一種分離純化重組蛋白的核殼式磁性復(fù)合微球及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于納米功能材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種分離純化重組蛋白的核殼式磁性復(fù)合微球及其制備方法。本發(fā)明核殼式磁性復(fù)合微球的核為磁性四氧化三鐵納米粒子團(tuán)簇，殼為交聯(lián)的含環(huán)氧基團(tuán)的聚合物網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)下述方法制備：首先制備檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁性納米粒子團(tuán)簇，接著采用溶膠凝膠法，使磁簇表面修飾上活性的乙烯基官能團(tuán)，然后通過(guò)蒸餾-沉淀聚合制得高磁響應(yīng)性單分散的表面富含環(huán)氧基團(tuán)的核殼式磁性聚合物復(fù)合微球，再用亞氨基二乙酸與環(huán)氧基團(tuán)進(jìn)行開(kāi)環(huán)反應(yīng)，絡(luò)合鎳離子，最后進(jìn)行組氨酸標(biāo)記蛋白的分離純化。該核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合微球制備方法簡(jiǎn)單，過(guò)程可控，分離純化重組蛋白的效率較高。本發(fā)明方法可精確控制聚合物殼層的厚度、交聯(lián)度以及表面官能團(tuán)的密度，應(yīng)用前景良好。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種分離純化重組蛋白的核殼式磁性復(fù)合微球及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米功能材料【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及磁性復(fù)合微球，具體涉及一種分離純化重組蛋白的核殼式磁性復(fù)合微球及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化復(fù)合微球，尤其是磁性復(fù)合微球正受到人們的廣泛關(guān)注。由于磁性高分子微球同時(shí)具有無(wú)機(jī)磁性材料的磁響應(yīng)性和有機(jī)高分子的表面可修飾性，可以在外加磁場(chǎng)下方便、快速、高效的分離目標(biāo)生物分子。因此，在蛋白純化、細(xì)胞分離、磁共振檢測(cè)和磁靶向載藥等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了，通過(guò)乳液聚合方法(包括傳統(tǒng)的乳液聚合、無(wú)皂乳液聚合、微乳液聚合和細(xì)乳液聚合)可以制備出不同結(jié)構(gòu)的磁性聚合物復(fù)合微球。但是乳液聚合對(duì)于結(jié)構(gòu)以及磁含量的控制相對(duì)較差。通常需要借助過(guò)渡層(如二氧化硅)獲得結(jié)構(gòu)較好、磁含量可控的復(fù)合微球，但是實(shí)踐顯示，包覆中間層二氧化硅層會(huì)降低整個(gè)微球的磁飽和強(qiáng)度。另外由于乳液聚合大多采用過(guò)硫酸鉀等帶電水溶性引發(fā)劑，反應(yīng)結(jié)束后往往使微球帶有相應(yīng)的電荷，在一定程度上影響后續(xù)的應(yīng)用；并且上述方法常常需要共聚疏水性單體，這會(huì)使得表面官能團(tuán)密度下降。為了解決這一問(wèn)題，有研究采用蒸餾沉淀聚合，其中不需借助過(guò)渡層，可直接在磁性納米粒子表面包覆聚合物殼層，可采用不帶電的油溶性引發(fā)劑，并且無(wú)需共聚其他單體，表面官能團(tuán)密度較大，但近年來(lái)其主要被報(bào)道用于親水聚合物的包覆。迄今，尚未見(jiàn)有采用蒸餾沉淀包覆疏水性單體的報(bào)道，而開(kāi)發(fā)利用蒸餾沉淀法直接包覆疏水性單體對(duì)復(fù)合微球材料的制備是十分必要的。
[0004]據(jù)研究公開(kāi)，磁性載體固定金屬離子親和色譜分離法是從生物混合體系中分離高純度的目標(biāo)生物分子的方法，它將親和配基偶聯(lián)在磁性分離載體表面，在磁場(chǎng)定向控制下，通過(guò)親和吸附、清洗和解吸等操作步驟，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離純化。實(shí)踐證實(shí)，該方法具有分離速度快、選擇性好、載體不易污染、回收率高等顯著優(yōu)勢(shì)，在生物產(chǎn)品大規(guī)模分離純化方面具有重要的發(fā)展?jié)摿?。但近年氨三乙酸配體用的較多，其價(jià)格較為昂貴，且目前磁性復(fù)合微球尚存在粒徑分布不均一、磁含量低、表面缺乏足夠的活性官能團(tuán)等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提出一種核殼式磁性復(fù)合微球，該復(fù)合微球磁含量高，能高效、較大量特異性富集組氨酸標(biāo)記蛋白。
[0006]本發(fā)明的核殼式磁性復(fù)合微球以無(wú)機(jī)磁性納米晶團(tuán)簇(簡(jiǎn)稱(chēng)磁簇)為核，以含環(huán)氧聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)為殼，所述的含環(huán)氧基團(tuán)的聚合物交聯(lián)殼層通過(guò)蒸餾沉淀聚合的方法包覆在無(wú)機(jī)磁性納米晶團(tuán)簇表面層，聚合物殼層經(jīng)亞氨基二乙酸開(kāi)環(huán)反應(yīng)后，絡(luò)合金屬離子Ni2+、Cu2+或和Zn2+，進(jìn)行分離純化組氨酸標(biāo)記蛋白。
[0007]本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法，本方法中無(wú)需過(guò)渡層直接制備以無(wú)機(jī)磁性納米晶團(tuán)簇為核，聚甲基丙烯酸縮水甘油酯殼層的核殼式磁性復(fù)合微球，進(jìn)一步進(jìn)行開(kāi)環(huán)改性，絡(luò)合金屬離子，進(jìn)行組氨酸標(biāo)記蛋白的分離純化。該制備方法簡(jiǎn)單，過(guò)程可控，分離純化重組蛋白的效率較高。本發(fā)明方法可精確控制聚合物殼層的厚度、交聯(lián)度以及表面官能團(tuán)的密度，應(yīng)用前景良好。
[0008]更具體的，本發(fā)明的核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法，其特征在于，其包括步驟:
[0009]I)首先，以六水合三氯化鐵、醋酸鹽和檸檬酸鹽為原料制備檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁性納米粒子團(tuán)簇(簡(jiǎn)稱(chēng)磁簇);
[0010]2)接著，采用溶膠凝膠法對(duì)磁簇表面進(jìn)行修飾，使其表面帶上活性的乙烯基官能團(tuán)；
[0011]3)然后，以表面含有乙烯基的磁簇為種子，通過(guò)蒸餾沉淀聚合的方法在磁簇表面包覆一層致密的含環(huán)氧聚合物的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)殼層，制得以磁簇為核、含環(huán)氧聚合物網(wǎng)絡(luò)為殼的磁性聚合物復(fù)合微球；
[0012]4)再用亞氨基二乙酸與上述帶有環(huán)氧基團(tuán)的殼層進(jìn)行開(kāi)環(huán)反應(yīng)，使其核殼微球帶有二乙酸基團(tuán)，從而能進(jìn)一步螯合金屬離子；
[0013]5)最后用表面帶有二乙酸基團(tuán)的核殼微球絡(luò)合金屬離子(主要是Ni2+、Cu2+和Zn2+)，進(jìn)行分離純化組氨酸標(biāo)記蛋白；所述金屬離子(主要是Ni2+、Cu2+或Zn2+)。
[0014]本發(fā)明上述步驟I中，將0.6_6g六水合三氯化鐵、1.8_20g醋酸鹽和0.2-2.4g檸檬酸鹽溶解在20-80ml乙二醇中，在140-180°C下機(jī)械攪拌0.5__2h，然后置于含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜放置于180-220°C的烘箱中14-36h，取出，用自來(lái)水使其冷卻至室溫；用磁分離分離出產(chǎn)物磁簇，并用無(wú)水乙醇洗滌除去未反應(yīng)的反應(yīng)物，最后將產(chǎn)物磁簇分散在無(wú)水乙 醇中，備用。
[0015]本發(fā)明上述步驟2中，將以上得到的磁簇、20-300ml無(wú)水乙醇、5_75ml去離子水、0.5-7.5ml氨水以及0.2_3g帶雙鍵的硅烷偶聯(lián)劑(如KH 570)加入三口燒瓶中，在反應(yīng)溫度為50-90°C下機(jī)械攪拌20-30h，使磁簇表面修飾上活性的乙烯基官能團(tuán)；反應(yīng)結(jié)束后，用磁分離得到產(chǎn)物表面修飾有乙烯基的磁簇，并用無(wú)水乙醇除去過(guò)量的硅烷偶聯(lián)劑；然后放入真空烘箱進(jìn)行干燥。
[0016]本發(fā)明上述步驟3中，將25-500mg得到的表面修飾有乙烯基的磁簇、50μ L-4mL側(cè)鏈帶環(huán)氧的烯類(lèi)單體、2.5mg-4gN,N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、l_80mg 2，2-偶氮二異丁腈以及溶劑20-400ml乙腈加入50-1000ml單口燒瓶中，超聲使其混合均勻；將燒瓶連接到裝有精餾柱、直形冷凝管以及接收器的蒸餾裝置上；從室溫升溫到沸騰狀態(tài)，然后控制在l_3h內(nèi)蒸出20-70wt%溶劑；反應(yīng)結(jié)束后用磁分離，并用無(wú)水乙醇和去離子水進(jìn)行洗滌，分散在水中備用。
[0017]本發(fā)明上述步驟4中，將0.3_5g亞氨基二乙酸溶于10_200ml水中，然后加入0.2-4g氫氧化物，配置成溶液，用l_5mol/L的碳酸鹽調(diào)節(jié)體系pH為10-11，取之前制備的表面帶環(huán)氧的磁性復(fù)合微球加入到該溶液中，超聲分散，于50-100°C反應(yīng)8-24h，反應(yīng)結(jié)束后用磁分離，并用去離子水進(jìn)行洗滌。
[0018]本發(fā)明上述步驟5中，將上述經(jīng)亞氨基二乙酸改性的磁性復(fù)合微球，加入到濃度為lO-lOOmg/mL的10_200mL鎳鹽溶液中，超聲分散，在室溫下攪拌反應(yīng)l_24h ;反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水反復(fù)清洗顆粒，將顆粒保存在去離子水中備用。[0019]本發(fā)明中，所述的醋酸鹽選自醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸鋰、醋酸鎂和醋酸銨中的一種。
[0020]本發(fā)明中，所述的檸檬酸鹽選自檸檬酸和檸檬酸鈉中的一種，也可以是聚丙烯酸，聚丙烯酸鈉，聚谷氨酸及瓊脂糖等親水性高分子中的一種。
[0021]本發(fā)明中，所述的側(cè)鏈帶環(huán)氧的烯類(lèi)單體選自甲基丙烯酸縮水甘油酯、烯丙基縮水甘油醚等含有環(huán)氧的烯類(lèi)單體中的一種或其中的幾種。
[0022]本發(fā)明中，所述的聚合反應(yīng)體系(側(cè)鏈帶羧基的烯類(lèi)單體及N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的濃度之和)的濃度為0.001wt%到10wt%之間。
[0023]本發(fā)明中，所述的交聯(lián)劑N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的用量與N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺用量和側(cè)鏈帶羧基的烯類(lèi)單體用量總和的百分比值為大于等于30wt%。
[0024]本發(fā)明制得的磁性聚合物復(fù)合微球，粒徑分布均一，結(jié)構(gòu)規(guī)整，并且具有高磁響應(yīng)性以及表面可修飾的特性。所述的復(fù)合微球表面經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的修飾以后，能絡(luò)合金屬離子，然后利用固定金屬離子親和色譜特異性分離純化組氨酸標(biāo)記的蛋白，分離能力良好(103 μ g蛋白/mg磁珠)。
[0025]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有:
[0026](I)通過(guò)蒸餾沉淀聚合制備得到的具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性復(fù)合微球，粒徑分布均一，結(jié)構(gòu)規(guī)整；
[0027](2)磁性復(fù)合微球的磁含量高；
[0028](3)核殼式磁性復(fù)合微球的表面富含功能的環(huán)氧基團(tuán)，并可進(jìn)一步修飾；
[0029](4)核殼式磁性復(fù)合微球的制備過(guò)程簡(jiǎn)單、高效；
[0030](5)該微球利用的親和配體價(jià)格低廉，分離純化標(biāo)記蛋白效果優(yōu)良，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0031]為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1:殼層厚度為50nm，交聯(lián)度為50%的核殼式Fe304/PMG/IDA-Ni2+微球透射電鏡圖。
[0033]圖2:磁性材料富集標(biāo)記蛋白前后跑出的電泳圖，其中泳道I為富集前的純組氨酸標(biāo)記蛋白，2為標(biāo)準(zhǔn)分子量的條帶，3為富集后的上清液，4為洗脫液。
[0034]圖3:磁性粒子循環(huán)用于組氨酸標(biāo)記蛋白的分離純化實(shí)驗(yàn)，
[0035](a)為磁性粒子循環(huán)利用5次跑的電泳圖，泳道I為標(biāo)準(zhǔn)分子量條帶，2為富集前的純組氨酸標(biāo)記蛋白，3、4、5、6、7為磁性粒子循環(huán)利用5次分別對(duì)應(yīng)的洗脫液；(b)為磁性粒子循環(huán)利用5次分別對(duì)應(yīng)的蛋白回收率。
[0036]圖4:磁性粒子從復(fù)雜細(xì)胞裂解液體系中分離純化組氨酸標(biāo)記蛋白電泳圖，
[0037](a)樣品Fe304/PMG/IDA-Ni2+富集前后的電泳圖；
[0038](b)為商用瓊脂糖磁珠富集前后電泳圖，其中MW為標(biāo)準(zhǔn)分子量條帶，L為富集前的細(xì)胞裂解液，3為上清液，5、20、30、40、80、120、160、200、250、300和500分別為用的洗脫液中咪唑濃度(mM)。
【具體實(shí)施方式】
[0039]實(shí)施例1:制層厚度為50nm左右，交聯(lián)度為75%的核殼式Fe304/PMG/IDA-Ni2+微球
[0040]1、制備檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁簇
[0041]將1.3g六水合三氯化鐵(FeCl3.6H20)，3.8g醋酸銨(NH4Ac), 0.4g檸檬酸鈉溶解在70mL乙二醇中后，加入150mL三口燒瓶中，然后升溫到160°C，保溫反應(yīng)Ih后，將燒瓶中液體轉(zhuǎn)入容量為IOOmL的含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，再將反應(yīng)釜放入200°C的烘箱反應(yīng)16h后取出，用自來(lái)水使其冷卻至室溫。用磁分離分離出產(chǎn)物，并用無(wú)水乙醇洗滌除去未反應(yīng)的反應(yīng)物，最后將產(chǎn)物分散在無(wú)水乙醇中備用；
[0042]2、對(duì)磁簇表面進(jìn)行活性乙烯基修飾
[0043]將以上得到的磁簇、40ml無(wú)水乙醇、IOml去離子水、1.5ml氨水以及0.6g硅烷偶聯(lián)劑KH 570加入150ml三口燒瓶中，升溫到70°C，保溫反應(yīng)24h后，磁分離得到產(chǎn)物并用無(wú)水乙醇除去過(guò)量的硅烷偶聯(lián)劑。然后放入真空烘箱進(jìn)行干燥；
[0044]3、制備核殼式 Fe304/PMG[0045]將以上干燥后的產(chǎn)物取約IOOmg和80ml乙腈加入200ml單口燒瓶中分散，再加入100 μ L甲基丙烯酸縮水甘油酯、300mgN，N, N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、8mg 2，2-偶氮二異丁腈，使其溶解在反應(yīng)體系中，然后將燒瓶連接到裝有精餾柱、直形冷凝管以及接收器的蒸餾裝置上，從室溫升溫到到沸騰狀態(tài)，控制使1.5h蒸出約50%溶劑，反應(yīng)結(jié)束后磁分離得到產(chǎn)物，并用無(wú)水乙醇進(jìn)行洗滌，最終得到殼層厚度為50nm左右的Fe304/PMG微球；
[0046]4、亞氨基二乙酸開(kāi)環(huán)反應(yīng)
[0047]將Ig亞氨基二乙酸溶于60ml水中，然后加入0.Sg氫氧化物，配置成溶液，接著用2mol/L的碳酸鈉調(diào)節(jié)體系pH為11,取制備的表面帶環(huán)氧的磁性復(fù)合微球IOOmg加入到該溶液中，超聲分散，于80°C反應(yīng)16h，反應(yīng)結(jié)束后用磁分離，并用去離子水進(jìn)行洗滌；
[0048]5、絡(luò)合 Ni2+
[0049]將上述經(jīng)亞氨基二乙酸改性的磁性復(fù)合微球，加入到濃度為50mg/mL的20mLNiCl2.6Η20溶液中，超聲分散，在室溫下攪拌反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水反復(fù)清洗顆粒，將顆粒保存在去離子水中備用。
[0050]實(shí)施例2:制備殼層厚度為50nm左右，交聯(lián)度為60%的核殼式Fe304/PMG/IDA-Ni2+微球
[0051]1、檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁簇的制備同實(shí)施例1-1中所述；
[0052]2、對(duì)磁簇表面進(jìn)行活性乙烯基修飾同實(shí)施例1-2中所述；
[0053]3、核殼式Fe304/PMG的制備同實(shí)施例1_3中所述，本實(shí)施例中的甲基丙烯酸縮水甘油酯、2，2-偶氮二異丁腈的用量分別為200 μ L、10mg ；
[0054]4、亞氨基二乙酸開(kāi)環(huán)反應(yīng)同實(shí)施例1-4中所述；
[0055]5、絡(luò)合Ni2+反應(yīng)同實(shí)施例1-5中所述。
[0056]實(shí)施例3:制備殼層厚度為50nm左右，交聯(lián)度為50%的核殼式Fe304/PMG/IDA-Ni2+微球(如圖1所示)[0057]1、檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁簇的制備同實(shí)施例1-1中所述；
[0058]2、對(duì)磁簇表面進(jìn)行活性乙烯基修飾同實(shí)施例1-2中所述；
[0059]3、核殼式Fe304/PMG的制備同實(shí)施例1_3中所述；本實(shí)施例中采用甲基丙烯酸縮水甘油酯、2，2-偶氮二異丁腈的用量分別為300yL、12mg ；
[0060]4、亞氨基二乙酸開(kāi)環(huán)反應(yīng)同實(shí)施例1-4中所述；
[0061]5、絡(luò)合Ni2+反應(yīng)同實(shí)施例1-5中所述。 [0062]實(shí)施例4:制備殼層厚度為20nm左右，交聯(lián)度為50%的核殼式Fe304/PMG/IDA-Ni2+微球
[0063]1、檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁簇的制備同實(shí)施例1-1中所述；
[0064]2、對(duì)磁簇表面進(jìn)行活性乙烯基修飾同實(shí)施例1-2中所述；
[0065]3、核殼式Fe304/PMG的制備同實(shí)施例1_3中所述；本實(shí)施例中采用的甲基丙烯酸縮水甘油酯、N, N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、2，2-偶氮二異丁腈的用量分別為200μ L、200mg、8mg ；
[0066]4、亞氨基二乙酸開(kāi)環(huán)反應(yīng)同實(shí)施例1-4中所述；
[0067]5、絡(luò)合Ni2+反應(yīng)同實(shí)施例1-5中所述。
[0068]實(shí)施例5:制備殼層厚度為80nm左右，交聯(lián)度為50%的核殼式Fe304/PMG/DIA-Ni2+微球
[0069]1、檸檬酸鈉穩(wěn)定的磁簇的制備同實(shí)施例1-1中所述；
[0070]2、對(duì)磁簇表面進(jìn)行活性乙烯基修飾同實(shí)施例1-2中所述；
[0071]3、核殼式Fe304/PMG的制備同實(shí)施例1_3中所述。本實(shí)施例中采用的甲基丙烯酸縮水甘油酯、N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、2，2-偶氮二異丁腈的用量分別為400yL、400mg、16mg ；
[0072]4、亞氨基二乙酸開(kāi)環(huán)反應(yīng)同實(shí)施例1-4中所述；
[0073]5、絡(luò)合Ni2+反應(yīng)同實(shí)施例1-5中所述。
[0074]實(shí)施例6:用殼層厚度為50nm交聯(lián)度為75%的磁性復(fù)合微球絡(luò)合鎳以后進(jìn)行分離組氨酸標(biāo)記蛋白的實(shí)驗(yàn)
[0075]1、首先取100 μ L Fe304/PMG/IDA-Ni2+磁性粒子，磁分離后用100 μ L緩沖溶液I(50mMTris pH 8.0, 300mM NaCl, 5mM imidazole)洗滌兩次，
[0076]2、接著加入100 μ L標(biāo)記蛋白，在室溫下富集30分鐘，
[0077]3、然后磁分離除去上清液，加入100 μ L緩沖溶液I洗滌兩次，
[0078]4、最后用 50 μ L 緩沖溶液 II (50mM Tris pH 8.0, 300mM NaCl, 5mM imidazole)進(jìn)行洗脫，跑電泳，測(cè)標(biāo)記蛋白的回收率。結(jié)果顯示，磁性復(fù)合微球絡(luò)合鎳離子(52ygNi2+/mg磁珠)以后分離純化組氨酸標(biāo)記的蛋白，分離能力良好(如圖2所示)，具體數(shù)值為99 μ g蛋白/mg磁珠。
[0079]實(shí)施例7:磁性粒子循環(huán)用于組氨酸標(biāo)記蛋白的分離純化實(shí)驗(yàn)
[0080]1、經(jīng)實(shí)例6中步驟4洗脫以后的磁性粒子加入100 μ L緩沖溶液I洗滌三次，洗去多余的咪唑，使得其表面恢復(fù)富集前的狀態(tài)，
[0081]2、對(duì)于磁性粒子重復(fù)實(shí)例6中的步驟4次，分別用洗脫液跑電泳(如圖3a所示)，測(cè)得標(biāo)記蛋白的回收率(如圖3b所示)，[0082]結(jié)果顯示:所述的復(fù)合微球表面經(jīng)過(guò)修飾以后，能有效絡(luò)合金屬Ni2+離子(55 μ gNi2+/mg磁珠)，然后利用固定金屬離子親和色譜特異性分離純化組氨酸標(biāo)記的蛋白，經(jīng)多次循環(huán)使用后分離能力保持良好，第一次為103 yg蛋白/mg磁珠，4次循環(huán)后為83 μ g蛋白/mg磁珠。
[0083]實(shí)施例8:磁性粒子在復(fù)雜的細(xì)胞裂解液體系中分離純化組氨酸標(biāo)記蛋白
[0084]1、取100 μ L商用瓊脂糖磁珠(5wt%)或500 μ L我們合成的Fe304/PMG/IDA_Ni2+磁性粒子(10mg/mL)，用緩沖溶液I洗滌兩次，
[0085]2、接著分別加入ImL細(xì)胞裂解液，富集30分鐘，
[0086]3、然后磁分離除去上清液，加入ImL緩沖溶液I洗滌兩次，
[0087]4、最后分別用含咪唑5、20、30、40、80、120、160、200、250、300和5001111的用緩沖溶液II連續(xù)洗脫，分別對(duì)洗脫液跑電泳(如圖4所示)。其中MW為標(biāo)準(zhǔn)分子量條帶，L為富集前的細(xì)胞裂解液，3為上清液，5、20、30、40、80、120、160、200、250、300和500分別為用的洗脫液中咪唑濃度(mM)。結(jié)果顯示，F(xiàn)e304/PMG/IDA-Ni2+樣品的富集量遠(yuǎn)大于商用瓊脂糖磁珠富集的量，且在洗咪唑脫液濃度為500mM時(shí)，仍然有結(jié)合蛋白洗脫，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明制備的微球不但結(jié)合量大，而且結(jié)合能力更強(qiáng)。`
【權(quán)利要求】
1.一種分離純化重組蛋白的核殼式磁性復(fù)合微球，其特征在于，該復(fù)合微球以無(wú)機(jī)磁性納米晶團(tuán)簇為核，以含環(huán)氧聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)為殼，經(jīng)亞氨基二乙酸開(kāi)環(huán)反應(yīng)后，絡(luò)合金屬離子，分離純化組氨酸標(biāo)記蛋白；所述的含環(huán)氧基團(tuán)的聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)通過(guò)蒸餾沉淀聚合的方法包覆在無(wú)機(jī)磁性納米晶團(tuán)簇表面。
2.按權(quán)利要求1所述的核殼式磁性復(fù)合微球，其特征在于，所述的金屬離子是Ni2+、Cu2+或 Zn2+。
3.一種分離純化重組蛋白的核殼式磁性復(fù)合微球的制備方法，其特征在于，其包括步驟: (O以六水合三氯化鐵、醋酸鹽和檸檬酸鹽為原料，制備檸檬酸鹽穩(wěn)定的磁性納米粒子團(tuán)簇； (2)用溶膠凝膠法對(duì)磁簇表面進(jìn)行修飾，使其表面帶上活性的乙烯基官能團(tuán)； (3)以表面含有乙烯基的磁性納米粒子團(tuán)簇為種子，通過(guò)蒸餾沉淀聚合的方法在磁簇表面包覆一層致密的含環(huán)氧基團(tuán)的聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，制得以無(wú)機(jī)磁性納米晶團(tuán)簇為核，以含環(huán)氧聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)為殼的磁性聚合物復(fù)合微球； (4)用亞氨基二乙酸與合成的帶有環(huán)氧基團(tuán)的核殼式復(fù)合微球開(kāi)環(huán)反應(yīng)，使其表面的二乙酸基團(tuán)絡(luò)合金屬離子； (5)用經(jīng)亞氨基二乙酸改性的微球絡(luò)合金屬離子分離純化組氨酸標(biāo)記蛋白。
4.按權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)或(5)中的金屬離子是Ni2+、Cu2+ 或 Zn2+。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述的步驟(1)中:將0.6-6g六水合三氯化鐵、1.8-20g醋酸鹽和0.2-2.4g檸檬酸鹽溶解在20-80mL乙二醇中，在140_180°C下機(jī)械攪拌0.5-2h，然后置于含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜放置于180-220°C的烘箱中14-36h，取出，用自來(lái)水使其冷卻至室溫；用磁分離分離出產(chǎn)物磁簇，并用無(wú)水乙醇洗滌除去未反應(yīng)的反應(yīng)物，最后將產(chǎn)物磁簇分散在無(wú)水乙醇中，備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述的步驟(2)中:將得到的磁簇、20-300mL無(wú)水乙醇、5_75mL去離子水、0.5-7.5mL氨水以及0.2_3g帶雙鍵的硅烷偶聯(lián)劑加入三口燒瓶中，在50-90°C反應(yīng)溫度下機(jī)械攪拌20—30h，使磁簇表面修飾上活性的乙烯基官能團(tuán)；反應(yīng)結(jié)束后，用磁分離得到產(chǎn)物表面修飾有乙烯基的磁簇，并用無(wú)水乙醇除去過(guò)量的硅烷偶聯(lián)劑；然后放入真空烘箱干燥。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述的步驟(3)中:將25-500mg得到的表面修飾有乙烯基的磁簇、50 μ L-4mL側(cè)鏈帶環(huán)氧的烯類(lèi)單體、2.5mg_4gN,N’ -亞甲基雙丙烯酰胺、l_80mg 2，2-偶氮二異丁腈以及溶劑20-400ml乙腈加入50_1000ml單口燒瓶中，超聲使其混合均勻；將燒瓶連接到裝有精餾柱、直形冷凝管以及接收器的蒸餾裝置上；從室溫升溫到沸騰狀態(tài)，然后控制在l_3h內(nèi)蒸出20-70wt%溶劑；反應(yīng)結(jié)束后用磁分離，并用無(wú)水乙醇洗滌。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述的步驟(4)中:將0.3-5g亞氨基二乙酸溶于10-200mL水中，然后加入0.2_4g氫氧化物，配置成溶液，接著用l_5mol/L的碳酸鹽調(diào)節(jié)體系PH為10-11，取制備的表面帶環(huán)氧的磁性復(fù)合微球加入到所述溶液中，超聲分散，于50-100°C反應(yīng)8-24h，反應(yīng)結(jié)束后用磁分離，并用去離子水洗滌。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述的步驟(5)中，將經(jīng)亞氨基二乙酸改性的磁性復(fù)合微球，加入到濃度為lO-lOOmg/mL的10_200mL鎳鹽溶液中，超聲分散，在室溫下攪拌反應(yīng)l_24h，反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水反復(fù)清洗顆粒，將顆粒保存在去離子水中，備用。
10.根據(jù)權(quán)利要求3—7任一所述的制備方法，其特征在于:所述的醋酸鹽選自醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸鋰、醋酸鎂或醋酸銨中的一種；所述的檸檬酸鹽選自檸檬酸或檸檬酸鈉；所述的氫氧化物選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂、氫氧化鋰或氨水中的一種；所述的碳酸鹽選自碳酸鈉或碳酸鉀；所述的鎳鹽選自氯化鎳、硝酸鎳、醋酸鎳或硫酸鎳中的一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求3—7任一所述的制備方法，其特征在于:所述的側(cè)鏈帶環(huán)氧的烯類(lèi)單體為甲基丙烯酸縮水甘油酯或烯丙基縮水甘油醚及其混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一所述的制備方法，其特征在于:所述的聚合反應(yīng)體系中，側(cè)鏈帶環(huán)氧的烯類(lèi)單體及N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的濃度之和為0.001wt%到10wt%之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一所述的制備方法，其特征在于:所述的交聯(lián)劑N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的用量與N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺用量和側(cè)鏈帶羧基的烯類(lèi)單體用量總和的百分比值為大于等于40wt%。`
【文檔編號(hào)】C08F8/32GK103665278SQ201210345930
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月16日
【發(fā)明者】汪長(zhǎng)春 申請(qǐng)人:上海遙科生物科技發(fā)展有限公司