專利名稱：可遞送內(nèi)皮抑制激素的膠原基復合角膜替代物的制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于組織工程領域，更加具體地說，涉及一種可遞送內(nèi)皮抑制激素的膠原分子與甲基丙烯酸甘油酯化精氨酸(Glycidyl Methacrylated Arginine, GMAA)聚合物網(wǎng)絡復合的半互穿網(wǎng)絡凝膠的制備方法，此多功能凝膠將組織工程與基因轉(zhuǎn)染用于治療眼科相關疾病，可作為潛在的角膜替代物。
背景技術：
全球約一千萬人承受由角膜損傷導致的失明所帶來的痛苦。角膜損傷一般由角膜疾病或者外界的物理、化學傷害引起，已成為世界范圍內(nèi)僅次于白內(nèi)障的第二大致盲因素。目前，由角膜捐獻者所提供的同種異體角膜移植手術是針對不可恢復性角膜損傷的一種比 較被廣泛接受的治療手段。盡管其手術成功率較高，但是大多數(shù)國家尤其是發(fā)展中國家的每年的角膜供體數(shù)量難以滿足移植需要，而且對于角膜感染和角膜新生血管化嚴重的患者來說，角膜移植手術后的愈合情況較差，移植失敗率高。鑒于此，開發(fā)能夠替代同種異體角膜移植的方法，研制新型的角膜替代物顯得刻不容緩。自1859年將一片玻璃植入病人眼內(nèi)首次提出了人工角膜的概念至今，多種由合成材料制成的人工角膜面世并成功應用于臨床試驗，但人工角膜移植引發(fā)的一些晚期并發(fā)癥等嚴重制約了其臨床應用，僅適用于常規(guī)角膜移植失敗的雙眼角膜混濁性失明患者。時至今日，人工角膜材料仍然不能完全替代角膜組織。隨著組織工程技術的興起和材料科學的發(fā)展，國內(nèi)外眾多研究者開始致力于組織工程角膜的研究。其特點是生物相容性良好，可在生物體內(nèi)降解，促進細胞的生長分化從而實現(xiàn)角膜組織的再生和自我修復。其類型主要包括①在體外構(gòu)建類似于角膜組織結(jié)構(gòu)的材料并移植；②將負載種子細胞的支架材料移植，支架材料在動物體內(nèi)的降解過程中完成角膜組織修復；③移植可促進組織再生修復的無細胞材料三種。無論以何種方式來構(gòu)建角膜替代物，其首要原則就是盡量多地復制天然生物體角膜的特性。同時，針對角膜移植手術后復雜的眼部病理環(huán)境，如何構(gòu)建出一種集促進角膜組織再生修復和治療于一身的多功能角膜替代物已成為研究工作的重點。骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)來源于骨髓基質(zhì)，具有多向分化潛能，可以在特定的誘導條件下向成骨、神經(jīng)和心肌等多種細胞分化。MSCs應用于角膜組織工程的研究日漸增多，將MSCs接種到羊膜支架材料上，體外培養(yǎng)后移植到角膜基質(zhì)并誘導其向角膜上皮細胞分化，最終可檢測到角膜上皮細胞標志物的表達。另有研究表明MSCs作為組織工程角膜種子細胞移植后，除了具有重建受損角膜組織的功能外，還有抑制炎癥和角膜新生血管的功效，這使其在角膜組織工程中的應用前景十分良好。目前已有研究和報道的用于構(gòu)建組織工程角膜的生物材料有羊膜、細胞外基質(zhì)材料(主要包括膠原、異種脫細胞角膜基質(zhì)、纖維蛋白、蠶絲蛋白等)和天然高分子材料(主要包括殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽等)。這些材料的生物相容性良好，利于細胞的粘附和繁殖，降解產(chǎn)物能被機體吸收，但降解速率不可控，強度和加工性能較差。Griffith等成功制備出了一系列的膠原基聚合物互穿網(wǎng)絡(IPN)角膜替代物，向膠原中引入的網(wǎng)絡包括聚兩性電解質(zhì)、溫敏性聚合物、聚乙二醇和多糖等。其中膠原/磷酸膽堿聚合物角膜替代物(Collagen/MPC)對小型豬進行了深度角膜板層移植，術后一年顯示了上皮細胞的重建，伴隨基質(zhì)細胞的長入，且觀察到角膜神經(jīng)的再生。在Collagen/MPC角膜替代物用于堿燒傷后的兔子角膜移植中，此材料不僅支持角膜細胞的生長繁殖以及組織重建，還顯示了其抑制角膜新生血管化的能力。正常角膜透明無血管，角膜新生血管形成是角膜化學燒傷、角膜炎、角膜移植排斥反應等疾病帶來的一個難題。盡管角膜新生血管的生長有利于病原微生物的清除和組織修復，但嚴重影響角膜的透明性，是造成角膜移植失敗的原因之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可遞送內(nèi)皮抑制激素的膠原基復合角膜替代物的制備方法和應用。該角膜替代物具備良好的力學性能、光學性能，在膠原酶中降解緩慢，且與 人眼組織有良好的生物相容性。通過在凝膠表面接種骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)并轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑制素基因，可將組織工程與基因轉(zhuǎn)染用于眼科，制備方法簡單，可以長期保存和運輸。本發(fā)明的目的通過下述技術方案予以實現(xiàn)本發(fā)明提供一種膠原基復合角膜替代物，以膠原、GMAA為原料，以水為溶劑，以碳二亞胺(EDC)為交聯(lián)劑對膠原進行交聯(lián)，以光引發(fā)劑引發(fā)GMAA進行聚合反應，同時GMAA分子結(jié)構(gòu)上的官能基團還可與膠原分子發(fā)生交聯(lián)反應，由此將反應產(chǎn)物經(jīng)過澆注成膜制備成膠原/GMAA半互穿聚合物網(wǎng)絡角膜替代物。其中EDC與膠原(以膠原分子上氨基數(shù)目計，表示為Coll-NH2)的摩爾比為1:(I一 1.2) ;EDC與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:1 ;光引發(fā)劑與GMAA的摩爾比為(O. 02—0. 03) 1 ;膠原(以膠原分子上氨基數(shù)目計，表示為Coll-NH2)與GMAA的質(zhì)量比為I (0. 5—1)。所述光引發(fā)劑選用I 一 [4 一(2—輕乙氧基)一亞苯基]一 2 —輕基一 2' , 2' 一二甲基乙酮(Irgacure 2959),也可選用甲基乙烯基酮、安息香。所述膠原可選用豬I型膠原，所述GMAA為甲基丙烯酸甘油化的精氨酸單體，將精氨酸分子和甲基丙烯酸甘油酯化制備而成(參考文獻Jianshu Li, ZhizhangGuo, Jianyu Xin, Guanglei Zhao, Huining Xiao. 21-Arm star polymers with differentcationic groups based oncyclodextrin core for DNA delivery. CarbohydratePolymers, 2010，79，277-283.)，結(jié)構(gòu)如下
權(quán)利要求
1.一種膠原基復合角膜替代物，其特征在于，以膠原、GMAA為原料，以水為溶劑，以碳二亞胺(EDC)為交聯(lián)劑對膠原進行交聯(lián)，以光引發(fā)劑引發(fā)GMAA進行聚合反應，同時GMAA分子結(jié)構(gòu)上的官能基團還可與膠原分子發(fā)生交聯(lián)反應，由此將反應產(chǎn)物經(jīng)過澆注成膜制備成膠原/GMAA半互穿聚合物網(wǎng)絡角膜替代物 其中EDC與膠原(以膠原分子上氨基數(shù)目計，表示為Coll-NH2)的摩爾比為1:(1一1.2) ;EDC與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的摩爾比為1:1 ;光引發(fā)劑與GMAA的摩爾比為(O. 02—0. 03) 1 ;膠原(以膠原分子上氨基數(shù)目計，表示為Coll-NH2)與GMAA的質(zhì)量比為I (0. 5—1)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠原基復合角膜替代物，其特征在于，所述光引發(fā)劑選用I — [4 — (2 —輕乙氧基)一亞苯基]—2 —輕基一2' , 2' -二甲基乙麗(Irgacure2959)、甲基乙烯基酮或者安息香中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膠原基復合角膜替代物，其特征在于，所述膠原可選用豬I型膠原，所述GMAA為甲基丙烯酸甘油化的精氨酸單體，將精氨酸分子和甲基丙烯酸甘油酯化制備而成，結(jié)構(gòu)如下
4.一種膠原基復合角膜替代物的制備方法，其特征在于，先將膠原、甲基丙烯酸甘油化的精氨酸單體、碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、光引發(fā)劑按照計量在溶劑水中混合均勻，然后調(diào)整體系PH值為5-6，將混合反應溶液澆注到模具內(nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化30-40min，取出后保持濕度100%的條件下，室溫20-25攝氏度反應至少12h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化至少5h，經(jīng)清洗即可得到膠原基復合角膜替代物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種膠原基復合角膜替代物的制備方法，其特征在于，其中碳二亞胺與膠原(以膠原分子上氨基數(shù)目計，表示為Coll-NH2)的摩爾比為1:(1 一1. 2);碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1:1 ;光引發(fā)劑與甲基丙烯酸甘油化的精氨酸單體的摩爾比為(O. 02 — O. 03):1;膠原(以膠原分子上氨基數(shù)目計，表示為Coll-NH2)與甲基丙烯酸甘油化的精氨酸單體的質(zhì)量比為1:(0. 5— I)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種膠原基復合角膜替代物的制備方法，其特征在于，優(yōu)選調(diào)整體系pH值為5. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種膠原基復合角膜替代物的制備方法，其特征在于，待從紫外固化箱中取出后，保持濕度100%的條件下，室溫20— 25攝氏度反應優(yōu)選12 — 16h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化至少5h，然后去除夾具，打開模具取出角膜樣品放入pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有1被％氯仿的PH = 7.4的PBS中，于4°C下保存?zhèn)溆谩?br> 8.可得到可遞送內(nèi)皮抑制激素的膠原基復合角膜替代物的制備方法，其特征在于，利用如權(quán)利要求1所述的膠原基復合角膜替代物，將其作為細胞培養(yǎng)基板向其表面接種骨髓間充質(zhì)干細胞MSCs，待其融合率到達90%后進行由商業(yè)化轉(zhuǎn)染試劑Polyjet 介導的內(nèi)皮抑制素基因轉(zhuǎn)染后，即可得到可遞送內(nèi)皮抑制激素的膠原基復合角膜替代物。
9.如權(quán)利要求1所述的膠原基復合角膜替代物在制造治療眼科相關疾病的藥物中的應用，可實現(xiàn)延緩替代物的降解和特定治療因子的原位釋放。
全文摘要
本發(fā)明公開一種可遞送內(nèi)皮抑制激素的膠原基復合角膜替代物的制備方法和應用。它由向接種在膠原/GMAA聚合物半互穿網(wǎng)絡角膜替代物表面的MSCs轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑制素基因制備而成。此膠原基角膜替代物具有良好的生物相容性，可誘導和促進角膜再生，并隨角膜再生而生物降解；該角膜替代物具備良好的力學和光學性能，且與人眼組織有良好的生物相容性，聚合物網(wǎng)絡的引入提高角膜替代物在膠原酶中的穩(wěn)定性及力學強度。通過在角膜替代物表面接種骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)并轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑制素基因，可在兩周內(nèi)持續(xù)檢測到培養(yǎng)基中的內(nèi)皮抑制素蛋白。該角膜替代物將基因轉(zhuǎn)染與組織工程有效結(jié)合并用于眼科，制作方法簡單，易于加工處理和長期保存及運輸。
文檔編號C08J3/24GK102989038SQ20121043589
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者劉文廣, 劉源, 楊建海, 王宏博 申請人:天津大學