依次用去離子水和0. 05、0. I、0. 2、0. 3mo 1/L的NaCl溶液洗脫，控制流速0. 75ml/min, SBS-100自動部分收集器(上海滬西儀器廠)收集洗脫液，每管約IOml收集。4)分別合并收集第I、II、III、IV、V洗脫峰，濃縮，透析至AgNO3檢測無白色沉淀產(chǎn)生為止，真空冷凍干燥。5個洗脫峰依次記為TPS-H、TPS-A、TPS-B、TPS-C、TPS-D。DEAE-52柱分離純化虎皮蘭多糖洗脫結果見圖I
實施例4多糖的SephadexG-IOO柱層析純化
I)采用凝膠柱規(guī)格為2. 6. cmX60cm，上樣前用0. lmol/L的NaCl平衡層析柱至少3_5個柱體積。2)取適量DEAE-52中收集的前四種主成分TPS-H、TPS-A, TPS-B, TPS-C，溶于
0.lmol/L的NaCl溶液中，上樣量為l%、5ml的多糖液。3)用0. lmol/L的NaCl溶液洗脫，流速為0. 5ml/min，每管收集5ml。4)合并、收集各洗脫峰，透析，減壓濃縮，冷凍干燥，即得精制虎皮蘭多糖。過柱后得到四種多糖組分依次記為TPS-H、TPS-A、TPS-B、TPS_C。S印hadexG-100柱層析分離純化虎皮蘭多糖洗脫結果見圖2、3、4、5。結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過S^hadexG-IOO葡聚糖凝膠層析柱的洗脫峰均呈單一對稱型窄峰，說明純化后多糖組分在分子量分布上為均一組分。實施例5
將多糖組分制成2mg/ml的溶液，用紫外分光光度計進行掃描。結果發(fā)現(xiàn)紫外光譜顯示四種多糖組分在260、280nm處無明顯吸收峰，說明純化后多糖組分不含有核酸、蛋白質等雜質。多糖組分的紫外光譜掃描結果見圖6、7、8、9。實施例6
I)人肺癌細胞系A549、人鼻咽癌細胞系CNE、人皮膚T細胞淋巴瘤Hut 102、人結腸癌細胞LoVo、人正常肝細胞L02五種。所用培養(yǎng)基均采用含10%小牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，所有細胞系均在37°C、5%C02的恒溫環(huán)境條件下傳代培養(yǎng)。2)鋪板，取處于對數(shù)生長期的細胞，待細胞長滿瓶底70%左右時，經(jīng)0. 25%胰蛋白酶液消化，吹打分散成單細胞懸液，以每孔100ML的量接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，調節(jié)細胞數(shù)約至5 X IO4個/孔。放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中24h。3)樣品溶液制備取粗多糖、純化的多糖凍干樣加RPMI 1640培養(yǎng)基溶解，調整糖液PH7. 0，配制成終濃度為2mg/ml的多糖溶液，經(jīng)0. 22Mm濾膜過濾除菌，待用。4)加樣將步驟I中鋪板所制備的細胞培養(yǎng)板的營養(yǎng)液吸棄，分別加入糖濃度為2000、1000、500、250、125Pg/ml的培養(yǎng)基IOOW，每個濃度平行設3個復孔，并設置3個空白對照孔，空白對照孔加入不含糖液的培養(yǎng)液100ml。于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)48h。5)染色輕輕吹打96孔細胞培養(yǎng)板各孔2-3次，棄去上清。每孔加入30W染色液，室溫放置3-5分鐘。6)脫色流水小心沖去染色液，吸取殘留水分。每孔加入100W脫色液，室溫放置3-5分鐘。7)比色測定波長 570nm，記錄測定結果。按以下公式計算細胞生長抑制百分率。
抑制百分率=(I-給藥組平均OD值/空白對照平均OD值)X 100%
I)虎皮蘭多糖組分TPS、TPS-H、TPS-A對人肺癌細胞A549、人鼻咽癌細胞系CNE、人皮膚T細胞淋巴瘤Hut 102均有一定的抑制作用。抑制效果見圖10、11、12。2)其中以純化后多糖組分TPS-A對人肺癌細胞A549和人皮膚T細胞淋巴瘤Hut102的抑制效果最好，當濃度達到2mg/ml時，TPS-A對A549的抑制率達到64. 4%，對Hut 102的抑制率達到68. 3%，且在濃度在0. 5 2mg/ml之間時三種多糖組分與空白對照組相比作用均為顯著(P < 0. 05)。3)三種多糖組分TPS、TPS_H、TPS-A對人正常肝細胞L02無殺傷作用；對人結腸癌細胞LoVo細胞無抑制效果。4)從細胞形態(tài)上觀察，隨著虎皮蘭多糖濃度的增加，細胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化(圖13、14、15、16 )，細胞間隙加大，形態(tài)變的不規(guī)則、失去原有特性，有逐漸裂解、凋亡的趨勢。
權利要求
1.虎皮蘭多糖TPS,它是由下述方法制得 虎皮蘭干粉經(jīng)石油醚、乙醇溶液回流除雜，在采用熱水浸提，收集提取液，經(jīng)減壓濃縮后加入乙醇使多糖沉淀，離心，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，真空冷凍干燥，得虎皮蘭水溶性多糖粗品，再經(jīng)酶法結合Sevage法脫蛋白，獲得虎皮蘭多糖TPS。
2.虎皮蘭多糖TPS-H,它是由下述方法制得 將權利要求I所述的虎皮蘭多糖TPS過DEAE-52柱層析純化，依次用去離子水和0. 05,0. 1,0. 2,0. 3mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，分別收集第I、II、III、IV、V洗脫峰，取第I洗脫峰濃縮、透析至AgNO3檢測無白色沉淀產(chǎn)生為止，冷凍干燥；收集的第I洗脫峰，再經(jīng)S印hadexG-100柱分別層析純化，即為虎皮蘭多糖TPS-H。
3.虎皮蘭多糖TPS-A,它是由下述方法制得 將權利要求I所述的虎皮蘭多糖TPS過DEAE-52柱層析純化，依次用去離子水和0. 05,0. 1,0. 2,0. 3mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，分別收集第I、II、III、IV、V洗脫峰，取第II洗脫峰濃縮、透析至AgNO3檢測無白色沉淀產(chǎn)生為止，冷凍干燥；收集的第II洗脫峰，再經(jīng)S印hadexG-100柱分別層析純化，即為虎皮蘭多糖TPS-A。
4.虎皮蘭多糖在生產(chǎn)治療人肺癌、人鼻咽癌或人皮膚T細胞淋巴瘤藥物的應用。
5.根據(jù)權利要求4所述的虎皮蘭多糖在生產(chǎn)治療人肺癌、人鼻咽癌或人皮膚T細胞淋巴瘤藥物的應用，其特征在于所述的虎皮蘭多糖為權利要求I所述的虎皮蘭多糖TPS。
6.根據(jù)權利要求4所述的虎皮蘭多糖在生產(chǎn)治療人肺癌、人鼻咽癌或人皮膚T細胞淋巴瘤藥物的應用，其特征在于所述的虎皮蘭多糖為權利要求2所述的虎皮蘭多糖TPS-H。
7.根據(jù)權利要求4所述的虎皮蘭多糖在生產(chǎn)治療人肺癌、人鼻咽癌或人皮膚T細胞淋巴瘤藥物的應用，其特征在于所述的虎皮蘭多糖為權利要求3所述的虎皮蘭多糖TPS-A。
全文摘要
本發(fā)明公開了的虎皮蘭多糖及其制備方法和應用，虎皮蘭多糖是將虎皮蘭葉經(jīng)干燥、粉碎、過篩，加入一定體積的石油醚、乙醇回流除雜，提取液經(jīng)抽濾得濾渣，濾渣風干備用。采用熱水浸提法提取虎皮蘭的多糖，粗多糖經(jīng)酶法結合Sevag法脫蛋白。脫蛋白后的虎皮蘭多糖TPS，依次經(jīng)DEAE-52柱層析和SephdexG-100柱層析分離純化，分別得到四種均一組分TPS-A、TPS-B、TPS-C、TPS-H，TPS、TPS-H、TPS-A對人肺癌細胞A549、人鼻咽癌細胞系CNE和人皮膚T細胞淋巴瘤Hut102的生長有明顯的抑制作用，其中TPS-A效果最佳；對人結腸癌細胞LoVo細胞無抑制作用，對人正常肝細胞LO2無殺傷效果，為其在靶向抗腫瘤藥物的研制中提供了科學依據(jù)。
文檔編號C08B37/00GK102746418SQ20121026947
公開日2012年10月24日 申請日期2012年8月1日 優(yōu)先權日2012年8月1日
發(fā)明者于新海, 劉文濤, 劉洪章, 劉淑英, 史飛, 張帆, 張璐, 張繼元, 李昌昊, 李澤鴻, 管玉兵, 陶英楠 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學