專利名稱：從桑葉中連續(xù)提取分離多糖及 1-脫氧野尻霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從天然產(chǎn)物中提取有效活性成分及中藥現(xiàn)代化領(lǐng)域，具體地說是一種從桑葉中連續(xù)提取分離多糖及I-脫氧野尻霉素(化學(xué)名稱(2R，3R，4R，5S)_ 3，4，5-三羥基-2-羥甲基四氫哌啶)的方法。
背景技術(shù)：
桑葉，是?？?Moraceae)植物桑(Morus alba L.)的葉子，自古以來就是中醫(yī)臨床中常用的中藥材，最早記載見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，后在《本草拾遺》、《本草經(jīng)疏》、《本草綱目》、《中草藥手冊》和《中藥大辭典》中都有記錄。近年來，現(xiàn)代藥理學(xué)的研究也充分證明了桑葉具有降血糖、降血壓、抗衰老及抑制癌細胞等作用。1993年我國衛(wèi)生部公布桑葉為藥食兩用品，而在《中華人民共和國藥典》2010年版中也收錄桑葉主治風(fēng)熱感冒，肺熱燥咳，頭暈 頭痛，目赤昏花。有關(guān)桑葉化學(xué)成分的研究結(jié)果表明，桑葉中含有多種有效成分，而其藥理生理作用主要由其生物堿及多糖類化合物產(chǎn)生。桑葉中含有的生物堿類化合物主要為I-脫氧野尻霉素(I-DNJ)，一種糖苷酶抑制劑，是桑葉獨有的生物堿。藥理研究證實，桑葉中的I-DNJ具有抑制雙糖分解酶活性的作用從而抑制小腸對雙糖的吸收，降低食后血糖的高峰值達到降血糖的效果。目前，I-DNJ及其衍生物已用于糖尿病人的治療。桑葉中的多糖類化合物種類較多，是近年來在桑葉中發(fā)現(xiàn)的又一活性成分，具有增強免疫、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等功能，可開發(fā)成一些老年性疾病的重要治療藥品和功能型食品。目前，有關(guān)桑葉中有效成份或有效部位的分離已有一些相關(guān)專利。CN101671294公開了一種將陽離子交換樹脂和大孔樹脂串聯(lián)分離I-脫氧野尻霉素的方法，提取物中I-DNJ含量僅為10 15% ；CN 100556892公開了一種采用酸化溶劑從桑葉中提取1_脫氧野尻霉素的方法，提取物含量低于15% ；CN 101314586公開了一種從桑葉總生物堿中分離
I-脫氧野尻霉素單體的方法，生物堿有效部位經(jīng)反復(fù)重結(jié)晶可獲得純度高的I-脫氧野尻霉素單體，方法更注重于產(chǎn)品的純化；CN 101712726公開了一種高純度桑葉多糖的制備方法，含量在60%以上；CN 101412703公開了一種聯(lián)產(chǎn)桑葉黃酮、多糖和生物堿的復(fù)合提取工藝，以大孔樹脂及陽離子交換樹脂純化，所得的提取物多糖含量約60%，生物堿DNJ含量約 50%。上述專利獲得的產(chǎn)品含量均較低，且多注重于一種有效成分或有效部位的分離或純化過程。桑葉中具有降血糖作用的主要成份多糖及I-脫氧野尻霉素均為極性較大的化合物，其提取率與組分在提取液中的溶解狀態(tài)及分散狀態(tài)有關(guān)，溶解性和分散性越好提取率越高。而桑葉作為一種植物類天然產(chǎn)物，除極性較大的有效成分外，仍富含大量諸如葉綠素等在內(nèi)的低極性脂溶性雜質(zhì)。低極性脂溶性雜質(zhì)的存在，一方面給多糖及I-脫氧野尻霉素的提取產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致產(chǎn)品得率及純度較低；另一方面低級性脂溶性雜質(zhì)的殘留也影響了最終產(chǎn)品的外觀色澤等品質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)降低。因此，在桑葉降血糖產(chǎn)品的分離和純化過程中，對桑葉藥材進行預(yù)處理以去除其中的低級性脂溶性雜質(zhì)的過程必不可少。目前，在桑葉降血糖有效成分提取前，對桑葉進行預(yù)處理以去除脂溶性雜質(zhì)而提高多糖及I-脫氧野尻霉素提取率的研究尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，而提供一種從桑葉中連續(xù)提取分離多糖及I-脫氧野尻霉素的方法該方法包括以下順序的步驟
a、將桑葉粉碎成粗粉置萃取釜中，在壓力為10 40Mpa，萃取溫度為30 60°C，萃取時間60 120分鐘，CO2流速為20 50L/h條件下，進行超臨界CO2萃取，卸壓，CO2放空后收集桑葉渣；
b、桑葉渣干燥后，以40 80%的乙醇加熱回流提取，料液比I:10 15，60 100°C提取2次，合并提取液；
C、提取液濃縮至1/5 1/4，加入乙醇至乙醇比例為75% 95%，以95%為最優(yōu)，加入乙醇至上述比例，靜置，析出沉淀，干燥即得含量為60% 80%的多糖類化合物；
d、上清液濃縮，通過陽離子交換樹脂，活性成分被吸附于樹脂上；
e、用5% 30%的乙醇洗脫樹脂至洗脫液無色，再以去離子水洗脫樹脂至洗脫液無醇味，最后以濃度為O. I I. OmoI/L的氨水洗脫樹脂；
f、氨水洗脫液濃縮，通過反相C18硅膠基層析柱，以含水乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，干燥，即得桑葉生物堿，其中I-脫氧野尻霉素含量80% 86%。另知，加入乙醇濃度為95%。所述的陽離子交換樹脂為732陽離子交換樹脂或001X8型陽離子交換樹脂。所述的反相C18硅膠基層析柱采用YMC-ODS-AQ或YMC-ODS-AA硅膠填料。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點
I.在一定條件下，采用超臨界CCV流體作為萃取劑脫除桑葉中的鞣質(zhì)、油脂及色素等低級性脂溶性雜質(zhì)，超臨界CO2流體對脂溶性雜質(zhì)的溶出率較高，而多糖及I-脫氧野尻霉素由于極性較大仍存留于藥渣中。利用這一方法可降低雜質(zhì)在終產(chǎn)品中的殘留，提高產(chǎn)品的純度、色澤等品質(zhì)，且超臨界CO2流體萃取技術(shù)高效、無污染、無萃取劑殘留。2.在除雜的過程中，超臨界CO2的穿透作用可增加桑葉植物細胞壁的脆性，通透性提高，增強多糖及I-脫氧野尻霉素的溶出性，從而提高提取率。3.本發(fā)明所述的方法中除乙醇外未使用其它有機溶劑，純化過程中所用的離子交換樹脂及層析硅膠均可活化再生，生產(chǎn)成本低，工藝簡單，工藝綠色、無毒且環(huán)保，適于工業(yè)化推廣。


圖I為本發(fā)明從桑葉中連續(xù)提取分離多糖及I-脫氧野尻霉素的方法的工藝流程圖。
具體實施例方式下面列舉4個實施例，對本發(fā)明加以進一步說明，但本發(fā)明不僅限于這些實施例。實施例I將粉碎后的桑葉原料400g加入料筒并置萃取缸,開啟超臨界CO2萃取裝置,萃取溫度40°C、萃取壓力30Mpa下萃取80分鐘，CO2流速30L/h。萃取結(jié)束后，取出料筒，得桑葉渣，干燥后加入65%乙醇4L，料液比為I :10，于80°C下攪拌2h，過濾得濾液。濾渣加入65%乙醇4L重復(fù)提取一次并過濾，合并兩次得到的濾液，濃縮至200mL。濃縮液加95%的乙醇I. 8L，靜置4h，離心分離，收集沉淀，低溫干燥，得淺黃色粉末即為桑葉多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法測定桑葉多糖含量為71%。上清液濃縮約IOOmL,以I. OmL/min的流速流經(jīng)裝有經(jīng)預(yù)處理的732陽離子交換樹脂柱，徑高比為1:8。以30%乙醇沖洗樹脂直至透過液為無色，以去離子水沖洗樹脂直至透過液無乙醇味，最后用O. 25mol/L的氨水以I. 5mL/min的流速洗脫樹脂。收集氨水洗脫液，濃縮至約50mL吸附于YMC-ODS-AA型反相C18硅膠基層析柱，以60%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，干燥得淡黃色固體，經(jīng)高效液相色譜檢測，I-脫氧野尻霉素含量為84%。實施例2 將粉碎后的桑葉原料400g加入料筒并置萃取缸,開啟超臨界CO2萃取裝置,萃取溫度50°C、萃取壓力40Mpa下萃取100分鐘，CO2流速501711。萃取結(jié)束后，取出料筒，得桑葉渣，干燥后加入60%乙醇6L，于80°C下攪拌2h，過濾得濾液。濾渣加入60%乙醇6L重復(fù)提取一次并過濾，合并兩次得到的濾液，濃縮至200mL。濃縮液加95%的乙醇I. 5L，靜置4h，離心分離，收集沉淀，低溫干燥，得淺黃色粉末即為桑葉多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法測定桑葉多糖含量為69%。上清液濃縮約IOOmL,以I. OmL/min的流速流經(jīng)裝有經(jīng)預(yù)處理的001X8陽離子交換樹脂柱，徑高比為1:8。以30%乙醇沖洗樹脂直至透過液為無色，以去離子水沖洗樹脂直至透過液無乙醇味，最后用0. 5mol/L的氨水以I. 5mL/min的流速洗脫樹脂。收集氨水洗脫液，濃縮至約50mL吸附于YMC-ODS-AA型反相C18硅膠基層析柱，以45%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，干燥得淡黃色固體，經(jīng)高效液相色譜檢測，I-脫氧野尻霉素含量為82%。實施例3
將粉碎后的桑葉原料400g加入料筒并置萃取缸,開啟超臨界CO2萃取裝置,萃取溫度35°C、萃取壓力40Mpa下萃取120分鐘，CO2流速401711。萃取結(jié)束后，取出料筒，得桑葉渣，干燥后加入75%乙醇5L，于80°C下攪拌2h，過濾得濾液。濾渣加入75%乙醇5L重復(fù)提取一次并過濾，合并兩次得到的濾液，濃縮至200mL。濃縮液加95%的乙醇I. 6L，靜置4h，離心分離，收集沉淀，低溫干燥，得淺黃色粉末即為桑葉多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法測定桑葉多糖含量為74%。上清液濃縮約IOOmL,以I. OmL/min的流速流經(jīng)裝有經(jīng)預(yù)處理的732陽離子交換樹脂柱，徑高比為1:8。以20%乙醇沖洗樹脂直至透過液為無色，以去離子水沖洗樹脂直至透過液無乙醇味，最后用0. 25mol/L的氨水以I. 5mL/min的流速洗脫樹脂。收集氨水洗脫液，濃縮至約50mL吸附于YMC-ODS-AQ型反相C18硅膠基層析柱，以60%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，干燥得淡黃色固體，經(jīng)高效液相色譜檢測，I-脫氧野尻霉素含量為86%。實施例4
將粉碎后的桑葉原料400g加入料筒并置萃取缸,開啟超臨界CO2萃取裝置,萃取溫度55°C、萃取壓力35Mpa下萃取90分鐘，CO2流速30L/h。萃取結(jié)束后，取出料筒，得桑葉渣，干燥后加入60%乙醇4. 5L,于80°C下攪拌2h，過濾得濾液。濾渣加入60%乙醇4. 5L重復(fù)提取一次并過濾，合并兩次得到的濾液，濃縮至200mL。濃縮液加95%的乙醇I. 8L，靜置4h，離心分離，收集沉淀，低溫干燥，得淺黃色粉末即為桑葉多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法測定桑葉多糖含量為72%。上清液濃縮約IOOmL,以I. OmL/min的流速流經(jīng)裝有經(jīng)預(yù)處理的001X8陽離子交換樹脂柱，徑高比為1:8。以20%乙醇沖洗樹脂直至透過液為無色，以去離子水沖洗樹脂直至透過液無乙醇味，最后用O. 5mol/L的氨水以I. 5mL/min的流速洗脫樹脂。收集氨水洗脫液，濃縮至約50mL吸附于YMC-ODS-AQ型反相C18硅膠基層析柱，以40%乙醇洗脫，收 集洗脫液，濃縮，干燥得淡黃色固體，經(jīng)高效液相色譜檢測，I-脫氧野尻霉素含量為80%。
權(quán)利要求
1.從桑葉中連續(xù)提取分離多糖及I-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于該方法包括以下順序的步驟 a、將桑葉粉碎成粗粉置萃取釜中，在壓力為10 40Mpa，萃取溫度為30 60°C，萃取時間60 120分鐘，CO2流速為20 50L/h條件下，進行超臨界CO2萃取，卸壓，CO2放空后收集桑葉渣； b、桑葉渣干燥后，以40 80%的乙醇加熱回流提取，料液比I:10 15，60 100°C提取2次，合并提取液； C、提取液濃縮至1/5 1/4，加入乙醇至乙醇比例為75% 95%，加入乙醇至上述比例，靜置，析出沉淀，干燥，即得含量為60% 80%的多糖類化合物； d、上清液濃縮，通過陽離子交換樹脂，活性成分被吸附于樹脂上； e、用5% 30%的乙醇洗脫樹脂至洗脫液無色，再以去離子水洗脫樹脂至洗脫液無醇味，最后以濃度為O. I I. OmoI/L的氨水洗脫樹脂； f、氨水洗脫液濃縮，通過反相C18硅膠基層析柱，以含水乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，干燥，即得桑葉生物堿，其中I-脫氧野尻霉素含量80% 86%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的從桑葉中連續(xù)提取分離多糖及I-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于加入乙醇濃度為95%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的從桑葉中連續(xù)提取分離多糖及I-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于陽離子交換樹脂為732陽離子交換樹脂或001X8型陽離子交換樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的從桑葉中連續(xù)提取分離多糖及I-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于洗脫樹脂用氨水的濃度為O. 25mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的從桑葉中連續(xù)提取分離多糖及I-脫氧野尻霉素的方法，其特征在于反相C18硅膠基層析柱采用YMC-ODS-AQ或YMC-ODS-AA硅膠填料。
全文摘要
本發(fā)明涉及從桑葉中連續(xù)提取分離多糖及1-脫氧野尻霉素的方法，該方法包括以下步驟將桑葉粉碎，在一定條件下，進行超臨界CO2萃取，收集桑葉渣；桑葉渣干燥后，乙醇回流，提??；提取液濃縮，靜置，沉淀干燥，即得含量為60％～80％的多糖類化合物；上清液濃縮，通過陽離子交換樹脂，活性成分被吸附于樹脂上；用含水醇和氨水洗脫樹脂；氨水洗脫液濃縮，通過反相C18硅膠基層析柱洗脫液濃縮，干燥，即得桑葉生物堿，其中1-脫氧野尻霉素含量80-86％。詳細方法見說明書。本發(fā)明的優(yōu)點工藝簡單、提取率高且所得產(chǎn)品純度更高，純化所用樹脂及硅膠均可再生，成本低，利于工業(yè)化推廣和應(yīng)用。
文檔編號C08B37/00GK102964460SQ201210462979
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者李翠清, 王騰, 李繼文, 張紅 申請人:北京石油化工學(xué)院