專利名稱：C/y/w135群腦膜炎球菌多糖精制工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有抗原的醫(yī)藥制品領(lǐng)域，特別是涉及C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝。
背景技術(shù)：
流行性腦脊髓膜炎(meningococcal meningitis)簡稱為流腦,是由腦膜炎奈瑟菌引起的急性化膿性腦膜炎。其主要臨床表現(xiàn)為突發(fā)高熱、劇烈頭痛、頻繁嘔吐、皮膚黏膜瘀點、瘀斑及腦膜刺激征，嚴(yán)重者可有敗血癥休克和腦實質(zhì)損害，?？晌＜吧?。部分病人暴發(fā)起病，可迅速致死。A+C+Y+W135四價疫苗能對該病的預(yù)防起積極的作用。疫苗接種后，可使機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，用于預(yù)防A、C、Y、W135群腦膜炎球菌引起的流行性腦脊髓膜炎。 細(xì)菌莢膜多糖是制備流腦疫苗的有效成分。A、C、Y、W135腦膜炎奈瑟菌培養(yǎng)液，經(jīng)提純獲取A、C、Y、W135群莢膜多糖抗原，純化后加入乳糖凍干，再經(jīng)無菌、安全、毒力試驗和分子量測定合格后，即成為合格疫苗。對于以莢膜多糖為抗原制備的疫苗，制備中要求將粗制多糖中的蛋白盡可能完全去除。如發(fā)明專利ZL03131108.3 (公告日2005. 7. 6)所述，現(xiàn)行腦膜炎球菌多糖精制工藝通常使用醋酸鈉溶液溶解粗多糖，并經(jīng)預(yù)冷的苯酚抽提蛋白達(dá)到使其去除的目的，雖然多糖中的蛋白含量去除指標(biāo)滿足2010版中國藥典規(guī)定要求(< 10mg/g)，但苯酚的使用不但污染環(huán)境，其殘留也影響制品質(zhì)量，損害人體健康，還具有潛在的致癌毒性。申請中的發(fā)明專利201110245718. 3 (
公開日2012. I. 25)記載了不使用苯酚精制A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖的工藝，但是該工藝目前僅處于實驗室階段，技術(shù)參數(shù)無法在大規(guī)模生產(chǎn)中推廣。本發(fā)明C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝的原理在于，從細(xì)菌莢膜多糖可以與陽離子表面活性劑CTAB結(jié)合形成沉淀的現(xiàn)象推斷，莢膜多糖帶有負(fù)電荷，因此可與陰離子交換柱結(jié)合。填料篩選的結(jié)果證實，C/Y/W135群多糖能夠非常牢靠地結(jié)合到陰離子填料上，很難洗脫，而在陽離子交換填料上則全流穿。因而本發(fā)明在層析柱中添加表面活性劑，使多糖流穿的同時蛋白吸附，達(dá)到多糖精制的目的。本發(fā)明C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝相較于傳統(tǒng)的冷酚法提取，其有益效果在于I.能將蛋白含量有效的控制，使多糖蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于冷酚法；2.能將多糖收率提高；3.能降低內(nèi)毒素含量。而且，本發(fā)明C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝經(jīng)試生產(chǎn)，證明回收率可達(dá)到80%左右，適用于批次100克粗糖產(chǎn)量的規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)采用冷酚提取粗制多糖中的蛋白，殘留冷酚對人體造成傷害，以及其他實驗室方法無法量產(chǎn)的缺陷，本發(fā)明提供了一種新型的層析技術(shù)，蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定范圍，殘留毒性低于冷酚法，并適于量產(chǎn)。本發(fā)明提供了一種C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝，包括如下步驟I.用溶解液分別溶解粗制的C、Y或W135群腦膜炎球菌多糖之一；2.將多糖置換到平衡緩沖液中；3.將收集的多糖溶液上陰離子交換柱，上樣量為2(T50mg/ml gel ；4.采用洗脫液從陰離子交換柱上洗脫吸附物質(zhì)；5.按不同的洗脫峰分段收集206波長下的吸收峰；
6.采用超濾膜超濾脫鹽法去除小分子物質(zhì)。所述溶解液為IOmM Tris-HCl, pH9. O ;所述洗脫液為 20mM Tris-HCl, pH8. 0，其中含 IM NaCl.優(yōu)選地，所述陰離子交換柱包括Capto adhere串聯(lián)柱。其中，C群腦膜炎球菌多糖精制工藝中，步驟3中的陰離子交換柱為DEAE-4FF與Capto adhere串聯(lián)柱。選用DEAE-4FF與Capto adhere串聯(lián)柱能夠更好的將多糖與蛋白分離開來，由于蛋白在DEAE-4FF柱上吸附而多糖在DEAE-4FF柱上流穿在Capto adhere柱上吸附，從而將多糖與蛋白分離開來。優(yōu)選地，C群腦膜炎球菌多糖精制工藝中，平衡緩沖液為20mM Tris-HCl, pH8. 0，含1%D0C (D0C，脫氧膽酸鈉)。加入1%D0C是為了使C群腦膜炎球菌多糖在層析柱中流穿，如果不加入D0C，蛋白和多糖的區(qū)分不明顯，不利于C群腦膜炎球菌多糖收集。優(yōu)選地，Y群或W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝中，平衡緩沖液為20mMTris-HCl, pH8. O。選用上述平衡緩沖液是因為它近似洗脫緩沖液(20mM Tris-HCl, pH8. 0，其中含IM NaCl )，更有利于多糖的洗脫優(yōu)選地，步驟6中采用脫鹽柱或超濾脫鹽法去除小分子物質(zhì)。選用超濾膜脫鹽法易操作簡便；選用脫鹽柱可以實現(xiàn)聯(lián)動操作。本發(fā)明的有益效果是無苯酚殘留；能將蛋白含量有效的控制，使多糖蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家藥典規(guī)定的范圍；能提高多糖回收率；能降低內(nèi)毒素含量；適合于規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的較佳實施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。采用層析法替代傳統(tǒng)的苯酚抽提的方法從流腦粗糖中提純流腦莢膜多糖。根據(jù)現(xiàn)行的多糖生產(chǎn)工藝，細(xì)菌莢膜多糖可以與陽離子表面活性劑CTAB結(jié)合形成沉淀推斷多糖帶有負(fù)電荷，從填料篩選的結(jié)果也證實，多糖能夠結(jié)合到陰離子填料上，而在陽離子交換填料上全流穿。實施例I C群腦膜炎球菌多糖精制原料采用粗制C群腦膜炎球菌多糖，溶解液為IOmM Tris-HCl, pH9. O ;平衡緩沖液為 20mM Tris-HCl, pH8.0，其中含 1%D0C ;洗脫液為 20mM Tris-HCl，其中含 IM NaCl，pH8. O。I.用溶解液溶解粗制C群腦膜炎球菌多糖為5mg/ml ；2.采用S印HarOSe-G25(26/10 desalting)柱將溶解的多糖置換到平衡緩沖液中，收集外水第一峰為多糖峰，終濃度約為2. 5mg/ml ；
3.將收集的多糖溶液上DEAE-4FF與Capto adhere串聯(lián)柱，上樣量為2(T50mg/ml gel ；4.采用線性洗脫方式從DEAE-4FF與Capto adhere串聯(lián)柱上洗脫吸附物質(zhì)，所用洗脫液為20mM Tris-HCl, pH8. 0，其中含NaCl濃度從O mol/1 I mol/1的線性梯度變化；5.按不同的洗脫峰分段收集206波長下的吸收峰；6.采用脫鹽柱或超濾脫鹽法去除小分子物質(zhì)。此處緩沖液中加入1%D0C目的是為了使C群腦膜炎球菌多糖在層析柱中流穿，如果不加入D0C，蛋白和多糖的區(qū)分不明顯，不利于C群腦膜炎球菌多糖收集。實施例2 C群腦膜炎球菌多糖精制如實施例I所述方法，區(qū)別在于，前述步驟2改為使用100KD超濾膜，在超濾器上 將溶解的多糖置換到平衡緩沖液中，終濃度約為2. 5mg/ml。相較于實施例1，此法同樣可以達(dá)到將多糖置換到平衡緩沖液的作用，同時可省略一步收集洗脫峰的操作，因此更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。實施例3 Y群腦膜炎球菌多糖精制原料采用粗制Y群腦膜炎球菌多糖。溶解液為IOmM Tris-HCl，pH9. O ;平衡緩沖液為 IOmM Tris-HCl, ρΗ8· O ;洗脫液為 20mM Tris-HCl, I mol/lNaCl，ρΗ8· O。I.用溶解液溶解粗制Y群腦膜炎球菌多糖為5mg/ml ；2.采用S印HarOSe-G25 (26/lOdesalting)柱將多糖置換到平衡緩沖液中，收集外水第一峰為多糖峰，終濃度為2. 5mg/ml ；3.將收集的多糖溶液上Capto adhere陰離子交換柱，上樣量為2(T50mg/mlgel ；4.采用梯度洗脫和線性洗脫配合的方式將多糖洗脫，具體地，以35% B洗脫液梯度洗脫2個柱體積，再以35%-100% B洗脫液線性洗脫5個柱體積。B洗脫液為20mMTris-HCl, I mol/lNaCl，ρΗ8· O ；(35%Β 或 35%-100%Β 中 % 表示鹽濃度的變化5.收集206波長下的吸收峰；6.采用脫鹽柱或超濾脫鹽法去除小分子物質(zhì)?；蛘?，步驟2替換為使用100KD超濾膜，在超濾器上將溶解的多糖置換到平衡緩沖液中，終濃度約為2. 5mg/ml。對于實際生產(chǎn)中超濾置換緩沖液比脫鹽柱使用更方便簡潔。實施例4 W135群腦膜炎球菌多糖精制如實施例3所述方法，區(qū)別在于，前述粗制Y群腦膜炎球菌多糖替換為粗制W135群腦膜炎球菌多糖。實施例5 A群腦膜炎球菌多糖精制 如實施例3所述方法，區(qū)別在于，前述粗制Y群腦膜炎球菌多糖替換為粗制A群腦膜炎球菌多糖。實施例6純度檢定對雜蛋白含量比較高的同一批次C群粗制多糖，按實施例I所述方法精制C群多糖，通過生化檢測我們可以得出以下數(shù)據(jù)，見表I。由表中數(shù)據(jù)可知，在使用DEAE-4FF和Capto adhere串聯(lián)層析法去除蛋白時，不僅使蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家規(guī)定要求，而且將核酸殘留也一并去除干凈，內(nèi)毒素也比在冷酚法所檢測到的內(nèi)毒素還要低一倍。
表I. C群粗制多糖冷酚法與層析法生化檢測結(jié)果對比
權(quán)利要求
1.一種C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝，其特征在于包括如下步驟 1)用溶解液溶解粗制的C或Y或W135群腦膜炎球菌多糖中的一種； 2)將溶解的多糖置換到平衡緩沖液中； 3)將收集的多糖溶液上陰離子交換柱，上樣量為2(T50mg/mlgel ； 4)采用洗脫液從陰離子交換柱上洗脫吸附物質(zhì)； 5)按不同的洗脫峰分段收集206波長下的吸收峰； 6)采用脫鹽法去除小分子物質(zhì)； 其中，所述溶解液為IOmM Tris-HCl，pH9. O ;所述洗脫液為20mM Tris-HCl，pH8. 0，含IMNaCl。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝，其特征在于所述陰離子交換柱包括Capto—adhere串聯(lián)柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝，其特征在于對于C群腦膜炎球菌多糖的精制，所述陰離子交換柱為DEAE-4FF與Capto adhere串聯(lián)柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝，其特征在于對于C群腦膜炎球菌多糖的精制，所述步驟2)中的平衡緩沖液為20mM Tris-HCl, pH8. 0，其中含1%D0C。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝，其特征在于對于Y群腦膜炎球菌多糖的精制，所述步驟2)中的平衡緩沖液為20mM Tris-HCl, pH8. O。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝，其特征在于對于W135群腦膜炎球菌多糖的精制，所述步驟2)中的平衡緩沖液為20mM Tris-HCl, pH8. O。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝，其特征在于所述步驟6)中采用脫鹽柱去除小分子物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝，其特征在于所述步驟6)中采用超濾脫鹽法去除小分子物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種C/Y/W135群腦膜炎球菌多糖精制工藝，包括溶解粗制的C、Y或W135群腦膜炎球菌多糖中的一種——將多糖置換到平衡緩沖液中——將收集的多糖溶液上陰離子交換柱——采用洗脫液從陰離子交換柱上洗脫吸附物質(zhì)——按不同的洗脫峰分段收集206波長下的吸收峰——采用脫鹽法去除小分子物質(zhì)。本發(fā)明能將蛋白含量有效的控制，使多糖蛋白含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于冷酚法，回收率可達(dá)到80%左右，適用于批次100克粗糖產(chǎn)量的規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C08B37/00GK102911285SQ201210465759
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者周家富, 陳宣洪, 周富昌, 任曉莉, 顧玉林 申請人:羅益(無錫)生物制藥有限公司