專(zhuān)利名稱(chēng)：一種自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠及其制備方法。
背景技術(shù)：
由于年齡老化或者意外事故發(fā)生而導(dǎo)致人體組織缺損與功能衰退已經(jīng)嚴(yán)重地影響了人類(lèi)的健康與生活質(zhì)量，目前全世界每年耗資上千億美元用于病患者的組織修復(fù)，并且由于組織供體不足而使得很多病患者無(wú)法得到及時(shí)治療。近年來(lái)，組織工程的發(fā)展為組織再生以及功能恢復(fù)提供了重要途徑。透明質(zhì)酸水凝膠由于具有內(nèi)在的生物相容性、高吸水性、可注射性以及與天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似等優(yōu)異性質(zhì)，在藥物釋放以及軟骨、神經(jīng)、血管、皮膚、喉管等組織工程中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，近年來(lái)已在生物醫(yī)用領(lǐng)域受到廣泛 關(guān)注。水凝膠材料由于具有內(nèi)在的生物相容性、高吸水性、可注射性以及與天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似等優(yōu)異性質(zhì)近年來(lái)在生物醫(yī)用領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。透明質(zhì)酸，一種由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡糖為雙糖單位組成的直鏈高分子多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性、生物活性以及流變學(xué)特性，并且含有自由羧基和羥基，可在溫和條件下進(jìn)行改性，一直以來(lái)備受青睞，同時(shí)透明質(zhì)酸又是人體組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，能與細(xì)胞多種受體(如CD44，CD54，CD168)作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷移與生長(zhǎng)，在體內(nèi)可被透明質(zhì)酸酶降解為氨基葡萄糖被人體吸收，從而使透明質(zhì)酸及其衍生物在藥物釋放以及軟骨、神經(jīng)、血管、皮膚、喉管等組織工程中表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。但傳統(tǒng)的透明質(zhì)酸水凝膠是由透明質(zhì)酸大分子無(wú)規(guī)交聯(lián)形成的本體膠，存在力學(xué)性能低、不能對(duì)生物活性分子進(jìn)行控制釋放等缺點(diǎn)，在組織工程應(yīng)用中受到了很大的限制。為了克服這些缺點(diǎn)，近年來(lái)人們通過(guò)摻雜無(wú)機(jī)微米/納米顆粒(如粘土)、疏水性聚合物微米/納米粒子(如聚N，N- 二甲基丙烯酰胺)等方法來(lái)提高透明質(zhì)酸水凝膠的力學(xué)性能。無(wú)機(jī)納米顆粒和疏水性聚合物微納米顆?？捎行г鰪?qiáng)透明質(zhì)酸水凝膠，但在人體中不能降解或降解性能差，同時(shí)存在生物相容性問(wèn)題，對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用。此外，該體系也缺乏結(jié)合以及控制釋放生長(zhǎng)因子的功能。若將具有表面活性基團(tuán)的透明質(zhì)酸微米/納米粒子作為增強(qiáng)顆粒引入到透明質(zhì)酸水凝膠體系中制備具有雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸水凝膠，則透明質(zhì)酸微米/納米粒子不僅可以自增強(qiáng)透明質(zhì)酸水凝膠的力學(xué)性能，還可用于藥物、生長(zhǎng)因子、基因等生物活性物質(zhì)的控制釋放。由于自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠體系中的水凝膠基體和增強(qiáng)顆粒均采用相同的透明質(zhì)酸組分，因而將更有利于提高體系的穩(wěn)定性。為此，本發(fā)明采用與水凝膠基體成分相同的的透明質(zhì)酸微米/納米微球作為增強(qiáng)顆粒，通過(guò)構(gòu)建增強(qiáng)顆粒與基體之間的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)來(lái)制備自增強(qiáng)的雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠，以達(dá)到增強(qiáng)和控制釋放生物活性分子的目的。本發(fā)明中的雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠制備工藝簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，性能優(yōu)異，適合于批量生產(chǎn)，在生物醫(yī)用領(lǐng)域適用性廣，潛在市場(chǎng)巨大，有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，產(chǎn)業(yè)化前景良好。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠。該水凝膠采用了與水凝膠基體成分相同的透明質(zhì)酸微米微球作為增強(qiáng)顆粒，通過(guò)構(gòu)建增強(qiáng)顆粒與基體之間的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)來(lái)制備自增強(qiáng)的雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠，以達(dá)到增強(qiáng)和控制釋放生物活性分子的目的。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的制備方法。該制備方法制備工藝簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，適合批量生產(chǎn)。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的制備方法，包括以下操作步驟(I)雙鍵活化的透明質(zhì)酸的制備配制透明質(zhì)酸水溶液，在磁力攪拌條件下，加入摩爾量相當(dāng)于透明質(zhì)酸的所有輕基摩爾量的20%的三乙胺,反應(yīng)Ih后,加入摩爾量相當(dāng)于透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾量的20%的四丁基溴化銨，反應(yīng)Ih后，加入摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羧基摩爾量的10 100倍的甲基丙烯酸縮水甘油酯，20 30°C反應(yīng)2d，60°C保溫lh，然后依次在的氯化鈉溶液和去離子水中分別透析，最后干燥，得到雙鍵活化的透明質(zhì)酸；(2)透明質(zhì)酸微球的制備將水相溶液與油相溶液按體積1:14 1:56混合，渦旋至澄清，隨后加入摩爾量為透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元上羧基的摩爾量O. 5 15倍的二乙烯基砜交聯(lián)劑，渦旋混合后磁攪拌反應(yīng)，最后將反應(yīng)液在丙酮中沉淀，并依次用丙酮、乙醇、水、乙醇和丙酮洗滌，干燥，得到透明質(zhì)酸微球；(3)雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球的制備將透明質(zhì)酸微球用去離子水配制成微球懸液，在磁力攪拌下，依次加入摩爾量相當(dāng)于透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾量的20%的三乙胺，反應(yīng)Ih后加入摩爾量相當(dāng)于透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾量的20%的四丁基溴化銨，反應(yīng)Ih后，加入摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羧基摩爾量的10 100倍的甲基丙烯酸縮水甘油酯，反應(yīng)2d后，離心，并用丙酮洗滌5次，干燥，得到雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球；(4)自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的制備將步驟(I)得到的雙鍵活化的透明質(zhì)酸溶于去離子水中配置成雙鍵活化的透明質(zhì)酸水溶液，加入步驟(3)制得的雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球，混合均勻后加入光敏劑，使光敏劑在溶液中的質(zhì)量濃度為O. 001g/mL，在15KJ的紫外光下輻射15min，得到水凝膠；所得水凝膠在去離子水中浸泡，去除殘留雜質(zhì)，干燥，得到自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠。步驟(I)中所述的透明質(zhì)酸水溶液是將透明質(zhì)酸加入去離子水中，透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量濃度為O. 002g/mL ;所述的氯化鈉溶液摩爾濃度為O. lmol/L ;所述的透析時(shí)間為7天；所述的干燥為冷凍干燥，時(shí)間為12h 24h。步驟(2)中所述的水相溶液是將透明質(zhì)酸溶解于氫氧化鈉溶液中配置成透明質(zhì)酸水溶液；所述的油相溶液是加有2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉和I-庚醇的異辛烷；所述的磁攬拌反應(yīng)是在IOOOrpm 3000rpm下反應(yīng)IOmin 50min;所述的干燥為常溫真空干燥，時(shí)間為24h 48h。所述氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為O. 2mol/L，透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量濃度為
O.004g/mL ；所述的2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉在油相溶液中的摩爾濃度為O. 2mol/L, I-庚醇在油相溶液中的摩爾濃度為O. 04mol/L。步驟(3)中所述的微球懸液的質(zhì)量濃度為O. 002g/mL ;所述的離心是在8000rpm 20000rpm下離心IOmin 30min ;所述的干燥為常溫真空干燥，時(shí)間為24h 48h ;所述雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球的直徑大小為I μ m 10 μ m。更加優(yōu)選的，所述雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球的直徑大小為I μ m 2 μ m。步驟(4)中所述的雙鍵活化的透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量濃度為O. 03g/mL;所述的雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球與雙鍵活化的透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量比為1:1; 所述的光敏劑為2-羥基-4' -(2-羥乙氧基)-2_甲基苯丙酮、2_氧化戊二酸或I-羥基環(huán)己基苯基丙酮；所述的在去離子水中浸泡的時(shí)間為Id 4d ;所述的干燥為常溫真空干燥，時(shí)間為24h 48h?！N由上述的制備方法制備得到的自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠，該水凝膠具有雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，所述水凝膠的孔徑大小為10 μ m 70 μ m ;雙鍵取代度為2. 8% 65%。更加優(yōu)選的，所述水凝膠的孔徑大小為10 μ m 30 μ m ;雙鍵取代度為32. 86%。本發(fā)明的原理在于本發(fā)明的出發(fā)點(diǎn)是透明質(zhì)酸水凝膠具有內(nèi)在的生物相容性、高吸水性、可注射性以及與天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似等優(yōu)異性質(zhì)，近年來(lái)在生物醫(yī)用領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。但傳統(tǒng)的透明質(zhì)酸水凝膠是由透明質(zhì)酸大分子無(wú)規(guī)交聯(lián)形成的本體膠，存在力學(xué)性能低、不能對(duì)生物活性分子進(jìn)行控制釋放等缺點(diǎn)，在組織工程應(yīng)用中受到了很大的限制。為此，本發(fā)明采用與水凝膠基體成分相同的的透明質(zhì)酸微米微球作為增強(qiáng)顆粒，通過(guò)構(gòu)建增強(qiáng)顆粒與基體之間的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)來(lái)制備自增強(qiáng)的雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠，以達(dá)到增強(qiáng)和控制釋放生物活性分子的目的。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明方法制備的自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠，是通過(guò)將表面具有活性雙鍵的透明質(zhì)酸微球作為增強(qiáng)顆粒與雙鍵活化的透明質(zhì)酸分子反應(yīng)制。水凝膠具有雙交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過(guò)控制微球內(nèi)部的交聯(lián)密度以及微球與基體之間的交聯(lián)密度，既可以實(shí)現(xiàn)透明質(zhì)酸水凝的自增強(qiáng)，提高力學(xué)性能，又能對(duì)生物活性分子進(jìn)行控制釋放，有利于軟組織的再生修復(fù)，具有良好的應(yīng)用前景。


圖I是實(shí)施例I所得的雙鍵活化的透明質(zhì)酸的核磁共振氫譜圖。圖2是實(shí)施例I所得的透明質(zhì)酸微球在掃描電鏡下的形貌圖。圖3是實(shí)施例I所得的一次交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠在掃描電鏡下的形貌圖。圖4是實(shí)施例I所得的雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠在掃描電鏡下的形貌。圖5是實(shí)施例I所得的雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠在掃描電鏡下的形貌圖(圖4的放大圖)。圖6是實(shí)施例I所得的一次交聯(lián)水凝膠和雙交聯(lián)水凝膠的壓縮性能對(duì)比圖。圖7是實(shí)施例I所得的一次交聯(lián)水凝膠和雙交聯(lián)水凝膠的流變曲線對(duì)比圖。圖8是實(shí)施例I所得的一次交聯(lián)水凝膠和雙交聯(lián)水凝膠對(duì)牛血清白蛋白的控制釋放曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例I :(I)將透明質(zhì)酸加入去離子水中，配置質(zhì)量濃度為O. 002g/mL的透明質(zhì)酸水溶液。在磁力攪拌下，加入三乙胺(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后加入四丁基溴化銨(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后，向體系中加入甲基丙烯酸縮水甘油酯(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的羧基摩爾數(shù)的50倍)，20°C下反應(yīng)2d后，60°C下保溫lh，然后依次在摩爾濃度為O. lmol/L的氯化鈉溶液和去離子水中分別透析7d，最后冷凍干燥16h，得到雙鍵取代度為32. 86%的雙鍵活化透明質(zhì)酸。如圖I所示為透明質(zhì)酸和雙鍵活化的透明質(zhì)酸的1H NMR譜圖。如圖I中A譜線所示，透明質(zhì)酸的各質(zhì)子峰歸屬如下1. 9ppm(C0CH3，Hd)，3. 3 3. 9ppm(H_2, 3，4，5,6),4.4- 4. 6ppm(H-I)。 雙鍵活化的透明質(zhì)酸在6. 1,5. 6和I. 85ppm處均出現(xiàn)了新的共振吸收峰,分別對(duì)應(yīng)于甲基丙烯酸縮水甘油酯的CH2=C的Hb和H。以及C-CH3的Ha(圖I中B譜線)，由此說(shuō)明甲基丙烯酸縮水甘油酯已成功鍵合到透明質(zhì)酸分子鏈上。(2)將透明質(zhì)酸溶解于O. 2mol/L氫氧化鈉溶液中配置成質(zhì)量濃度為O. 004g/mL的透明質(zhì)酸水溶液，作為水相溶液。在異辛烷中分別加入摩爾濃度為O. 2mol/L的2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉和摩爾濃度為O. 04mol/L的I-庚醇，制備成有機(jī)相溶液。然后油相溶液和水相溶液按體積比28:1混合，渦旋至澄清，隨后加入二乙烯基砜交聯(lián)劑，二乙烯基砜與透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元上羧基的摩爾比為6,渦旋混合后3000rpm磁攪拌反應(yīng)lOmin。最后將反應(yīng)液在丙酮中沉淀，并依次用丙酮、乙醇、水、乙醇、丙酮洗滌，常溫下真空干燥24h得到透明質(zhì)酸微球，其形態(tài)如圖2所示。從圖中可以看出透明質(zhì)酸微球表面光滑，直徑大小為I
2μ m，分布均勻。將制得的透明質(zhì)酸微球用去離子水配置成質(zhì)量濃度為O. 002g/mL的微球懸液。磁力攪拌下依次加入三乙胺(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后加入四丁基溴化銨(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后再加入50倍于羧基摩爾數(shù)的甲基丙烯酸縮水甘油酯，反應(yīng)2d后20000rpm下離心IOmin,并用丙酮洗滌5次，常溫下真空干燥24h得到表面雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球，直徑大小為I 2 μ m。(3)將(I)步驟得到的雙鍵活化透明質(zhì)酸溶于去離子水中配置成質(zhì)量濃度為
O.03g/mL的透明質(zhì)酸水溶液，加入(2)步驟制得的雙鍵活化透明質(zhì)酸微球(微球與透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為1:1)，混合均勻后加入光敏劑I-羥基環(huán)己基苯基丙酮，使其質(zhì)量濃度為
O.001g/mL，在15KJ的紫外光下輻射15min制得雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠。所得水凝膠在去離子水中浸泡2d去除殘留雜質(zhì)，常溫真空干燥48h，得到自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠。作為參照對(duì)比，不加入透明質(zhì)酸微球，由濃度為O. 06g/mL的雙鍵活化透明質(zhì)酸水溶液在其他相同條件下制得的水凝膠為一次交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠。—次交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的斷面掃描電鏡形貌照片如圖3所示。從圖中可看出水凝膠的截面呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小為10 100 μ m。雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠斷面掃描電鏡形貌照片如圖4和圖5 (圖4的放大圖)所示。從圖中可看出，雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的孔徑大小均勻，孔徑10 30μπι，在水凝膠的網(wǎng)孔中均勻的分布著透明質(zhì)酸微球，且微球表面與基體之間具有明顯的共價(jià)鍵連接，說(shuō)明微球中的雙鍵與透明質(zhì)酸基體的雙鍵在紫外光照下發(fā)生了交聯(lián)作用，形成具有雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠體系。壓縮性能測(cè)試如圖6所示，由圖可見(jiàn)，雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的壓縮模量比一次交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠約提高一倍，說(shuō)明雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠能夠起到自增強(qiáng)的作用。低頻(O. I IOHz)下的流變學(xué)性能如圖7所示，從圖中可以看出雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的儲(chǔ)存模量G'和損耗模量G"均明顯高于一次交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠，說(shuō)明雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠具有更好的粘彈性。通過(guò)對(duì)牛血清白蛋白進(jìn)行負(fù)載釋放的試驗(yàn)研究，得到的釋放曲線圖如圖8所示。從圖中可看出，雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠與一次交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠相比，在牛血清白蛋白的釋放前期能更好的避免爆釋現(xiàn)象的發(fā)生，且在整個(gè)釋放期間表現(xiàn)出慢得多的釋放速度，說(shuō)明雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠能較好地延長(zhǎng)對(duì)牛血清白蛋白的持續(xù)控制釋放時(shí)間。實(shí)施例2
(I)將透明質(zhì)酸加入去離子水中，配置質(zhì)量濃度為O. 002g/mL的透明質(zhì)酸水溶液。 在磁力攪拌下，加入三乙胺(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后加入四丁基溴化銨(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后，向體系中加入甲基丙烯酸縮水甘油酯(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的羧基摩爾數(shù)的10倍)，30°C下反應(yīng)2d后，60°C下保溫lh，然后依次在摩爾濃度為O. lmol/L的氯化鈉溶液和去離子水中分別透析7d，最后冷凍干燥12h，得到雙鍵取代度為2. 8%的雙鍵活化透明質(zhì)酸。(2)將透明質(zhì)酸溶解于O. 2mol/L氫氧化鈉溶液中配置成質(zhì)量濃度為O. 004g/mL的透明質(zhì)酸水溶液，作為水相溶液。在異辛烷中分別加入質(zhì)量濃度為O. 2mol/L的2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉和質(zhì)量濃度為O. 04mol/L的I-庚醇，制備成有機(jī)相溶液。然后油相溶液和水相溶液按體積比14:1混合，渦旋至澄清，隨后加入二乙烯基砜交聯(lián)劑，二乙烯基砜與透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元上羧基的摩爾比為O. 5,潤(rùn)旋混合后2000rpm磁攪拌反應(yīng)30min。最后將反應(yīng)液在過(guò)量丙酮中沉淀，并依次用丙酮、乙醇、水、乙醇、丙酮洗滌，常溫下真空干燥36h得到透明質(zhì)酸微球，直徑大小為2 5μπι。將制得的透明質(zhì)酸微球用去離子水配置成質(zhì)量濃度為O. 002g/mL的微球懸液。磁力攪拌下依次加入三乙胺(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后加入四丁基溴化銨(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后再加入10倍于羧基摩爾數(shù)的甲基丙烯酸縮水甘油酯，反應(yīng)2d后SOOOrpm下離心30min，并用丙酮洗滌5次，常溫下真空干燥36h得到表面雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球，直徑大小為2 5μηι。(3)將(I)步驟得到的雙鍵活化透明質(zhì)酸溶于去離子水中配置成質(zhì)量濃度為
O.03g/mL的透明質(zhì)酸水溶液，加入(2)步驟制得的雙鍵活化透明質(zhì)酸微球(微球與透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為I: I )，混合均勻后加入光敏劑2-羥基-4' - (2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮，使其質(zhì)量濃度為O. 001g/mL，在15KJ的紫外光下輻射15min制得雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠。所得水凝膠在去離子水中浸泡Id去除殘留雜質(zhì)，常溫真空干燥36h，得到自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠，孔徑50 70 μ m。實(shí)施例3 (I)將透明質(zhì)酸加入去離子水中，配置質(zhì)量濃度為O. 002g/mL的透明質(zhì)酸水溶液。在磁力攪拌下，加入三乙胺(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后加入四丁基溴化銨(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后，向體系中加入甲基丙烯酸縮水甘油酯(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的羧基摩爾數(shù)的100倍)，25°C下反應(yīng)2d后，60°C下保溫lh，然后依次在摩爾濃度為O. lmol/L的氯化鈉溶液和去離子水中分別透析7d，最后冷凍干燥24h，得到雙鍵取代度為65. 0%的雙鍵活化透明質(zhì)酸。(2)將透明質(zhì)酸溶解于O. 2mol/L氫氧化鈉溶液中配置成質(zhì)量濃度為O. 004g/mL的透明質(zhì)酸水溶液，作為水相溶液。在異辛烷中分別加入質(zhì)量濃度為O. 2mol/L的2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉和質(zhì)量濃度為O. 04mol/L的I-庚醇，制備成有機(jī)相溶液。然后油相溶液和水相溶液按體積比56:1混合，渦旋至澄清，隨后加入二乙烯基砜交聯(lián)劑，二乙烯基砜與透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元上羧基的摩爾比為15,潤(rùn)旋混合后IOOOrpm磁攪拌反應(yīng)50min。最后將反應(yīng)液在過(guò)量丙酮中沉淀，并依次用丙酮、乙醇、水、乙醇、丙酮洗滌，常溫下真空干燥48h得到透明質(zhì)酸微球，直徑大小為5 10 μ m。將制得的透明質(zhì)酸微球用去離子水配置成質(zhì)量濃度為O. 002g/mL的微球懸液。磁力攪拌下依次加入三乙胺(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后加入四丁基溴化銨(加入的摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾數(shù)的20%)，反應(yīng)Ih后再加入100倍于羧基摩爾數(shù)的甲基丙烯酸縮水甘油酯，反應(yīng)
2d后12000rpm下離心20min,并用丙酮洗漆5次,常溫下真空干燥48h得到表面雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球，直徑大小為5 ΙΟμπι。(3)將(I)步驟得到的雙鍵活化透明質(zhì)酸溶于去離子水中配置成質(zhì)量濃度為
O.03g/mL的透明質(zhì)酸水溶液，加入(2)步驟制得的雙鍵活化透明質(zhì)酸微球(微球與透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為1:1)，混合均勻后加入光敏劑2-氧化戊二酸，使其質(zhì)量濃度為O. 001g/mL,在15KJ的紫外光下輻射15min制得雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠。所得水凝膠在去離子水中浸泡4d去除殘留雜質(zhì)，常溫真空干燥24h，得到自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠，孔徑30 50 μ m。其中，透明質(zhì)酸購(gòu)買(mǎi)于阿拉丁試劑(上海)有限公司；三乙胺、甲基丙烯酸縮水甘油酯、四丁基溴化銨、2-羥基-4' -(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-氧化戊二酸、I-羥基環(huán)己基苯基丙酮、2-乙基己基琥拍酸酯磺酸鈉購(gòu)買(mǎi)于sigma-aldrich公司；其中異辛燒、1_庚醇購(gòu)買(mǎi)于天津化學(xué)試劑公司；二乙烯基砜購(gòu)買(mǎi)于北京化學(xué)試劑公司。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟 (1)雙鍵活化的透明質(zhì)酸的制備配制透明質(zhì)酸水溶液，在磁力攪拌條件下，加入摩爾量相當(dāng)于透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾量的20%的三乙胺，反應(yīng)Ih后，加入摩爾量相當(dāng)于透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾量的20%的四丁基溴化銨，反應(yīng)Ih后，加入摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羧基摩爾量的10 100倍的甲基丙烯酸縮水甘油酯，20 30°C反應(yīng)2d，60°C保溫lh，然后依次在的氯化鈉溶液和去離子水中分別透析，最后干燥，得到雙鍵活化的透明質(zhì)酸； (2)透明質(zhì)酸微球的制備將水相溶液與油相溶液按體積1:14 1:56混合，渦旋至澄清，隨后加入摩爾量為透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)單元上羧基的摩爾量O. 5 15倍的二乙烯基砜交聯(lián)齊U，渦旋混合后磁攪拌反應(yīng)，最后將反應(yīng)液在丙酮中沉淀，并依次用丙酮、乙醇、水、乙醇和丙酮洗滌，干燥，得到透明質(zhì)酸微球； (3 )雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球的制備將透明質(zhì)酸微球用去離子水配制成微球懸液，在磁力攪拌下，依次加入摩爾量相當(dāng)于透明質(zhì)酸的所有輕基摩爾量的20%的三乙胺，反應(yīng)Ih后加入摩爾量相當(dāng)于透明質(zhì)酸的所有羥基摩爾量的20%的四丁基溴化銨，反應(yīng)Ih后，加入摩爾量為透明質(zhì)酸的所有羧基摩爾量的10 100倍的甲基丙烯酸縮水甘油酯，反應(yīng)2d后，離心，并用丙酮洗滌5次，干燥，得到雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球； (4)自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的制備將步驟(I)得到的雙鍵活化的透明質(zhì)酸溶于去離子水中配置成雙鍵活化的透明質(zhì)酸水溶液，加入步驟(3)制得的雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球，混合均勻后加入光敏劑，使光敏劑在溶液中的質(zhì)量濃度為O. 001g/mL，在15KJ的紫外光下輻射15min，得到水凝膠；所得水凝膠在去離子水中浸泡，去除殘留雜質(zhì)，干燥，得到自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的透明質(zhì)酸水溶液是將透明質(zhì)酸加入去離子水中，透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量濃度為O. 002g/mL ;所述的氯化鈉溶液摩爾濃度為O. lmol/L ;所述的透析時(shí)間為7天；所述的干燥為冷凍干燥，時(shí)間為12h 24h。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的水相溶液是將透明質(zhì)酸溶解于氫氧化鈉溶液中配置成透明質(zhì)酸水溶液； 所述的油相溶液是加有2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉和I-庚醇的異辛烷； 所述的磁攪拌反應(yīng)是在IOOOrpm 3000rpm下反應(yīng)IOmin 50min; 所述的干燥為常溫真空干燥，時(shí)間為24h 48h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為O. 2mol/L，透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量濃度為O. 004g/mL ； 所述的2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉在油相溶液中的摩爾濃度為O. 2mol/L，l-庚醇在油相溶液中的摩爾濃度為O. 04mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的微球懸液的質(zhì)量濃度為O. 002g/mL ;所述的離心是在8000rpm 20000rpm下離心IOmin 30min ;所述的干燥為常溫真空干燥，時(shí)間為24h 48h ;所述雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球的直徑大小為I μ m 10 μ m0
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球的直徑大小為I μ m 2 μ m0
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述的雙鍵活化的透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量濃度為O. 03g/mL; 所述的雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球與雙鍵活化的透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量比為1:1 ; 所述的光敏劑為2-羥基-4' - (2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-氧化戊二酸或I-羥基環(huán)己基苯基丙酮； 所述的在去離子水中浸泡的時(shí)間為Id 4d ; 所述的干燥為常溫真空干燥，時(shí)間為24h 48h。
8.一種由權(quán)利要求I 7任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠，其特征在于該水凝膠具有雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，所述水凝膠的孔徑大小為ΙΟμπι 70 μ m ;雙鍵取代度為2. 8% 65%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠，其特征在于所述水凝膠的孔徑大小為10 μ m 30 μ m ;雙鍵取代度為32. 86%。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠及其制備方法。制備方法分為以下步驟雙鍵活化的透明質(zhì)酸制備、透明質(zhì)酸微球制備、雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球的制備、自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的制備。通過(guò)該制備方法制備得到的自增強(qiáng)雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠由雙肩活化的透明質(zhì)酸微球作為增強(qiáng)顆粒與雙鍵活化的透明質(zhì)酸分子反應(yīng)制得，具有雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。其中，雙鍵活化的透明質(zhì)酸微球的直徑大小為1μm～10μm，雙交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的孔徑大小為10μm～70μm；雙鍵取代度為2.8%～65%。與一次性交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠相比，其膠彈性能良好，而且較好地延長(zhǎng)對(duì)牛血清白蛋白的持續(xù)控制釋放時(shí)間。
文檔編號(hào)C08J3/24GK102942699SQ20121042210
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月26日
發(fā)明者趙劍豪, 羅春紅, 屠美, 曾戎, 容建華 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)