一種制備透明質(zhì)酸納米微球的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種制備透明質(zhì)酸納米微球材料的方法，提供了一種基于堿基配對(duì)作用交聯(lián)透明質(zhì)酸納米微球的手段。采用反相乳液交聯(lián)技術(shù)，通過(guò)堿基配對(duì)作用，實(shí)現(xiàn)了透明質(zhì)酸納米微球的交聯(lián)，得到了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的透明質(zhì)酸納米微球。本發(fā)明避免使用了有毒化學(xué)交聯(lián)劑，能保留被包埋藥物的生物活性，可顯著改善納米微球材料的使用安全性。本發(fā)明工藝和設(shè)備簡(jiǎn)單、易行、操作安全，具有制備溫度低、固化速度快、處理周期短等優(yōu)點(diǎn)，在活性藥物、蛋白或基因的包埋與傳遞方面有應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種制備透明質(zhì)酸納米微球的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種利用堿基配對(duì)交聯(lián)制備透明質(zhì)酸納米微球的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]天然多聚糖納米微球具有優(yōu)異的生物相容性和可調(diào)的生物降解性，可用于藥物、蛋白或基因的包埋和釋放，目前已廣泛用于藥物控釋、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究。通常，藥物在體內(nèi)代謝較快，而頻繁注射給藥則會(huì)給病人帶來(lái)極大的痛苦。選擇合適的納米微球體系，可實(shí)現(xiàn)藥物在體內(nèi)的緩慢釋放，達(dá)到理想的治療效果。在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，多聚糖納米微球常用于包埋細(xì)胞生長(zhǎng)因子和基因，提高細(xì)胞支架的生物活性，增加支架在體內(nèi)的組織誘 導(dǎo)能力。常用來(lái)制備納米微球的多聚糖包括:透明質(zhì)酸、海藻酸、硫酸軟骨素、殼聚糖、淀粉及纖維素等。
[0003]多聚糖納米微球在制備工程中必須添加化學(xué)交聯(lián)劑處理，其結(jié)構(gòu)才能穩(wěn)定。這些化學(xué)交聯(lián)劑主要有多聚甲醛、戊二醛、水溶性碳化二亞胺和京尼平等，其作用是將多聚糖分子中的活性基團(tuán)(氨基、羧基和羥基)經(jīng)過(guò)縮合而達(dá)到交聯(lián)的目的?；瘜W(xué)交聯(lián)劑具有細(xì)胞毒性，雖然能使納米微球在物理結(jié)構(gòu)上比較穩(wěn)定，但是會(huì)導(dǎo)致包埋的活性蛋白類藥物(如細(xì)胞生長(zhǎng)因子等)變性而失活，因此不適合用于活性蛋白的傳遞，同時(shí)交聯(lián)劑也容易殘留在材料中。避免使用有毒的化學(xué)交聯(lián)劑，則有望得到高生物活性的多聚糖納米微球材料，是降低材料毒性及提高藥物輸送效率的有效途徑。但是，現(xiàn)有技術(shù)中尚不存在采用無(wú)毒化學(xué)試劑交聯(lián)制備多聚糖納米微球的方法。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種制備透明質(zhì)酸納米微球的方法，避免使用了有毒化學(xué)交聯(lián)劑，可保證被包埋藥物的生物活性。
[0006]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為:通過(guò)堿基配對(duì)作用，采用反相乳液交聯(lián)技術(shù)制備透明質(zhì)酸納米微球，具體包括以下步驟:
步驟1、室溫下配制透明質(zhì)酸水溶液，加入多磷酸酯，攪拌均勻；滴加胸腺嘧啶鹽酸溶液，攪拌反應(yīng)；
步驟2、將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至沉淀析出未反應(yīng)的胸腺嘧啶，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明質(zhì)酸；
步驟3、室溫下配制透明質(zhì)酸水溶液，加入多磷酸酯，攪拌均勻；滴加腺嘌呤鹽酸溶液，攪拌反應(yīng)；
步驟4、將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至沉淀析出未反應(yīng)的腺嘌呤，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到腺嘌呤功能化透明質(zhì)酸；
步驟5、分別將上述兩種堿基功能化透明質(zhì)酸溶于石蠟油，各自加入司班80，超聲下按比例混合乳化后攪拌揮發(fā)過(guò)夜；
步驟6、將攪拌完成后的乳液倒入異丙醇中，待透明質(zhì)酸納米微球析出后進(jìn)行高速離心，隨后用異丙醇、正己烷和丙酮分別清洗，最后室溫真空干燥。
[0007]本發(fā)明所用到的試劑來(lái)源:透明質(zhì)酸、胸腺喃唳、腺嘌呤,購(gòu)于Sigma公司；司班80、乙酸乙酯，分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；異丙醇、正己烷、丙酮，分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司；鹽酸、氨水，分析純，上海化學(xué)試劑廠。氯化鈉、氯化鉀，分析純，上海試劑三廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，分析純，杭州化學(xué)試劑有限公司。DMEM培養(yǎng)基，Giboco公司；小牛血清，杭州四季青生物材料工程研究所；青霉素、鏈霉素，華北制藥股份有限公司。
[0008]本發(fā)明所用到的儀器:掃描電子顯微鏡(JSM-6330F，JE0L);納米粒度分析儀(Malvern Zetasizer Nano ZS);酶標(biāo)儀(Biorad, Model 550);噴金儀(Cressington 108Auto)ο
[0009]與現(xiàn)有技術(shù) 相比，本發(fā)明的特征在于:1)避免使用了有毒化學(xué)交聯(lián)劑，因此納米微球中不存在毒性殘留，保證了納米微球的安全性；2)所涉及的堿基配對(duì)基于分子間的氫鍵作用，不與被包埋活性藥物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，能有效保護(hù)藥物的生物活性，特別適用于活性蛋白類藥物的包埋與傳遞；3)本發(fā)明工藝和設(shè)備簡(jiǎn)單、易行、操作安全，具有制備溫度低、固化速度快、處理周期短、對(duì)環(huán)境不產(chǎn)生污染等優(yōu)點(diǎn)，適合商業(yè)化生產(chǎn)。
[0010]下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1是透明質(zhì)酸納米微球制備示意圖。
圖2是成球率與透明質(zhì)酸中堿基對(duì)配比(1/2、1/1和2/1)的關(guān)系。
[0012]圖3是納米微球的直徑與透明質(zhì)酸溶液濃度的關(guān)系。
[0013]圖4是透明質(zhì)酸納米微球的粒徑分布與掃描電子顯微圖。
[0014]圖5是透明質(zhì)酸納米微球在磷酸鹽緩沖溶液中的失重。
[0015]圖6是透明質(zhì)酸納米微球的細(xì)胞毒性。
【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明提供的一種制備透明質(zhì)酸納米微球的方法，其步驟包括:
步驟1、室溫下配制質(zhì)量/體積百分比為0.5~2%的透明質(zhì)酸水溶液，加入f 4倍質(zhì)量的多磷酸酯，攪拌均勻；滴加質(zhì)量/體積百分比為0.04、.2%的胸腺嘧啶鹽酸溶液，其體積為透明質(zhì)酸水溶液的1/5~1/2，然后在4(T60°C下攪拌反應(yīng)16~24小時(shí)；
步驟2、將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至沉淀析出未反應(yīng)的胸腺嘧啶，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明質(zhì)酸；
步驟3、室溫下配制質(zhì)量/體積百分比為0.5^2%的透明質(zhì)酸水溶液，加入f 4倍質(zhì)量的多磷酸酯，攪拌均勻；滴加質(zhì)量/體積百分比為0.04、.2%的腺嘌呤鹽酸溶液，其體積為透明質(zhì)酸溶液的1/5~1/2，隨后在4(T60°C下攪拌反應(yīng)16~24小時(shí)；步驟4、將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至沉淀析出未反應(yīng)的腺嘌呤，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到腺嘌呤功能化透明質(zhì)酸；
步驟5、分別將上述兩種堿基功能化透明質(zhì)酸以質(zhì)量/體積百分比為0.5^2.0%溶于石蠟油，各自加入0.2^0.5毫升司班80，超聲下將兩種堿基功能化透明質(zhì)酸溶液按照體積比1/2~2/1混合乳化5~10分鐘，然后以80(Tl500rpm攪拌揮發(fā)過(guò)夜；
步驟6、將攪拌完成后的乳液倒入10倍以上體積的異丙醇中，待透明質(zhì)酸納米微球析出后進(jìn)行高速離心，隨后用異丙醇、正己烷和丙酮分別清洗，最后室溫真空干燥。
[0017]其中磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的配制:稱取分析純氯化鈉8克、氯化鉀0.2克、磷酸氫二鈉2.9克、磷酸二氫鉀0.2克，溶于1000毫升蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.4。
[0018]多磷酸酯的制備:將0.07mmol 二乙醚、0.035mmol三氯甲燒、0.035mmol五氧化二磷混合攪拌，50°C下加熱回流12小時(shí)，減壓蒸餾得到多磷酸酯產(chǎn)物。
[0019]納米微球的形貌與粒徑檢測(cè):將干燥后的納米微球噴金(Cressington 108Auto)，在掃描電子顯微鏡(JSM-6330F，JEOL)上觀察微觀形貌。納米微球的直徑通過(guò)納米粒度分析儀(Malvern Zetasizer Nano ZS)測(cè)算。 [0020]納米微球的失重檢測(cè):取一定干燥納米微球稱重(Wci),置于37°C下的磷酸鹽緩沖溶液中孵育。測(cè)試時(shí)，將納米微球從溶液中離心，用蒸餾水和丙酮分別清洗，真空干燥后稱重(Wt)，每個(gè)樣品平行測(cè)試5次。計(jì)算納米微球失重的公式為100%X (Wtl -Wt)/Wtl，納米微球保留質(zhì)量為1- 100%X (W0 - Wt)/W。。
[0021]納米微球的細(xì)胞毒性檢測(cè):將稱重后的納米微球用75%乙醇浸泡2小時(shí)消毒，用滅過(guò)菌的磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)漂洗除去乙醇，置于24孔培養(yǎng)板(Nunc?，Denmark)中，然后接種數(shù)量為3 X IO4的人體成纖維細(xì)胞，并加入I毫升培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)基+10%小牛血清+100單位/毫升青霉素/鏈霉素)，將其放于37°C下孵育。測(cè)試時(shí)，每孔加入20微升0.5wt%MTT的磷酸鹽緩沖溶液，置于37°C下孵育4小時(shí)后加入200微升二甲基亞砜，振蕩均勻后采用酶標(biāo)儀(Biorad，Model 550)于570納米處測(cè)定紫色物質(zhì)的吸光度。
[0022]本發(fā)明采用ANOVA方差分析法，顯著差異值/7設(shè)為< 0.05。
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但這些實(shí)例并不用來(lái)限制本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1:
(O室溫下配制50毫升質(zhì)量/體積濃度為0.5%的透明質(zhì)酸水溶液，加入0.5克多磷酸酯，攪拌形成均勻溶液；滴加25毫升質(zhì)量/體積濃度為0.04%的胸腺嘧啶鹽酸溶液，50°C下攪拌反應(yīng)16小時(shí)；
(2)將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至0°C，沉淀析出未反應(yīng)的胸腺嘧啶，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明質(zhì)酸；
(3)采用步驟I)和2)中同樣的方法，制備腺嘌呤功能化透明質(zhì)酸；
(4)分別將上述兩種堿基功能化透明質(zhì)酸溶于50毫升石蠟油，分別配制成質(zhì)量/體積濃度為0.5%的溶液，各自加入0.2毫升司班80，超聲下等體積1/1混合乳化5分鐘，然后以800rpm的轉(zhuǎn)速攪拌揮發(fā)過(guò)夜；(5)將攪拌完成后的乳液倒入10倍體積的異丙醇中，待納米微球析出后進(jìn)行高速離心，隨后用異丙醇、正己烷和丙酮分別清洗，最后室溫真空干燥24小時(shí)。
[0025]實(shí)施例2:
(1)室溫下配制50毫升質(zhì)量/體積濃度為2%的透明質(zhì)酸水溶液，加入4克多磷酸酯，攪拌形成均勻溶液；滴加25毫升質(zhì)量/體積濃度為0.2%的胸腺嘧啶鹽酸溶液，60°C下攪拌反應(yīng)24小時(shí)；
(2)將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至0°C，沉淀析出未反應(yīng)的胸腺嘧啶，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明質(zhì)酸；
(3)采用步驟1)和2)中同樣的方法，制備腺嘌呤功能化透明質(zhì)酸；
(4)分別將上述兩種堿基功能化透明質(zhì)酸溶于50毫升石蠟油，分別配制成質(zhì)量/體積濃度為2.0%的溶液，各自加入0.5毫升司班80，超聲下按胸腺嘧啶/腺嘌呤體積比1/2混合乳化10分鐘，然后以1000rpm的轉(zhuǎn)速攪拌揮發(fā)過(guò)夜；
(5)將攪拌完成后的乳液倒入10倍體積的異丙醇中，待納米微球析出后進(jìn)行高速離心，隨后用異丙醇、正己烷和丙酮分別清洗，最后室溫真空干燥24小時(shí)。
[0026]實(shí)施例3:
(O室溫下配制50毫升質(zhì)量/體積濃度為1%的透明質(zhì)酸水溶液，加入0.5克多磷酸酯，攪拌形成均勻溶液；滴加20毫升質(zhì)量/體積濃度為0.08%的胸腺嘧啶鹽酸溶液，40°C下攪拌反應(yīng)18小時(shí)；
(2)將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至0°C，沉淀析出未反應(yīng)的胸腺嘧啶，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明質(zhì)酸；
(3)采用步驟I)和2)中同樣的方法，制備腺嘌呤功能化透明質(zhì)酸；
(4)分別將上述兩種堿基功能化透明質(zhì)酸溶于50毫升石蠟油，分別配制成質(zhì)量/體積濃度為1.2%的溶液，各自加入0.3毫升司班80，超聲下按胸腺嘧啶/腺嘌呤體積比2/1混合乳化6分鐘,然后以1200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌揮發(fā)過(guò)夜；
(5)將攪拌完成后的乳液倒入10倍體積的異丙醇中，待納米微球析出后進(jìn)行高速離心，隨后用異丙醇、正己烷和丙酮分別清洗，最后室溫真空干燥24小時(shí)。
[0027]實(shí)施例4:
(O室溫下配制50毫升質(zhì)量/體積濃度為1.5%的透明質(zhì)酸水溶液，加入1.2克多磷酸酯，攪拌形成均勻溶液；滴加20毫升質(zhì)量/體積濃度為0.13%的胸腺嘧啶鹽酸溶液，50°C下攪拌反應(yīng)20小時(shí)；
(2)將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至0°C，沉淀析出未反應(yīng)的胸腺嘧啶，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明質(zhì)酸；
(3)采用步驟I)和2)中同樣的方法，制備腺嘌呤功能化透明質(zhì)酸；
(4)分別將上述兩種堿基功能化透明質(zhì)酸溶于50毫升石蠟油，分別配制成質(zhì)量/體積濃度為1.8%的溶液，各自加入0.4毫升司班80，超聲下等體積混合乳化8分鐘，然后以1300rpm的轉(zhuǎn)速攪拌揮發(fā)過(guò)夜；(5)將攪拌完成后的乳液倒入10倍體積的異丙醇中，待納米微球析出后進(jìn)行高速離心，隨后用異丙醇、正己烷和丙酮分別清洗，最后室溫真空干燥24小時(shí)。
[0028]實(shí)施例5:
(O室溫下配制50毫升質(zhì)量/體積濃度為0.5%的透明質(zhì)酸水溶液，加入0.5克多磷酸酯，攪拌形成均勻溶液；滴加15毫升質(zhì)量/體積濃度為0.04%的胸腺嘧啶鹽酸溶液，40°C下攪拌反應(yīng)16小時(shí)；
(2)將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至0°C，沉淀析出未反應(yīng)的胸腺嘧啶，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明質(zhì)酸；
(3)采用步驟I)和2)中同樣的方法，制備腺嘌呤功能化透明質(zhì)酸；
(4)分別將上述兩種堿基功能化透明質(zhì)酸溶于50毫升石蠟油，分別配制成質(zhì)量/體積濃度為0.5%的溶液，各自加入0.2毫升司班80，超聲下按胸腺嘧啶/腺嘌呤體積比1/2混合乳化5分鐘,然后以1500rpm的轉(zhuǎn)速攪拌揮發(fā)過(guò)夜；
(5)將攪拌完成后的乳液倒入10倍體積的異丙醇中，待納米微球析出后進(jìn)行高速離心，隨后用異丙醇、正己烷和丙酮分別清洗，最后室溫真空干燥24小時(shí)。
[0029]實(shí)施例6:
(O室溫下配制50毫升質(zhì)量/體積濃度為0.5%的透明質(zhì)酸水溶液，加入0.5克多磷酸酯，攪拌形成均勻溶液；滴加10毫升質(zhì)量/體積濃度為0.04%的胸腺嘧啶鹽酸溶液，60°C下攪拌反應(yīng)16小時(shí)；
(2)將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至0°C，沉淀析出未反應(yīng)的胸腺嘧啶，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明質(zhì)酸；
(3)采用步驟I)和2)中同樣的方法，制備腺嘌呤功能化透明質(zhì)酸；
(4)分別將上述兩種堿基功能化透明質(zhì)酸溶于50毫升石蠟油，分別配制成質(zhì)量/體積濃度為0.5%的溶液，各自加入0.2毫升司班80，超聲下按胸腺嘧啶/腺嘌呤體積比2/1混合乳化5分鐘,然后以800rpm的轉(zhuǎn)速攪拌揮發(fā)過(guò)夜；
(5)將攪拌完成后的乳液倒入10倍體積的異丙醇中，待納米微球析出后進(jìn)行高速離心，隨后用異丙醇、正己烷和丙酮分別清洗，最后室溫真空干燥24小時(shí)。
[0030]本發(fā)明制備的透明質(zhì)酸納米微球分布均勻，平均直徑可控制在65~120納米，納米微球呈現(xiàn)完整的球形。納米微球的直徑隨著透明質(zhì)酸溶液的濃度的增加而變大。一定條件下，當(dāng)胸腺嘧啶功能化透明質(zhì)酸與腺嘌呤功能化透明質(zhì)酸溶液的體積比為1:1時(shí)，成球率最聞，達(dá)到87%。
[0031]本發(fā)明所制備的多聚糖納米微球在培養(yǎng)7天后失重很小，約92%的納米微球質(zhì)量依然保留，說(shuō)明該納米微球結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，適用于體內(nèi)藥物治療。將細(xì)胞與該納米微球共培養(yǎng)，結(jié)果表明細(xì)胞活性未受影響，說(shuō)明該納米微球沒(méi)有毒性，生物相容性好。
[0032]以上實(shí)施例涵蓋了最具代表性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
【權(quán)利要求】
1.一種透明質(zhì)酸納米微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、室溫下配制透明質(zhì)酸水溶液，加入多磷酸酯，攪拌均勻；滴加胸腺嘧啶鹽酸溶液，攪拌反應(yīng)； 步驟2、將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻至沉淀析出未反應(yīng)的胸腺嘧啶，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到胸腺嘧啶功能化透明質(zhì)酸； 步驟3、室溫下配制透明質(zhì)酸水溶液，加入多磷酸酯，攪拌均勻；滴加腺嘌呤鹽酸溶液，攪拌反應(yīng)； 步驟4、將反應(yīng)完成后的透明質(zhì)酸溶液冷卻，沉淀析出未反應(yīng)的腺嘌呤，然后用氨水將上清溶液調(diào)至中性，隨后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，最后將有機(jī)溶劑蒸干，得到腺嘌呤功能化透明質(zhì)酸； 步驟5、分別將上述兩種堿基功能化透明質(zhì)酸溶于石蠟油，各自加入司班80，超聲下混合乳化后攪拌揮發(fā)過(guò)夜； 步驟6、將攪拌完成后的乳液倒入異丙醇中，待透明質(zhì)酸納米微球析出后進(jìn)行高速離心，隨后用異丙醇、正己烷和丙酮分別清洗，最后室溫真空干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸納米微球的制備方法，其特征在于，所述步驟I中透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量/體積百分比為0.5~2%，胸腺嘧啶鹽酸溶液的質(zhì)量/體積百分比為0.04、.2% ;其中加入的多磷酸酯質(zhì)量為透明質(zhì)酸水溶液的1~4倍，胸腺嘧啶鹽酸溶液的體積為透明質(zhì)酸水溶液的1/5~1/2 ;在4(T60°C下攪拌反應(yīng)16~24小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明 質(zhì)酸納米微球的制備方法，其特征在于，所述步驟3中透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量/體積百分比為0.5~2%，腺嘌呤鹽酸溶液的質(zhì)量/體積百分比為0.04、.2% ;其中加入的多磷酸酯質(zhì)量為透明質(zhì)酸水溶液的1~4倍，腺嘌呤鹽酸溶液的體積為透明質(zhì)酸水溶液的1/5~1/2 ;在4(T60°C下攪拌反應(yīng)16~24小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸納米微球的制備方法，其特征在于，所述步驟5中制備出的堿基功能化透明質(zhì)酸以質(zhì)量/體積百分比為0.5^2.0%溶于石蠟油；加入的司班80為0.2^0.5毫升；兩種堿基功能化透明質(zhì)酸溶液按照體積比1/2~2/1混合；乳化時(shí)間為5~10分鐘；攪拌轉(zhuǎn)速為80(Tl500rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸納米微球的制備方法，其特征在于，所述步驟6中異丙醇的體積為攪拌完成后的乳液的10倍以上。
【文檔編號(hào)】C08L5/08GK103848995SQ201210516294
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月4日
【發(fā)明者】談華平 申請(qǐng)人:南京理工大學(xué)