專利名稱：Bmp2/7緩釋系統(tǒng)在腦膠質(zhì)瘤治療上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腦膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域，具體涉及一種BMP2/7緩釋系統(tǒng)在腦膠質(zhì)瘤治療上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦腫瘤的發(fā)病率為21/10萬人，約占人類所有癌癥的2%，其中腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率約占腦腫瘤的60%。在1996年第三屆(悉尼)國際腫瘤控制大會(huì)總結(jié)的資料中統(tǒng)計(jì)，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為3 10/10萬，占全身惡性腫瘤的1% 3%，我國每年新發(fā)腦瘤病人大約有4萬人。手術(shù)加放化療的平均生存期僅為8 11個(gè)月至今我國還沒有腦膠質(zhì)瘤大宗病例的長期追蹤隨訪資料。由于腦膠質(zhì)瘤的惡性程度高，轉(zhuǎn)移快，復(fù)發(fā)率高，致殘致死率高，目前缺乏有效的治療手段。因此急待一種切實(shí)可行的治療方法。
目前國內(nèi)外尚沒有治療腦膠質(zhì)瘤的有效手段,基本以外科手術(shù)與化療為主,但效果不理想，復(fù)發(fā)率高。其中化療的的毒副作用大，病人反應(yīng)強(qiáng)烈。本研究擬采用的BMP2/7誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的方法是一種無毒的治療手段，在不增加病人痛苦的前提下，能夠有效緩解病人的痛苦，因此具有很高的臨床價(jià)值。本專利發(fā)明人采用柔性連接技術(shù)自行研制開發(fā)的BMP2/7的異源二聚體結(jié)構(gòu)類似物與同類其它BMPs藥物相比，具有超群的生物活性，與膠原海綿復(fù)合后構(gòu)成新型的BMP緩釋系統(tǒng)，能夠明顯增加局部的藥物濃度，提高藥效水平。將該緩釋系統(tǒng)植入腦組織，可以解決腦膠質(zhì)瘤治療時(shí)藥物難以通過血腦屏障以及局部藥物濃度較低的困難，提高藥物的作用時(shí)間。同時(shí)，副反應(yīng)小，毒性低，將成為良好的新型抗膠質(zhì)瘤藥物。采用柔性連接技術(shù)表達(dá)BMP-2/7異源二聚體結(jié)構(gòu)類似物1990年，Sampath等人從牛脫礦骨粉分離到一種蛋白，分子量約30，000左右，體內(nèi)與體外都有明顯的骨生成作用。還原型SDS-PAGE電泳則發(fā)現(xiàn)該蛋白由兩個(gè)亞基組成，分別為18，000與16，000左右，經(jīng)脫糖基處理后，分子量為16，000與14，000，測序后發(fā)現(xiàn)前者為BMP-7，后者為BMP-2，均為糖蛋白，但糖基化對二者的活性沒有影響。表明天然狀況下，就有BMP-2/7異源二聚體的存在。此后，獲得BMP-2專利的Genetics Institute公司的研究人員發(fā)現(xiàn)，BMP-2/7異源二聚體的活性明顯高于BMP-2與BMP-7的同源二聚體，體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為20倍左右，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為5-10倍。Wang等人發(fā)現(xiàn)，天然組織提取的BMP的誘骨活性比rhBMP2高10倍。Aki Aono等人的研究表明BMP-4/7異源二聚體也具有相同的情況，并猜測體內(nèi)組織中BMP主要以異源二聚體的形式存在。雖然這一現(xiàn)象尚缺乏明確的理論依據(jù)，但許多研究者已將目標(biāo)集中在此方面的工作上。根據(jù)以上的結(jié)果，本專利發(fā)明人通過基因重組的方式將BMP-2與BMP-7的碳端用一段柔性肽(GlyGlyGlyGlySer)4串連起來,并在Pichia Pastoris中得到異源二聚體的高效表達(dá)。柔性肽只有Gly與Ser兩種氨基酸，因?yàn)閭?cè)鏈基團(tuán)影響小，所以肽鍵的剛性很小，可以自由旋轉(zhuǎn)，有極強(qiáng)的柔順性，不會(huì)阻礙兩側(cè)肽鏈的自由折疊，又稱柔性連接技術(shù)，運(yùn)用很廣。目前十分流行的人源化單抗ScFv，即是通過柔性肽的方式獲得表達(dá)的。好處表現(xiàn)在下述方面I.提高異源二聚體的產(chǎn)量與共表達(dá)BMP-2和BMP-7，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊，分泌到培養(yǎng)基中進(jìn)行隨機(jī)配對形成二聚體的方法相比，將二者用一段柔性肽共價(jià)連接起來表達(dá)可以得到均一型的異源二聚體，減少同源二聚體雜質(zhì)，提高了產(chǎn)率，降低了純化成本。2.提高重組蛋白的可溶性BMP單體有較多的疏水性氨基酸，但由于缺乏一個(gè)疏水中心，而將疏水集團(tuán)暴露在單體分子表面，因此分子之間特別容易聚集，形成沉淀。將二者共價(jià)串連，可以減少單體之間的空間距離，使得二聚體更易發(fā)生，可溶性增加。3.有利于正確構(gòu)象的形成活性形式的異源二聚體具有七對二硫鍵，其中一個(gè)是在分子之間形成的。串連起來的單體由于分子間的距離更加接近，更利于分子間二硫鍵的形成。4.活性有所提高由于BMP-2與BMP-7的協(xié)同作用，異源二聚體的比活比同源二聚體提高十幾倍。 5.具有自主知識產(chǎn)權(quán)這種新型的BMP由三部分組成，BMP_2、7和一段柔性肽，共同組成了一個(gè)完整的分子，我們把它叫做結(jié)構(gòu)類似物，是一種有別于BMP2/7的新型分子，國內(nèi)外均無報(bào)道。因此不會(huì)有知識產(chǎn)權(quán)的糾紛。應(yīng)用共價(jià)結(jié)合肝素的膠原作為BMP的載體，這種設(shè)計(jì)方案國內(nèi)外均未見報(bào)道理想的載體應(yīng)該具有①生物相容性，使宿主不發(fā)生或僅發(fā)生輕微的炎癥反應(yīng)，使骨誘導(dǎo)的干擾因素最小化；②生物降解性，在體內(nèi)以水解的方式降解，產(chǎn)生天然的中間代謝產(chǎn)物排出體外；③可吸收性，使殘余載體對于骨修復(fù)生物機(jī)制特性的影響最小化。膠厘縣査原有良好的組織相容性和可吸收性，用膠原作為BMP的載體，可避免復(fù)合材料的移動(dòng)，防止被過快吸收，具有緩釋作用。另外，膠原中含有一些生長因子，可以協(xié)同促進(jìn)BMP的成骨作用。從牛腱重組的可吸收性的膠原海綿體和從牛骨提取的鹽酸胍來源的膠原基質(zhì)，分別作為BMP-2和BMP-7的載體已經(jīng)得到應(yīng)用。本專利發(fā)明人將BMP的緩沖溶液直接涂布在膠原的表面，雖然可以得到較好的釋放動(dòng)力學(xué)模式，但仍不足以維持足夠的時(shí)間來誘導(dǎo)成骨活動(dòng)，如果使用化學(xué)方法增加BMP與膠原的親和力，使細(xì)胞因子的釋放維持更長的時(shí)間應(yīng)該是一種理想的選擇?？紤]到BMP分子上存在的肝素親和域，我們將肝素通過共價(jià)鍵固定存膠原表面，便可以實(shí)現(xiàn)BMP與載體的有效結(jié)合。同時(shí)，肝素的存在，對維持BMP的結(jié)構(gòu)，防止BMP的降解具有十分重要的作甩。通過調(diào)整結(jié)合肝素的BMP數(shù)量，獲得了“二階段”釋放動(dòng)力學(xué)模式，讓游離的BMP以“爆發(fā)”方式進(jìn)行釋放，以形成誘導(dǎo)骨祖細(xì)胞的趨化環(huán)境，結(jié)合BMP以“緩釋”方式進(jìn)行釋放，并維持較長時(shí)間，以維持局部的高濃度環(huán)境。作用機(jī)理不依賴于細(xì)胞毒性作用，降低了毒副作用，提高治療耐受性BMP2/7能夠直接靶向腦組織的腫瘤干細(xì)胞，促進(jìn)其分化，抑制其生長，有別于傳統(tǒng)的化療藥物廣泛的細(xì)胞毒性作用，副作用低，損傷小。如果配合傳統(tǒng)的治療手段，如放療與化療，能夠在不同的水平，不同的途徑發(fā)揮作用，增加了消除腫瘤細(xì)胞的可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供BMP2/7緩釋系統(tǒng)在腦膠質(zhì)瘤治療上的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的BMP2/7緩釋系統(tǒng)在腦膠質(zhì)瘤治療上的應(yīng)用，其中BMP2/7的載體采用肝素化膠原蛋白。所述的肝素化膠原蛋白的制作步驟如下膠原蛋白的交聯(lián)取凍干膠原片稱重，記錄膠原片的質(zhì)量，配置O. 05M的2-甲基嗎啡磺酸(MES) 100ml (PH5. O)。室溫下，將膠原片浸泡于上述溶質(zhì)與酒精的混合物中(酒精體積為40% )，再向溶液中加入N，N-環(huán)己基碳化二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，按質(zhì)量比為每克膠原蛋白1.731克EDC和O. 415克NHS，浸泡4小時(shí)。膠原蛋白的肝素化交聯(lián)的膠原蛋白PH5. O的MES緩沖液中浸泡30分鐘以上，按
I 0.6配制EDC/NHS溶液，將肝素溶于O. 05M的MES緩沖液(PH5. O)中，肝素濃度為2 %(w/v)，按一定比例加入EDC/NHS溶液。IOmin后，按每克膠原蛋白188. 3ml的比例加入EDC/NHS活化的肝素溶液，孵育2小時(shí)后，分別用O. IM的Na2HP04，4M NaCl與無菌蒸餾水漂洗。
本發(fā)明的BMP2/7緩釋系統(tǒng)在腦膠質(zhì)瘤治療上的應(yīng)用，其中采用柔性連接技術(shù)表達(dá)BMP2/7異源二聚體類似物。柔性連接技術(shù)參考本發(fā)明人的專利“一種BMP2/7異源二聚體結(jié)構(gòu)類似物及其表達(dá)方法與應(yīng)用”，專利200610034620. 2。將BMP2/7異源二聚體與肝素化膠原蛋白結(jié)合制成BMP2/7緩釋系統(tǒng)，結(jié)合步驟為將直徑IOmm的肝素化膠原膜浸泡于5ml PBS溶液中過夜，晾干后滴入O. 25ml的BMP2/7PBS溶液，室溫靜置90min后，PBS漂洗3次。通過構(gòu)建大鼠顱內(nèi)荷瘤模型，在瘤體內(nèi)注射BMP2/7緩釋載體，表明BMP2/7緩釋載體能夠明顯抑制腫瘤的增殖，起到明顯的治療效果；BMP2/7緩釋載體能夠協(xié)同化療藥物抑制腫瘤的生長；緩釋系統(tǒng)不但提高了靶區(qū)腦組織的藥物濃度，同時(shí)降低了非靶區(qū)組織的濃度，避免藥物的毒副作用；所有大鼠均未發(fā)生明顯行為改變和神經(jīng)功能缺陷，未出現(xiàn)全身或者局部毒性反應(yīng)，表明BMP2/7緩釋載體的生物相容性良好。通過構(gòu)建裸鼠顱內(nèi)移植瘤模型，BMP2/7緩釋系統(tǒng)單獨(dú)作用能部分抑制腫瘤組織的形成，腫瘤組織對化療藥物不夠敏感，而兩者卻又明顯的協(xié)同作用，充分證明BMP2/7治療腦膠質(zhì)瘤的潛在價(jià)值。通過構(gòu)建裸鼠皮下移植U251膠質(zhì)瘤模型，BMP2/7能夠協(xié)同化療藥物顯著抑制裸鼠皮下瘤的生長。綜上所述，本發(fā)明通過BMP2/7緩釋載體的大鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)、裸鼠顱內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)、裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行了 BMP2/7緩釋載體與化療藥物的協(xié)同作用、BMP2/7緩釋載體的分布動(dòng)力學(xué)特征、BMP2/7緩釋載體的生物相容性研究，闡明了采用復(fù)合BMP2/7的緩釋載體，在腦膠質(zhì)瘤的局部可以形成高濃度的給藥環(huán)境并能緩慢釋放BMP2/7，抑制腦膠質(zhì)瘤的增殖，促進(jìn)其分化，如果配合傳統(tǒng)的治療手段如放療或化療，能夠在不同的水平不同的途徑發(fā)揮作用，增加了消除腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的可能性。


圖I :大鼠9L細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞球囊培養(yǎng)，其中A、B為無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)9L神經(jīng)干細(xì)胞，C為含血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)貼壁。圖2 :含血清培養(yǎng)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分化。圖3 :不同濃度BMP2/7處理9L干細(xì)胞的分化檢測。圖4 :9L細(xì)胞接種后，大鼠研究外突，眶周出血，肢體偏癱，肌張力增高。圖5 :9L細(xì)胞接種2周后，大鼠腦膠質(zhì)瘤的MRI成像，表現(xiàn)為腫瘤實(shí)質(zhì)部分強(qiáng)化，中央無強(qiáng)化的液體壞死區(qū)(箭頭)。圖6 9L移植瘤病例表現(xiàn)(N :正常組織)。圖7 :9L原位移植大鼠的荷瘤生存曲線。圖8 BMP2/7治療大鼠移植腦膠質(zhì)瘤的MRI檢測，藍(lán)色區(qū)域?yàn)橛?jì)算機(jī)偽色。圖9 :小動(dòng)物活體成像檢測BMP2/7緩釋系統(tǒng)與化療藥物協(xié)同治療大鼠顱內(nèi)移植瘤。圖10 :肝素濃度與BMP2/7的結(jié)合能力。圖11 BMP2/7結(jié)合力與BMP2/7濃度的關(guān)系。 圖12 :復(fù)合BMP2/7肝素化膠原膜的緩釋動(dòng)力學(xué)分析。圖13 :復(fù)合BMP2/7肝素化膠原膜的緩釋動(dòng)力學(xué)分析。圖14 :緩釋系統(tǒng)組織相容性檢測，Al為正常腦組織(200倍)，BI為正常腦組織(400倍)，A2為植入腦組織后Id(200倍)，B2為植入腦組織后Id(400倍)，A3為植入腦組織后3d (200倍)，B3為植入腦組織后3d (400倍)，A4為植入腦組織后Iw (200倍)，B4為植入腦組織后Iw (400倍)，A5為植入腦組織后2w(200倍)，B5為植入腦組織后2w(400倍)A6為植入腦組織后3w(200倍)B6為植入腦組織后3w(400倍)。
具體實(shí)施例方式為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的授權(quán)之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例I大鼠荷瘤生存試驗(yàn)(一 )材料與方法I、試劑DMEM/F12(1 I)培養(yǎng)基，B27 添加劑(Invitrogen), N2 添加劑(Invitrogen)胰蛋白酶(Sigma),人表皮生長因(EGF, Invitrogen),人堿性成纖維生長因子(bFGF,Invitrogen),白血病抑制因子(LIF, Chemieon),左旋谷胺酞氨(Sigma),特級胎牛血清(Hycl。ne)，胰島素、青霉素和鏈霉素(華北制藥)，左旋多聚賴氨酸(Sigma)，紅細(xì)胞裂解液(自配，含O. 155mol/LNH4CI,0. 01mol/LKHC03,0. IM EDTA)，免疫磁珠分選液O. 5% (v/v)BSA、2mM EDTA，加入 O. OlM PBS 至 100ml，用 IN NaOH 或 IN HCl 調(diào)節(jié) pH 值為 7. 2，免疫磁珠(CD133+)細(xì)胞分選試劑盒為德國Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品。2、Fisher344大鼠9L細(xì)胞腦膠質(zhì)瘤模型的建立(1)9L細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)從_80°C取出凍存管，迅速放入37°C水浴中，使其融化，約Imin左右；室溫下5min內(nèi)，用低糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至原來體積的10倍。800rpm/min低速離心5min。去上清，加含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞融合超過80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(2)細(xì)胞接種液的制備對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，O. 25%胰酶消化，用PBS液洗滌二次，離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為1000轉(zhuǎn)/min，部分細(xì)胞到置顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，制備成細(xì)胞懸液IOy L，待接種。部分細(xì)胞進(jìn)行消化、洗滌后繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其生長情況，做接種細(xì)胞的對照。結(jié)果細(xì)胞生長良好，細(xì)胞存活率>95%。9L細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)如圖所示。3、免疫磁珠法分離大鼠腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞方法將大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株9L分為兩組，一組用少量緩沖液(O. 5%牛血清白蛋白、2mM乙二胺四乙酸，pH7. 2 的憐酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS), 0. 22 μ m過濾除菌，保持4 8°C )充分混懸細(xì)胞(按O. 3ml/lX IO8細(xì)胞濃度即可)，加入⑶133抗體包被的超微磁珠，混勻后置4°C孵育30min。將分離柱安裝入磁場中，加入O. 5ml緩沖液，在重力作用下自然流盡，以預(yù)處理分離柱。將孵育完的細(xì)胞懸液加到分離柱中，自然流盡。洗柱兩次。從磁場中取下分離柱，插在試管口，加I 2ml的緩沖液，用針芯推盡液體，沖出陽性結(jié)合的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗一次，離心IOOOrpm, 5min,接種到含EGF (20ng/ml),bFGF(20ng/ml), LIF (10ng/ml), B27(lx)的無血清培養(yǎng)基中，置入 37°C，5 % CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對照組臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后不進(jìn)行磁珠分選，直接接種到上述培養(yǎng)基中。兩組視具體情況每2 4d換液一次。4、流式細(xì)胞儀檢測分選細(xì)胞中⑶133的表達(dá) 分別收集血清和無血清培養(yǎng)基中大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，消化離心后重懸于10%的馬血清中，4°C孵育20分鐘，離心后棄上清。細(xì)胞與羊抗-⑶133多克隆抗體(I 200，Santacruz，美國)在4°C中孵育半小時(shí)，PBS洗兩次。再將細(xì)胞與驢抗羊Alexa488熒光二抗(Molecular protect，美國)混合，4°C避光孵育15分鐘，以PBS液洗滌。充分吹打成單細(xì)胞懸液后，用美國BD公司的流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析檢測。同時(shí)以小鼠IgG作為一抗的細(xì)胞懸液作為陰性對照.5、腫瘤細(xì)胞在含血清和無血清培養(yǎng)基中的相互轉(zhuǎn)化將原代無血清培養(yǎng)基中的懸浮克隆球消化后制備成單細(xì)胞懸液，以IxlOVml的密度接種到含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，二周后將細(xì)胞收集后以同樣密度接種到含生長因子的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)二周，連續(xù)三次相同密度細(xì)胞在不同培養(yǎng)基條件轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，觀察細(xì)胞的克隆球形成能力以及生長狀況。6、單細(xì)胞懸液的制備和單細(xì)胞克隆分析9L膠質(zhì)瘤細(xì)胞以1000-2000cell/cm，的克隆密度接種于5ml含生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)基中，1-2周后收集克隆球細(xì)胞消化后重懸于PBS溶液中，輕輕吹打后經(jīng)300目的濾網(wǎng)過濾，離心后將細(xì)胞重懸于DMEM/F12培養(yǎng)基中，充分吹打后制備成單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色鏡下計(jì)數(shù)。將細(xì)胞梯度稀釋到1000cell/ml的濃度，在每個(gè)96孔板孔中加入l_2ul的細(xì)胞懸液，再分別加入250ul含生長因子的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)觀察。4小時(shí)后顯微鏡下仔細(xì)觀察每個(gè)孔中的細(xì)胞接種數(shù)目，記錄含有單個(gè)腫瘤細(xì)胞的孔。隔天觀察一次細(xì)胞的分裂生長情況，一個(gè)月后計(jì)數(shù)單細(xì)胞克隆形成率。單細(xì)胞孔克隆球長至100-200細(xì)胞以后，將克隆球連同培養(yǎng)液吸出，輕輕吹打后接種于新的96孔板中，觀察亞克隆形成情況。7、單細(xì)胞來源克隆球的分化檢測收集克隆密度下無血清培養(yǎng)基中的單細(xì)胞來源克隆球，將其接種于含蓋玻片的6孔板中，蓋玻片事先用多聚賴氨酸浸泡10分鐘。4小時(shí)后與5ug/ml Hoechst33342孵育lOmin，再用2%多聚甲醛固定20分鐘。2)將單細(xì)胞來源的克隆球消化解離后，接種到6孔板中，含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)一周后進(jìn)行下一步檢測。PBS緩沖液洗滌三次后加入EDTA修復(fù)液，于95°C水浴進(jìn)行抗原修復(fù)15分鐘。用10%馬血清或羊血清封閉20分鐘后加入一抗羊抗-CD133多克隆抗體(I 200, Santa Cruz，美國)、于37°C水浴孵育兩小時(shí)，PBS沖洗三次，每次5 分鐘。加入羊抗兔Alexa fluor568 (I : 100)和驢抗羊Alexa fluor488 (I : 100)熒光二抗(Molecular Protect，美國)，4°C避光孵育45分鐘，PBS液洗滌三次，每次五分鐘。熒光顯微鏡下觀察拍照，注意要始終保持蓋玻片的濕潤，最后計(jì)算陽性細(xì)胞表達(dá)率。8、膠原海綿處理方法膠原海綿的膜片規(guī)格3mm直徑，Imm厚，將直徑3mm的膠原膜和肝素化膠原膜浸泡于5ml PBS溶液中過夜，晾干后分別滴入O. 25ml rhBMP2/7PBS溶液(高中低劑量組分別為400ng/ml, 100ng/ml, 25ng/ml),低溫真空干燥，備用。9、大鼠顱內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按O. 4ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻 醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規(guī)消毒，安裝立體定向接種針。選定右側(cè)額葉為接種祀點(diǎn)，其坐標(biāo)為冠狀縫前1mm，矢狀縫右3mm處切開皮膚，鉆孔(直徑3mm)，將BMP2/7復(fù)合膠原海綿植于額葉腦皮質(zhì)下，將腫瘤細(xì)胞懸液以I μ I/min的速度注射入靶區(qū)，除針前留針5min，使細(xì)胞充分沉淀，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫
八
口 ο造模后3天，按照完全隨機(jī)的方法將荷瘤大鼠分為以下四組高劑量組400ng/mlBMP2/7+3mm 海綿；中劑量組100ng/ml BMP2/7+3mm 海綿；低劑量組25ng/ml BMP2/7+3mm海綿；膠原海綿組400ng/ml BSA+3mm海綿。每組大鼠10只。隨機(jī)分組完成后，采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按O. 4ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規(guī)消毒，安裝立體定向接種針。選定右側(cè)額葉為接種祀點(diǎn)，其坐標(biāo)為冠狀縫前1_，矢狀縫右3mm處切開皮膚,鉆孔(直徑3mm),將BMP2/7復(fù)合膠原海綿植于額葉腦皮質(zhì)下Imm處，將腫瘤細(xì)胞懸液以I μ 1/min的速度注射入靶區(qū)，除針前留針5min，使細(xì)胞充分沉淀，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合。按照上述的方法進(jìn)行膠原海綿移植，分組如下高劑量組原位移植400ng/ml BMP2/7+3mm海綿。中劑量組原位移植100ng/ml BMP2/7+3mm海綿低劑量組原位移植25ng/ml BMP2/7+3mm海綿膠原海綿組原位移植400ng/ml BSA+3mm海綿各組大鼠的行為學(xué)觀察治療各組細(xì)胞移植后，每日觀察大鼠的神態(tài)、進(jìn)食、活動(dòng)等狀態(tài)。各組大鼠的生存周期觀察治療后，每日觀察各組大鼠的存活情況，記錄生存時(shí)間。MRI檢測自治療后I周，每周對治療各組大鼠進(jìn)行MRI檢查。采用10%水合氯醛對Fisher344大鼠按0. 4ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于特制固定架，分別取冠狀、矢狀及軸位掃描。掃描條件采用3英寸表面線圈，TIffITR =300ms, TE = 15ms，采集 2 次，T2WITR = 2000, TE = 90ms，層厚 3. 0_，采集 2 次.掃描矩陣256X256,掃描野為3cmX3cm。并測量腫瘤直徑。增強(qiáng)掃描時(shí)腹腔注射二乙三胺五乙酸軋(Gadoliniumdiethylene triaminepen taacetie acid, GDDTPA, 2ml/kg),然后進(jìn)行掃描。腫瘤體積的計(jì)算取MRI掃描的最大冠狀面和矢狀面，測量最大前后徑(L)、寬徑(W)和高徑⑶，觀察腫瘤生長情況。腫瘤大小以下述公式計(jì)算腫瘤體積(V) v =(4/3X 31 XLXWXH) X 1/8 計(jì)算。10、種植瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)種植瘤取出后放入含PBS 緩沖液的平皿中，利用有齒鑷仔細(xì)剔除腫瘤中的血管成分和壞死組織，消化過程同步驟一。將細(xì)胞以I X 106/ml密度接種到無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。裸鼠以過量麻醉處死。種植瘤細(xì)胞經(jīng)一代培養(yǎng)后作進(jìn)一步的96孔板單細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)免疫熒光抗原檢測實(shí)驗(yàn)以及克隆球細(xì)胞接種裸鼠實(shí)驗(yàn)11、組織切片免疫組織化學(xué)抗原檢測固定于4%多聚甲醛的種植瘤組織以及患者原始腫瘤組織經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片等步驟后，切片在60°C烘箱中烘干過夜。I) 二甲苯脫蠟在三個(gè)盛有二甲苯溶液的瓶中各浸泡10分鐘，以達(dá)到徹底脫蠟的效果。2)水化100%無水乙醇5分鐘，95%乙醇5分鐘，95%乙醇5分鐘，75%乙醇5分鐘。O. OlM的PBS緩沖液沖洗三次。3)將PH為9. O的EDTA修復(fù)液放入玻璃杯中煮沸，放入切片，保持15_20分鐘，注
意防止脫片。 4)室溫下放置45分鐘后冷卻，用PBS液沖洗三次。5)切片放入濕盒中，加入3% H2O2，室溫下10分鐘，PBS沖洗三次。6)加入10%的兔血清或者山羊血清封閉20分鐘,棄去封閉液,不洗。7)加入羊抗-CD133多克隆抗體、兔抗-GEAP多克隆抗體、兔抗-NSE多克隆抗體于37°C孵育2小時(shí)。用PBS液仔細(xì)沖洗三次。8)加入SP試劑盒中的兔抗山羊或山羊抗兔二抗，室溫孵育15分鐘，PBS沖洗三次。9)加入SP試劑盒中辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育10分鐘，PBS沖洗三次。10)加入現(xiàn)配的DAB工作液，鏡下觀察待胞漿變黃后用自來水沖洗。11)蘇木素溶液中浸染5-10分鐘，自來水沖洗。12)鹽酸酒精分化I秒，自來水沖洗。13)氫氧化氨水溶液或60°C水浴中藍(lán)化10分鐘14)在95% -100%的梯度酒精中脫水各2分鐘。15)待切片干燥后用中性樹脂封片，鏡下觀察。16)隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)不少于200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占腫瘤細(xì)胞
百分率。12、免疫熒光法檢測多抗原共表達(dá)現(xiàn)象收集原代無血清培養(yǎng)基中的懸浮克隆球接種到含蓋玻片的6孔板中，加含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在接種后4小時(shí)、2周時(shí)用2%的多聚甲醛固定細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測。常規(guī)步驟同前，經(jīng)馬血清封閉后，每個(gè)玻片同時(shí)與混合一抗進(jìn)行孵育，二抗為羊抗兔Alexafluor568(l 100)和驢抗羊Alexa f luor488 (I 100)熒光二抗混合液，避光孵育45分鐘。固定細(xì)胞前均要與5ug/ml Hoechst33342孵育lOmin，以標(biāo)記細(xì)胞核。熒光顯微鏡下，同一視野分別用不同波長的激發(fā)光觀察，拍照記錄。13、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組計(jì)量資料均采用i^SD表示，細(xì)胞生長曲線采用重復(fù)測量方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)的組間比較采用oneway AN0VA，多重比較采用LSD法比較分析；生存周期采用Kaplan-Meier, Long-rank分析；其余實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用oneway ANOVA,多重比較采用LSD法比較分析。采用SPSS13. O統(tǒng)計(jì)軟件包處理，P < O. 05時(shí)認(rèn)為差異具有顯著意義。( 二 )結(jié)果與分析I、大鼠9L腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中，可在24-48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)有單個(gè)或多個(gè)成簇懸浮細(xì)胞的形成，Iw后細(xì)胞球明顯增多，增大，形狀多規(guī)則，由數(shù)量不等的圓形細(xì)胞組成，2周后可達(dá)到數(shù)百 個(gè)細(xì)胞以上，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶時(shí)可見細(xì)胞球滾動(dòng)。大部分細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中仍呈貼壁生長，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長貼壁細(xì)胞數(shù)有所減少(圖I)。撤去無血清培養(yǎng)基，換含血清培養(yǎng)基,導(dǎo)致球囊開始貼壁,分別檢測神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP、神經(jīng)元標(biāo)記物Tuji的表達(dá),如圖2所示結(jié)果,Oh時(shí),只能檢測到Nestin的表達(dá)，表明細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，24h后GFAP與Tuji的表達(dá)水平明顯增力口，Nestin標(biāo)記幾乎很難檢測到，充分說明大鼠腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞9L具有分化為膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞的能力(圖2)。我們嘗試用不同濃度的BMP2/7處理9L干細(xì)胞，24h后檢測分化水平，發(fā)現(xiàn)三種濃度的BMP2/7都能夠明顯促進(jìn)分化，而且與單純有血清培養(yǎng)相比，時(shí)間明顯縮短(圖3)。2、荷瘤大鼠的行為學(xué)觀察Fisher344大鼠接種9L細(xì)胞I周后，表現(xiàn)為自行覓食、飲水較正常鼠減少，體重下降，反應(yīng)遲鈍，少動(dòng)，并可出現(xiàn)行走不穩(wěn)。接種后14天逐漸出現(xiàn)進(jìn)行性顱內(nèi)高壓癥狀，部分鼠出現(xiàn)眶周出血、眼球外突，后期可有癲癰樣發(fā)作、偏癱及肌張力增高等癥狀(圖4)。未干預(yù)組大鼠均于21天內(nèi)逐漸死亡，死亡前出現(xiàn)肢體屈曲，不自主搐動(dòng)。高劑量組400ng/mlBMP2/7+3mm膠原海綿移植組約3周左右，中劑量100ng/ml BMP2/7+3mm膠原海綿移植組約4周左右出現(xiàn)進(jìn)行性顱內(nèi)壓增高癥狀。3、荷瘤大鼠的MRI及病理表現(xiàn)腫瘤種植2周后MRI顯示大鼠腦內(nèi)均有不同大小的膠質(zhì)瘤生長，證明接種成功。常規(guī)MRI膠質(zhì)瘤表現(xiàn)為圓形或類圓形腫塊，邊界較清楚，周圍有片狀水腫區(qū)，增強(qiáng)后腫瘤實(shí)質(zhì)部分不同程度地強(qiáng)化，中央多出現(xiàn)無強(qiáng)化的液化壞死區(qū)(圖5)。腫瘤最大直徑在3. 5-12mm之間，平均6. 8上3. 1mm。HE染色光鏡下腫瘤細(xì)胞密集，核漿比例高，核分裂像少見，并有部分分化現(xiàn)象(圖6)。4、各組荷瘤大鼠的生存周期經(jīng)生存周期分析發(fā)現(xiàn)各組大鼠的中位生存期分別為生理鹽水組18天，95%可信區(qū)間為15. 078-20. 922天；高劑量組400ng/ml BMP2/7+3mm膠原海綿移植組57天，95%可信區(qū)間為47. 703-66. 297天；中劑量組100ng/ml BMP2/7+3mm膠原海綿移植組25天，95 %可信區(qū)間為23. 482-26. 518天；低劑量組25ng/ml BMP2/7+3mm膠原海綿移植組23天，95%可信區(qū)間為18.868-27. 123天。高劑量組400ng/ml BMP2/7+3mm膠原海綿移植組大鼠的生存時(shí)間最長，40%大鼠存活時(shí)間超過60天，與其余各組比較有顯著性差異P < 0. 01 ;高中劑量BMP2/7膠原海綿移植組大鼠生存時(shí)間較生理鹽水組明顯延長P < O. Ol ;低劑量BMP2/7膠原海綿移植組與對照組之間無顯著性差異P = O. 924(圖7)。5、各組大鼠腫瘤大小的變化根據(jù)每周MRI檢查的結(jié)果，計(jì)算各組大鼠腫瘤的體積變化，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明7天、14天時(shí)BMP2/7膠原海綿高中低劑量組與BSA膠原海綿組比較有顯著性差異(P < O. 01)，高劑量組400ng/ml BMP2/7+3mm海綿；中劑量組100ng/ml BMP2/7+3mm海綿與低劑量組25ng/ml BMP2/7+3mm海綿和對照組400ng/ml BSA+3mm海綿比較有顯著性差異(P <0.01)；而低劑量組25ng/ml BMP2/7+3mm 海綿與 400ng/ml BSA+3mm 海綿(7 天時(shí)=O. 725 ; 14 天時(shí)P = O. 620)無顯著差異。21天時(shí)400ng/ml BSA+3mm海綿組大鼠全部死亡，高劑量組400ng/ml BMP2/7+3mm海綿與對照組 400ng/ml BSA+3mm海綿有顯著性差異(P < O. 01) ；28天，56天時(shí)高劑量組大鼠的腫瘤體積仍相對較小分別為32. 40 ±2. 15和45. 35 ±2. 52 (表I)。MRI的結(jié)果顯示，與對照組相比，中劑量與高劑量BMP2/7能夠明顯移植腫瘤的增殖，起到明顯的治療效果(圖8)。
實(shí)施例2緩釋載體與化療藥物的協(xié)同作用(一)材料與方法1、9L細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)從-80°C取出凍存管，迅速放入37°C水浴中，使其融化，約Imin左右；室溫下5min內(nèi)，用低糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至原來體積的10倍。800rpm/min低速離心5min。去上清，加含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞融合超過80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2、免疫磁珠法分離大鼠腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞方法將大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株9L分為兩組，一組用少量緩沖液(O. 5%牛血清白蛋白、2mM乙二胺四乙酸，pH7. 2 的憐酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS), 0. 22 μ m過濾除菌，保持4 8°C )充分混懸細(xì)胞(按O. 3ml/lX IO8細(xì)胞濃度即可)，加入⑶133抗體包被的超微磁珠，混勻后置4°C孵育30min。將分離柱安裝入磁場中，加入O. 5ml緩沖液，在重力作用下自然流盡，以預(yù)處理分離柱。將孵育完的細(xì)胞懸液加到分離柱中，自然流盡。洗柱兩次。從磁場中取下分離柱，插在試管口，加I 2ml的緩沖液，用針芯推盡液體，沖出陽性結(jié)合的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗一次，離心IOOOrpm, 5min,接種到含EGF (20ng/ml),bFGF(20ng/ml), LIF(10ng/ml), B27(lx)的無血清培養(yǎng)基中，置入 37°C，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對照組臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后不進(jìn)行磁珠分選，直接接種到上述培養(yǎng)基中。兩組視具體情況每2 4d換液一次。3、膠原海綿處理方法膠原海綿的膜片規(guī)格3mm直徑，Imm厚，將直徑3mm的膠原膜和肝素化膠原膜浸泡于5ml PBS溶液中過夜，晾干后分別滴入O. 25ml rhBMP2/7PBS溶液(高中低劑量組分別為400ng/ml, 100ng/ml, 25ng/ml),低溫真空干燥，備用。4、動(dòng)物模型制備采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按0. 4ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規(guī)消毒，安裝立體定向接種針。選定右側(cè)額葉為接種祀點(diǎn)，其坐標(biāo)為冠狀縫前1mm，矢狀縫右3mm處切開皮膚，鉆孔(直徑3mm)，將BMP2/7復(fù)合膠原海綿植于額葉腦皮質(zhì)下，將腫瘤細(xì)胞懸液以I μ I/min的速度注射入靶區(qū)，除針前留針5min，使細(xì)胞充分沉淀，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫
口 ο5、抗膠質(zhì)瘤化療藥物替尼泊式(teniposide,VM-26),順鉬(cis-diamminedichlo-roplatin, CDDP)，長春新堿(vincristine, VCR)。按Limburg推薦的公式計(jì)算藥物的血衆(zhòng)峰濃度(peak plasmaconcentration,PPC) ( μ g/ml) = 50XD/5000X2X 103，其中 D 為臨床化療劑量(mg/kg/d),分別選用O. I X PPC、1 X PPC、10 X PPC為實(shí)驗(yàn)用藥濃度。聯(lián)合用藥根據(jù)各藥半數(shù)有效濃度(50% inhibiting concentration, IC50)來確定實(shí)驗(yàn)用藥濃度。見下表2。 6、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組造模后3天，按照完全隨機(jī)的方法將荷瘤大鼠分為以下八組BMP2/7+化療藥物干預(yù)BMP2/7+VM-26 組400ng/ml BMP2/7+3mm 海綿 +0. 05ug/mlVM_26BMP2/7+CDDP 組400ng/ml BMP2/7+3mm 海綿 +0. 3ug/mlCDDPBMP2/7+VCR 組400ng/ml BMP2/7+3mm 海綿 +3. Oug/mlVCR單純化療藥物VM-26 組400ng/ml BSA+3mm 海綿 +5. Oug/mlVM-26CDDP 組400ng/ml BSA+3mm 海綿 +3. Oug/mlCDDPVCR 組400ng/ml BSA+3mm 海綿+3. Oug/mlVCR對照組BMP2/7 組400ng/ml BMP2/7+3mm 海綿膠原海綿組400ng/mlBSA+3mm 海綿每組各10只大鼠。7、荷瘤大鼠的膠原海綿移植隨機(jī)分組完成后，采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按0. 4ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規(guī)消毒，安裝立體定向接種針。選定右側(cè)額葉為接種祀點(diǎn)，其坐標(biāo)為冠狀縫前1_，矢狀縫右3mm處切開皮膚，鉆孔(直徑3mm)，將BMP2/7復(fù)合膠原海綿植于額葉腦皮質(zhì)下，除針前留針5min，使細(xì)胞充分沉淀，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合。按照上述的方法進(jìn)行膠原海綿移植，分組如下BMP2/7+VM-26 組；BMP2/7+CDDP 組；BMP2/7+VCR 組；VM_26 組；CDDP組；VCR組；BMP2/7組對照組；膠原海綿組對照組。8、結(jié)果觀察(I)各組大鼠的行為學(xué)觀察治療各組細(xì)胞移植后，每日觀察大鼠的神態(tài)、進(jìn)食、活動(dòng)等狀態(tài)。(2)各組大鼠的生存周期觀察治療后，每日觀察各組大鼠的存活情況，記錄生存時(shí)間。(3)腫瘤體積的計(jì)算取MRI掃描的最大冠狀面和矢狀面，測量最大前后徑(L)、寬徑(W)和高徑(H),觀察腫瘤生長情況。腫瘤大小以下述公式計(jì)算腫瘤體積(V) V =(4/3X 31 XLXWXH) X 1/8 計(jì)算。9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
各組計(jì)量資料均采用i±SD表示，細(xì)胞生長曲線采用重復(fù)測量方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)的組間比較采用oneway ANOVA,多重比較采用LSD法比較分析；生存周期采用Kaplan —Meier, Long-rank分析；其余實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用oneway AN0VA,多重比較采用LSD法比較分析。采用SPSS13. O統(tǒng)計(jì)軟件包處理，P < O. 05時(shí)認(rèn)為差異具有顯著意義。(二)結(jié)果與分析I、生存周期分析經(jīng)生存周期分析發(fā)現(xiàn)，各組大鼠的中位生存期見下表3。2.各組大鼠腫瘤大小的變化根據(jù)每周MRI檢查的結(jié)果(見表4)，計(jì)算各組大鼠腫瘤的體積變化，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明7，14天BMP2/7組與化療藥物干擾組比較無顯著差異，而與膠原海綿對照組比較P <0.01有顯著差異。21-56天BMP2/7與化療藥物干擾組出現(xiàn)顯著差異，P <0.01。BMP2/7與單純的化療藥物組比較也表現(xiàn)顯著差異，說明BMP2/7可以協(xié)同化療藥物抑制腫瘤生長。同時(shí)，我們采用小動(dòng)物成像系統(tǒng)檢測BMP2/7的協(xié)同作用，結(jié)果如圖9所示，具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。實(shí)施例3緩釋載體的藥物分布動(dòng)力學(xué)特征EDC是一種具有良好水溶性的碳二亞胺類化合物，容易與醇、羧酸、胺等化合物中的活潑氫發(fā)生加成反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化合物，因而是一種應(yīng)用廣泛的縮合劑。它能夠激活膠原中谷氨酸和天冬氨酸殘基上羧基，使之與膠原中的賴氨酸或羥基賴氨酸上的氨基形成酰胺鍵，從而提高膠原的機(jī)械性能及其熱穩(wěn)定性。而肝素是一種線型陰離子多糖，其含有的多種-OH、-C00H、-S03H、NH2等官能團(tuán)，均能用于高分子材料的肝素化反應(yīng)，因此本試驗(yàn)條件下，肝素中的羧基經(jīng)EDC活化后，與膠原膜中的-NH2等基團(tuán)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。(一)材料與方法I、膠原蛋白的交聯(lián)取凍干膠原片稱重，記錄膠原片的質(zhì)量，配置O. 05M的2-甲基嗎啡磺酸(MES) 100ml (PH5. O)。室溫下，將膠原片浸泡于上述溶質(zhì)與酒精的混合物中(酒精體積為40% )，再向溶液中加入N，N-環(huán)己基碳化二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，按質(zhì)量比為每克膠原蛋白1.731克EDC和O. 415克NHS，浸泡4小時(shí)。2、膠原蛋白的肝素化交聯(lián)的膠原蛋白PH5. O的MES緩沖液中浸泡30分鐘以上，按I : O. 6配制EDC/NHS溶液，將肝素溶于O. 05M的MES緩沖液(PH5. O)中，肝素濃度為2% (w/v)，按一定比例加入EDC/NHS溶液。IOmin后，按每克膠原蛋白188. 3ml的比例加入EDC/NHS活化的肝素溶液，孵育2小時(shí)后，分別用O. IM的Na2HPO4,4M NaCl與無菌蒸餾水漂洗。3、rhBMP2/7與肝素化膠原蛋白的結(jié)合將直徑IOmm的膠原膜和肝素化膠原膜浸泡于5ml PBS溶液中過夜，晾干后分別滴入O. 25ml的125I標(biāo)記的rhBMP2/7PBS溶液，室溫靜置90min后，PBS漂洗3次，Y液閃計(jì)數(shù)器測定放射強(qiáng)度。4、rhBMP2/7的125I標(biāo)記按常規(guī)方法進(jìn)行。5、rhBMP2/7 釋放實(shí)驗(yàn)取復(fù)合了 rhBMP2/7的IOmm肝素化膠原膜(對照為非肝素化膠原膜)，置于C2C12細(xì)胞培養(yǎng)液中(10% FBS,DMEM), 37 0C 5% C02培養(yǎng)箱中溫育，每24h換液I次，_20°C凍存，IOd后ELISA檢測培養(yǎng)液中rhBMP2/7的濃度。6、rhBMP2/7體內(nèi)釋放實(shí)驗(yàn)采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按O. 4ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規(guī)消毒，安裝立體定向接種針。選定右側(cè)額葉為接種祀點(diǎn)，其坐標(biāo)為冠狀縫前1mm，矢狀縫右3mm處切開皮膚，鉆孔(直徑3mm)，將BMP2/7復(fù)合膠原海綿植于額葉腦皮質(zhì)下Imm處，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合。分別于術(shù)后4h及l(fā)、2、3、7、15d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取出腦組織內(nèi)殘余緩釋微球，去離子水沖洗表面，冷凍干燥以除去殘留水分。液閃計(jì)數(shù)器檢測BMP2/7殘余量，與植入時(shí)膠原中BMP2/7量比較，繪出不同劑量膠原海綿的釋放曲線，并進(jìn)行對比。7、體內(nèi)rhBMP2/7藥物分布將35只大鼠按時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分成7組，每組5只。采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按O. 4ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒 低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規(guī)消毒，安裝立體定向接種針。選定右側(cè)額葉為接種靶點(diǎn)，其坐標(biāo)為冠狀縫前1mm，矢狀縫右3mm處切開皮膚，鉆孔(直徑3mm)，將BMP2/7復(fù)合膠原海綿植于額葉腦皮質(zhì)下Imm處，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合。分別于術(shù)后4h及1、2、3、
7、10、15d 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取大鼠腦植入部位、對側(cè)對稱部位腦組織各Ig及血O. 5ml,以4N濃度NaOH溶液37 °C水浴消化組織，過濾，置入5ml放射液閃溶液中進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。8、腦組織對復(fù)合膠原海綿的炎癥反應(yīng)7只雄性SD大鼠，采用10%水合氯醛對Fisher 344大鼠按O. 4ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉后，顱平位固定與腦立體定位儀上，門齒低于耳根連線3mm。碘酒、酒精常規(guī)消毒，安裝立體定向接種針。選定右側(cè)額葉為接種祀點(diǎn)，其坐標(biāo)為冠狀縫前1_，矢狀縫右3mm處切開皮膚,鉆孔(直徑3mm),將BMP2/7復(fù)合膠原海綿植于額葉腦皮質(zhì)下Imm處，顱骨骨孔用消毒骨蠟密閉，縫合。每天2次觀察動(dòng)物，尤其注意警惕性降低、被動(dòng)、煩躁、易激惹、恐懼等行為改變以及運(yùn)動(dòng)障礙和步態(tài)不穩(wěn)等神經(jīng)功能障礙。分別于術(shù)后4h及1、2、
3、7、10、15d 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取出完整腦組織，10%福爾馬林固定lw，12林m切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。9、數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差x(±) s表示，組間比較采用方差分析，SAS件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P < O. 05為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(二)結(jié)果與分析I、肝素化載體結(jié)合能力與肝素濃度的關(guān)系125I標(biāo)記的rhBMP2/7與肝素化的膠原蛋白結(jié)合，檢測載體結(jié)合rhBMP2/7的能力，肝素化膠原載體的結(jié)合能力與肝素濃度有一定的相關(guān)性，肝素濃度為30-40mg/g膠原時(shí)(EDCiHep為O. 4-0. 6)結(jié)合的rhMP2/7最多，以后進(jìn)入平臺期，肝素濃度繼續(xù)增高時(shí)結(jié)合rhBMP2/7的量有一定下降。(見圖10)2、肝素化載體結(jié)合能力與rhBMP2/7濃度的關(guān)系我們又分析了肝素化膠原載體(EDC = Hep為O. 4)結(jié)合能力與rhBMP2/7濃度的關(guān)系，結(jié)果表明二者之間呈線性關(guān)系，而且各作用濃度下，肝素化膠原結(jié)合的重組蛋白明顯高于非肝素化的對照組。(見圖11)
3、rhBMP2/7 的緩釋性能我們將rhBMP2/7復(fù)合肝素化膠原浸泡于C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)基中，在體外研究復(fù)合載體的緩釋動(dòng)力學(xué)特征。起始條件下，肝素化膠原蛋白(EDC:HepS0.4)與對照膠原蛋白結(jié)合rhBMP2/7的量分別為27ng與49ng。48h內(nèi)對照載體有41 %的重組蛋白釋放，而實(shí)驗(yàn)組只釋放約15%的重組蛋白，IOd之后對照組累積釋放22. 4ng(83% )的rhBMP2/7，而實(shí)驗(yàn)組的釋放水平為20ng(42% )，其緩釋能力明顯優(yōu)于對照組。(見圖12)4、rhBMP2/7的體內(nèi)緩釋能力我們將rhBMP2/7復(fù)合肝素化膠原植于大鼠皮層下Imm處，在體研究復(fù)合載體的緩釋動(dòng)力學(xué)特征。4h時(shí)，肝素化膠原蛋白(EDC:!fepS0.4)與對照膠原蛋白結(jié)合rhBMP2/7的緩釋程度分別為30%與10%。48h內(nèi)對照載體有60%的重組蛋白釋放，而實(shí)驗(yàn)組只釋放約40 %的重組蛋白，15d之后對照組累積釋放92 %的rhBMP2/7，而實(shí)驗(yàn)組的釋放水平為56 %，其緩釋能力明顯優(yōu)于對照組。(見圖13) 5、緩釋載體植入后體內(nèi)藥物分布實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差x(±) s表示，組間比較采用方差分析，P < O. 05為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按照緩釋載體植入的不同位置進(jìn)行方差分析，不同位置的放射計(jì)數(shù)不同，P < O. 01。按照緩釋載體植入后的不同時(shí)間進(jìn)行方差分析，不同時(shí)間的放射計(jì)數(shù)不同，P < O. 01 (見表5)。結(jié)果表明，BMP2/7緩釋載體植入局部腦組織的BMP2/7濃度明顯高于血清及對側(cè)組織P (均< O. 0001)，48h以內(nèi)大腦組織的每分鐘計(jì)數(shù)為血液中的6-15倍。2W時(shí)緩釋微球植入側(cè)腦組織藥物濃度是血清濃度的70倍，說明緩釋系統(tǒng)不但提高了靶區(qū)腦組織的藥物濃度，同時(shí)降低非靶區(qū)組織藥物濃度，避免藥物的毒副作用。血清中的BMP2/7緩釋載體植入體內(nèi)BMP2/7藥物分布情況如見表6。實(shí)施例4緩釋系統(tǒng)的生物相容性研究(一 )材料與方法同實(shí)施例3。(二)結(jié)果與分析大鼠腦組織與緩釋系統(tǒng)的生物相容性(見圖14)所有動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)明顯行為改變和神經(jīng)功能缺陷，未出現(xiàn)全身或局部毒性反應(yīng)，均存活到預(yù)計(jì)處死時(shí)間點(diǎn)，體重均增加。系統(tǒng)置入大鼠皮層后4h和ld，HE染色發(fā)現(xiàn)置入?yún)^(qū)周圍組織水腫伴有少量出血，伴有小膠質(zhì)細(xì)胞和少枝膠質(zhì)細(xì)胞。植入后2d腦組織表現(xiàn)為壞死、炎性反應(yīng)、中性白細(xì)胞侵潤。植入后3d HE染色周圍腦組織水腫，小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，類似腦梗塞表現(xiàn)。植入后7d HE染色膠質(zhì)細(xì)胞侵潤。植入后15d HE染色星形細(xì)胞增生。植入后21d HE染色星形細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)元呈缺血表現(xiàn)。微球置入后臨近及周圍腦組織呈現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，包括多量肥大星形細(xì)胞，21d后膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)開始減輕。Tdays14days21days28days56days
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P0,000CL 0000.000表I 9L細(xì)胞接種后7-56天，MRI檢測各組腫瘤體積變化(單位mm3)1與對照組比較P < O. 01 ；2與低劑量組比較；3與中劑量組比
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Km 0.050,3 3,0表2三種藥物的血漿峰濃度(ug/ml)和IC5C)(ug/ml)Means and Medians for Survival Time
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OvefSlI63.2tQ232258.30768.19358.000j 7.553 j43.17772.823ja. Estimation is limited to the largest survival time if it is censored.表3各組大鼠的中位生存期
權(quán)利要求
1.一種BMP2/7緩釋系統(tǒng)在腦膠質(zhì)瘤治療上的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于BMP2/7的載體采用肝素化膠原蛋白；所述的肝素化膠原蛋白的制作步驟 步驟I :膠原蛋白的交聯(lián)，取凍干膠原片稱重，記錄膠原片的質(zhì)量，配置O. 05M的2-甲基嗎啡磺酸(MES) IOOml (PH5. O);室溫下，將膠原片浸泡于上述溶質(zhì)與酒精的混合物中(酒精體積為40% )，再向溶液中加入N，N-環(huán)己基碳化二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，按質(zhì)量比為每克膠原蛋白1.731克EDC和O. 415克NHS，浸泡4小時(shí)； 步驟2 :膠原蛋白的肝素化，交聯(lián)的膠原蛋白PH5. O的MES緩沖液中浸泡30分鐘以上，按I : O. 6配制EDC/NHS溶液，將肝素溶于O. 05M的MES緩沖液(PH5. O)中，肝素濃度為2% (w/v)，按一定比例加入EDC/NHS溶液；IOmin后，按每克膠原蛋白188.3ml的比例加入EDC/NHS活化的肝素溶液，孵育2小時(shí)后，分別用O. IM的Na2HP04，4M NaCl與無菌蒸餾水漂洗。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于BMP2/7采用異源二聚體類似物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于采用柔性連接技術(shù)表達(dá)BMP2/7異源二聚體類似物；柔性連接技術(shù)參考本發(fā)明人的專利“一種BMP2/7異源二聚體結(jié)構(gòu)類似物及其表達(dá)方法與應(yīng)用”,專利200610034620. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求2和權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于BMP2/7異源二聚體與肝素化膠原蛋白結(jié)合制成BMP2/7緩釋系統(tǒng)，結(jié)合步驟如下 將直徑IOmm的肝素化膠原膜浸泡于5ml PBS溶液中過夜，晾干后滴入O. 25ml的BMP2/7PBS溶液，室溫靜置90min后，PBS漂洗3次。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于通過構(gòu)建大鼠顱內(nèi)荷瘤模型，進(jìn)行BMP2/7緩釋載體與化療藥物的協(xié)同作用、BMP2/7緩釋載體的分布動(dòng)力學(xué)特征、BMP2/7緩釋載體的生物相容性研究。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于在瘤體內(nèi)注射BMP2/7緩釋載體，能夠明顯抑制腫瘤的增殖，起到明顯的治療效果；BMP2/7緩釋載體能夠協(xié)同化療藥物抑制腫瘤的生長；緩釋系統(tǒng)不但提高了靶區(qū)腦組織的藥物濃度，同時(shí)降低了非靶區(qū)組織的濃度，避免藥物的毒副作用；所有大鼠均未發(fā)生明顯行為改變和神經(jīng)功能缺陷，未出現(xiàn)全身或者局部毒性反應(yīng)，表明BMP2/7緩釋載體的生物相容性良好。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于通過構(gòu)建裸鼠顱內(nèi)移植瘤模型，BMP2/7緩釋系統(tǒng)單獨(dú)作用能部分抑制腫瘤組織的形成，腫瘤組織對化療藥物不夠敏感，而兩者卻又明顯的協(xié)同作用，充分證明BMP2/7治療腦膠質(zhì)瘤的潛在價(jià)值。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于通過構(gòu)建裸鼠皮下移植U251膠質(zhì)瘤模型，BMP2/7能夠協(xié)同化療藥物顯著抑制裸鼠皮下瘤的生長。
10.根據(jù)權(quán)利要求7、權(quán)利要求8、權(quán)利要求9的應(yīng)用，其特征在于采用復(fù)合BMP2/7的緩釋載體，在腦膠質(zhì)瘤的局部可以形成高濃度的給藥環(huán)境并能緩慢釋放BMP2/7，抑制腦膠質(zhì)瘤的增殖，促進(jìn)其分化，如果配合傳統(tǒng)的治療手段如放療或化療，能夠在不同的水平不同的途徑發(fā)揮作用，增加了消除腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的可能性。
全文摘要
本發(fā)明公開了BMP2/7緩釋系統(tǒng)在腦膠質(zhì)瘤治療上的應(yīng)用，其中BMP2/7的載體采用共價(jià)結(jié)合肝素的膠原。本發(fā)明通過BMP2/7緩釋載體的大鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)、裸鼠顱內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)、裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行了BMP2/7緩釋載體與化療藥物的協(xié)同作用、BMP2/7緩釋載體的分布動(dòng)力學(xué)特征、BMP2/7緩釋載體的生物相容性研究，闡明了采用復(fù)合BMP2/7的緩釋載體，在腦膠質(zhì)瘤的局部可以形成高濃度的給藥環(huán)境并能緩慢釋放BMP2/7，抑制腦膠質(zhì)瘤的增殖，促進(jìn)其分化，如果配合傳統(tǒng)的治療手段如放療或化療，能夠在不同的水平不同的途徑發(fā)揮作用，增加了消除腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的可能性。
文檔編號C08H1/06GK102772786SQ201210302569
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者吳培誠, 孫奮勇, 康賢通 申請人:廣州華燦醫(yī)藥科技有限公司