專利名稱：用于生物分子固定的薄膜、制作方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于生物分子固定的薄膜、制作方法及應(yīng)用，特別是涉及一種在導(dǎo)電或不導(dǎo)電的傳感器表面上能高密度固定含有氨基的核酸分子或蛋白質(zhì)分子的薄膜，以及這種薄膜的制作方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
業(yè)已知道，生物分子與生物傳感器表面結(jié)合方式有以下四種物理吸附、包被、靜電吸附和共價結(jié)合。一般而言，評價合適的生物分子在傳感器表面固定方法應(yīng)滿足下面三個標準(1)該方法是否能讓固定到表面的生物分子保持生物活性，(2)在不同pH值、溫度、離子強度和化學(xué)性質(zhì)的微環(huán)境中，該方法是否能重復(fù)、持久和穩(wěn)定地固定生物分子，(3)該方法是否能讓生物分子高效、均一和定向地固定在表面。共價結(jié)合能滿足以上三個條件，盡 管共價結(jié)合有可能會在一定程度上削弱生物分子的活性，但是仍然是迄今為止最好的固定方法。目前，生物傳感器表面最常用的共價結(jié)合固定方式是自組裝技術(shù)利用傳感器表面特性(如羧基和氨基活化、金與巰基結(jié)合等)與交聯(lián)試劑所帶的活性基團(醛基、氨基、羧基、巰基等)形成的共價鍵結(jié)合，進而可以與生物分子末端的氨基或羧基共價結(jié)合，從而使生物分子可以穩(wěn)定地固定在表面。在這種工藝中，自組裝層的活性點數(shù)以及分布決定著整個修飾工藝最后的生物分子固定量和分布情況，但是自組裝后活性點密度和均一性都難以重復(fù)，可能導(dǎo)致修飾后不同表面或同一表面不同區(qū)域存在較大差異；此外，選用的交聯(lián)試劑其分子的另一端一般都有羧基、氨基等活性基團，這些基團在自組裝過程中一定程度上也會與傳感器表面相互作用，影響自組裝效果；而且，自組裝技術(shù)中形成的膜中可能存在缺陷會導(dǎo)致化學(xué)鍵斷裂，成膜分子倒伏或脫落從而影響固定效果。鑒于生物傳感器表面生物分子固定主要依靠自組裝技術(shù)，所以國內(nèi)外大多數(shù)研究者對生物傳感器表面修飾的研究也就局限在不斷改變含活性基團的化學(xué)試劑上。近幾年，在生物傳感器表面制備活性薄膜層來實現(xiàn)共價結(jié)合表面修飾的研究越來越多，所述的活性薄膜比自組裝單層膜厚得多，一般為聚合物層，它可以穩(wěn)定、均勻地固定在傳感器表面，且薄膜表層的活性基團之間具有一定空間位阻，可以順利地連接后續(xù)的交聯(lián)基團和生物分子。一般，在傳感器表面制備薄膜的方式有蒸鍍與濺射、離子鍍、化學(xué)氣相淀積、溶膠凝膠法、電化學(xué)聚合淀積、LB膜等，其中電化學(xué)聚合淀積制膜技術(shù)因其對儀器要求不高、操作過程簡單、成膜速度快、制膜工藝成熟等優(yōu)點而倍受研究者青睞。導(dǎo)電聚合物薄膜在生物傳感器中的應(yīng)用研究已經(jīng)非常多，其中對聚苯胺膜的研究從未停止，這是因為其本身具有制備容易、單體便宜、穩(wěn)定性強、成膜均勻致密等特點。早期，聚苯胺膜只是用來修飾和保護電極，Killard研究小組一直致力于利用電化學(xué)聚合技術(shù)研究聚苯胺膜，據(jù)報道，1999年他們就制備出可以利用靜電吸附固定蛋白質(zhì)的聚苯胺 / 聚乙烯橫酸復(fù)合膜(Killard, A. J.，et al. , Development of an electrochemicalflow injection immunoassay (FIIA) for the real-time monitoring of biospecificinteractions.Analytica Chimica Acta, 1999.400: p. 109 — 119 ;Grennan，K.，etal.，Optimisation and characterisation ofbiosensors based on polyaniline.Talanta, 2006. 68(5) :p. 1591-1600)，然而基于聚苯胺膜共價結(jié)合生物分子的生物傳感器研究開展得較少，2006年Sai研究小組(Sai, V. V. R. , et al. , Immobilizationof antibodies on polyaniline films and itsapplication in a piezoelectricimmunosensor. Analytical Chemistry, 2006. 78(24) :p. 8368-8373)第一次利用將聚苯胺膜修飾在具有導(dǎo)電性能的石英晶體微天平的金電極上，通過戊二醛進行蛋白質(zhì)固定研究，但只是僅僅研究了聚苯胺薄膜的厚度對固定效率的影響，然而對單純的聚苯胺膜本身的性質(zhì)沒有進一步探索，因為聚苯胺形成過程中還原單元與氧化單元共存，尤其表面的聚苯胺氧化單元不能與醛基反應(yīng)，就不能用來固定蛋白質(zhì)，大大影響了聚苯胺薄膜固定生物分子的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于生物分子固定的薄膜、制作方法及應(yīng)用，本發(fā)明克服了現(xiàn)有的生物分子在傳感器表面固定存在穩(wěn)定性和一致性較差、固定效率難以控制等缺陷，并為改善現(xiàn)有導(dǎo)電聚合物表面固定生物分子固定效率差等不足，采用微機電系統(tǒng)工藝、電化學(xué)淀積方法以及不可逆的化學(xué)反應(yīng)原理在導(dǎo)電或非導(dǎo)電的傳感器表面制成穩(wěn)定的還原態(tài)聚苯胺薄膜，有望可用于穩(wěn)定、可靠、高密度地固定生物分子。如圖I所示，本發(fā)明提供了一套制作該薄膜的工藝流程。一般經(jīng)過電化學(xué)聚合淀積方法制成的聚苯胺薄膜包含分兩個單元還原單元和氧化單元，如圖2所示。還原單元中的二級胺(仲胺)和苯胺單體中的一級胺(伯胺)都能與交聯(lián)試劑上醛基或羧基發(fā)生反應(yīng)形成烯胺和亞胺，生物分子中自帶或修飾上的氨基或羧基基團會與交聯(lián)試劑上另一端活性基團反應(yīng)形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；而氧化單元中的三級胺(叔胺)因為沒有活性不能與交聯(lián)試劑上醛基或羧基反應(yīng)結(jié)合。本發(fā)明提出在電化學(xué)聚合沉積的聚苯胺薄膜中加入含有巰基分子的化學(xué)試劑R-SH，可以將還原單元中的二級胺部分還原成一級胺，將氧化單元中的三級胺(叔胺)還原成二級胺，這樣就會使原本沒有活性的氧化單元可以與醛基反應(yīng)生成烯胺，從而增加了生物分子的固定效率，如圖3所示。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是1、傳感器表面直接固定生物分子需要復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)前處理過程；2、氧化態(tài)和還原態(tài)雜合的聚苯胺薄膜在導(dǎo)電或非導(dǎo)電表面的制備方法；3、氧化態(tài)和還原態(tài)雜合的聚苯胺薄膜表面如何處理變成還原態(tài)的聚苯胺,該還原態(tài)聚苯胺含有大量有活性的一級胺和二級胺。本發(fā)明中薄膜的主體結(jié)構(gòu)——還原態(tài)聚苯胺薄膜的制作根據(jù)傳感器表面的導(dǎo)電性不同，可分兩大部分進行(如圖4所示)導(dǎo)電表面在清潔后用電化學(xué)聚合沉積方法(循環(huán)伏安法、恒電流法、恒電壓法等)在表面形成聚苯胺薄膜，根據(jù)電解液溶質(zhì)的不同可以調(diào)節(jié)該薄膜的氧化態(tài)和還原態(tài)組分，然后將聚苯胺薄膜浸泡在含有巰基-SH的化學(xué)試劑中，薄膜表面氧化態(tài)三級胺被完全還原；非導(dǎo)電表面需要在表面預(yù)先電鍍、或蒸發(fā)、或濺射一層薄導(dǎo)電層，然后按照導(dǎo)電表面處理過程可以形成具有還原態(tài)聚苯胺薄膜。針對非導(dǎo)電表面，僅以循環(huán)伏安電化學(xué)聚合沉積法制作還原態(tài)聚苯胺薄膜的制作流程為例，具體而言(I)利用丙酮和乙醇溶液依次超聲清洗傳感器表面3_5min，在光學(xué)顯微鏡下觀察，確保傳感器表面潔凈，然后將傳感器浸泡在去離子水中待用；(2)該傳感器表面利用熱蒸發(fā)工藝或濺射工藝制作一層厚度為幾百納米的金屬層；(3)配制濃度為O. 5^1. 5mol/L的酸溶液(硫酸、鹽酸、硝酸等)，并在其中溶解濃度為O. 05、. 2mol/L的苯胺單體,形成用于聚合苯胺的電解質(zhì)溶液,并通氮氣除氧；(4)分別以該傳感器表面為工作電極、以甘汞電極為參比電極、以鉬電極為對電極，在上述配制的電解質(zhì)溶液中利用電化學(xué)工作站以循環(huán)伏安電化學(xué)方法在傳感器表面聚合聚苯胺，形成一層很薄的深綠色聚苯胺膜；(5)將聚苯胺薄膜浸泡于含有巰基-SH分子的化學(xué)試劑溶液中，約20min后取出， 聚苯胺薄膜表面呈淺綠色；這種還原態(tài)聚苯胺薄膜利用戊二醛、I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)等交聯(lián)試劑處理后可以連接不同活性基團修飾的生物分子。如用戊二醛作為交聯(lián)試劑，固定氨基修飾的生物分子的步驟為聚苯胺膜初步處理后，立即將淺綠色聚苯胺薄膜浸泡于濃度為29Γ5%的交聯(lián)劑中，過約Ih后取出；在聚苯胺薄膜表面滴加含有氨基的生物分子溶液，過一段時間用清洗液清洗，氮氣吹干，生物分子固定在聚苯胺薄膜表面；如用EDC和NHS作為交聯(lián)試劑，固定氨基修飾的生物分子的步驟為先將氨基修飾的生物分子與濃度為O. Γ0. 5mM的EDC和濃度為O. Γ . OmM的Sulfo-NHS反應(yīng)(EDC:NHS=2:5)混合反應(yīng)約lh，然后將反應(yīng)好的混合溶液浸泡或滴在聚苯胺薄膜，約30min后生物分子就被固定在薄膜表面。綜上所述傳感器表面通過電化學(xué)聚合方法制備還原態(tài)和氧化態(tài)雜合的聚苯胺薄膜后，將聚苯胺薄膜浸泡在含巰基(-SH)的化學(xué)試劑中，巰基與聚苯胺中的二級、三級胺反應(yīng)，從而得到完全還原態(tài)的聚苯胺薄膜，含有豐富的活性一級胺和二級胺，能夠利用戊二醛等交聯(lián)劑將含有氨基的蛋白分子或核酸分子進行固定。由此可見，本發(fā)明提供的還原態(tài)聚苯胺薄膜及制作方法具有以下幾個特點(I)本發(fā)明通過電化學(xué)聚合淀積方法制成的聚苯胺薄膜與傳感器表面接觸緊密，含有的活性胺基團比傳感器表面直接用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的活性基團要多且穩(wěn)定，避免了傳統(tǒng)單分子組裝共價化學(xué)修飾方法帶來的不確定性和不穩(wěn)定性。(2)本發(fā)明中分別在導(dǎo)電表面和非導(dǎo)電表面制成的還原態(tài)聚苯胺薄膜，其作為傳感器表面修飾材料可以廣泛應(yīng)用。(3)本發(fā)明中采用微機電系統(tǒng)工藝、電化學(xué)聚合淀積工藝和巰基還原化學(xué)原理相結(jié)合方法制作還原態(tài)聚苯胺薄膜，方法可靠、簡單。


圖I :用于固定生物分子的薄膜及其傳感器結(jié)構(gòu)示意圖；(I)導(dǎo)電表面的聚苯胺薄膜、交聯(lián)試劑及生物分子的側(cè)視示意圖；(2)非導(dǎo)電表面的聚苯胺薄膜、交聯(lián)試劑及生物分子的側(cè)視示意圖；圖2 :各種狀態(tài)的聚苯胺示意圖；(I)氧化態(tài)和還原態(tài)雜合的聚苯胺；(2)還原態(tài)聚苯胺；
(3)氧化態(tài)聚苯胺；圖3 :聚本胺在含有疏基的溶液中的反應(yīng)不意圖；圖4 :生物分子在含有還原態(tài)聚苯胺表面固定流程示意圖；(I)導(dǎo)電表面利用還原態(tài)聚苯胺固定生物分子流程示意圖；(a)、(b)、(c)、(d)和(e)為工藝步驟,具體為(a) 一清洗表面(b) —淀積聚苯胺(C) 一還原聚苯胺(d)—加交聯(lián)試劑(e)_生物分子與還原態(tài)聚苯胺反應(yīng)并固定 (2)非導(dǎo)電表面利用還原態(tài)聚苯胺固定生物分子流程示意圖；(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)為工藝步驟,具體為(a)-清洗表面(b)-生長金屬層(c)-淀積聚苯胺(d)-還原聚苯胺(e)_加交聯(lián)試劑(f)_生物分子與還原態(tài)聚苯胺反應(yīng)并固定圖5 :實施例I在石英晶體微天平表面固定蛋白質(zhì)分子(甲胎蛋白抗體)的不意圖；(a)、(b)、(C)和(d)為工藝步驟,具體為(a)-清洗石英晶體微天平 (b)-金電極表面生長還原態(tài)聚苯胺(C)-連接戊二醛(d)-甲胎蛋白抗體與戊二醛連接并固定圖6 :實施例2在玻璃表面固定核酸分子的示意圖；(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)為工藝步驟,具體為(a) 一清洗玻璃(b) —生長或淀積鉻/金導(dǎo)電層(C) 一淀積聚苯胺(d)—還原聚苯胺(e)—交聯(lián)試劑與核酸分子上羧基反應(yīng)(f)一聚苯胺表面活性胺固定核酸分子；圖中I一生物分子(包括核酸分子、蛋白質(zhì)分子等)2—交聯(lián)試劑(包括戊二醛等)3—還原態(tài)聚苯胺薄膜4一導(dǎo)電的傳感器表面5—導(dǎo)電層(包括導(dǎo)電聚合物、金屬等)6一非導(dǎo)電的傳感器表面7—氧化態(tài)和還原態(tài)雜合的聚苯胺薄膜8 一石英晶體微天平9 一石英晶體微天平表面導(dǎo)電層10—玻璃11一核酸分子。
具體實施例方式通過下面的具體實施方式
以進一步闡明本發(fā)明所提供的用于生物分子固定的薄膜及制作方法包括三部分I、還原態(tài)聚苯胺薄膜的設(shè)計；2、還原態(tài)聚苯胺薄膜的制作；3、生物分子的固定。實施例I在石英晶體微天平(QCM)表面利用還原態(tài)聚苯胺薄膜固定蛋白質(zhì)分子(甲胎蛋白抗體)設(shè)計還原態(tài)聚苯胺薄膜時考慮以下多個參數(shù)傳感器結(jié)構(gòu)、導(dǎo)電層結(jié)構(gòu)與面積、薄膜厚度、聚苯胺薄膜氫離子摻雜濃度、電化學(xué)聚合淀積時間、含巰基分子的試劑選擇、氧化態(tài)聚苯胺表面處理時間、交聯(lián)試劑選擇與處理時間等等。例如，所選傳感器表面的導(dǎo)電與否決定了是否需要在傳感器表面預(yù)先沉積一層幾百納米的金屬層，而導(dǎo)電層的結(jié)構(gòu)以及厚度則需要根據(jù)實際需求，可以是Ti/Au或Ti/Pt等；在電化學(xué)法合成聚苯胺時氫離子濃度、電化學(xué)沉積時間都對生成的聚苯胺的結(jié)構(gòu)與形態(tài)有重要影響；而對于含巰基分子試劑的選取既要保證巰基的作用也要避免其他基團的干擾，采用含巰基試劑的處理濃度與處理時間則決定了聚苯胺的還原效果；而最后交聯(lián)試劑的選擇與處理時間則需要和目標生物分子相對應(yīng)以達到最佳固定效果。本實施例以石英晶體微天平為傳感器，其金電極表面可以直接進行電化學(xué)鍍膜，不需要進行預(yù)先鍍金屬；同時，對于QCM而言，其具有晶體振蕩頻率變化Af正比于工作電極上沉積物的質(zhì)量改變Λ M的特性，根據(jù)這一特性能有效檢測出QCM電極上沉積物的質(zhì)量。含巰基R-SH的化學(xué)分 子選用半胱胺(又名巰基乙胺，NH2-CH2-CH2-SH)，其兩端含有兩個活性基團——氨基和巰基，在聚苯胺電化學(xué)聚合后加入一定比例的半胱胺，其巰基可以用于還原聚苯胺的將要形成的氧化單元，而且其氨基可以裸露在還原態(tài)聚苯胺表面，促使生成的復(fù)合膜中一級胺和二級胺數(shù)量大量增加，大大增加生物分子的固定密度和固定效率。交聯(lián)試劑選用戊二醛，兩個醛基能分別與基底活性胺和生物分子氨基結(jié)合。本實施例選用甲胎蛋白抗體(一種蛋白質(zhì)分子，蛋白質(zhì)分子都含有氨基基團)作為需要固定的生物分子。具體制作工藝主要分為以下四個部分，包括下列步驟I、QCM芯片的清洗與預(yù)處理(4)依次采用丙酮、乙醇以及去離子水對QCM芯片的金(Au)膜電極進行超聲清洗，清洗結(jié)束后用氮氣吹干待用；(5)將PDMS涂覆在QCM芯片的引線上，在80°C下烘烤2h使聚二甲基硅氧烷(PDMS)固化，PDMS對芯片引線起到絕緣保護作用；(6)測量預(yù)處理后的QCM芯片的基頻&，作為頻率變化的參考值。2、還原態(tài)聚苯胺薄膜的制備(5)配置濃度為I. Omol/L的硫酸溶液,并在其中添加苯胺單體,苯胺單體最終濃度為O. lmol/L，充分混合后得到聚苯胺制備所需電解液，對配置好的電解液通氮氣30min除氧；(6)實驗采用三電極體系，以QCM芯片的Au膜為工作電極(WE)，飽和甘汞電極為參比電極(RE)，鉬絲電極(Pt)為對電極(CE)。采用循環(huán)伏安法(CV法)制備聚苯胺膜，其中掃描電壓范圍為-O. 2^0. 9V，掃描速度為20mV/s，掃描周期數(shù)為5 ；(7)鍍膜結(jié)束后用去離子水快速沖洗聚苯胺膜表面除去膜上附帶的雜質(zhì)離子。(8)將完成鍍膜并清洗過的QCM芯片迅速浸泡到濃度為O. 01mol/L的半胱胺溶液中，20min后取出，并用去離子水快速沖洗；3、還原態(tài)聚苯胺膜表面的修飾處理(3)將半胱胺處理后的芯片浸泡到濃度為2%的戊二醛溶液(pH=7. 4)中，30min后取出，并用磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4和NaH2PO4配置，pH=7. 4)快速沖洗；(4)測量聚苯胺膜改性修飾后QCM芯片的基頻f/，根據(jù)QCM諧振頻率變化量與電極表面沉積物質(zhì)量變化的正比關(guān)系通過比較fo與fc/可得到聚苯胺的沉積情況并進行優(yōu)化。
4、甲胎蛋白抗體的固定(5)配置濃度為O. 5mg/mL的甲胎蛋白抗體溶液，在保濕盒中將修飾后的聚苯胺膜浸泡在甲胎蛋白抗體溶液中孵化Ih進行蛋白固定；(6)孵化結(jié)束后，用PBS溶液沖洗聚苯胺膜表面除去非共價連接固定的蛋白；(7)測量固定蛋白后的QCM芯片的基頻fQ"；(8)同樣根據(jù)QCM的頻率變化量正比于電極表面沉積量的特性，通過比較f/和fc/的值可以得出固定在QCM表面金電極上的甲胎蛋白抗體的量。實施例2在玻璃表面利用還原態(tài)聚苯胺薄膜固定核酸分子—般制作微陣列芯片需要將玻璃表面羥基化、醛基化，然后將氨基修飾的核酸分 子固定。本實施例利用還原態(tài)聚苯胺在玻璃表面固定核酸分子，考慮到玻璃表面不導(dǎo)電，需要在玻璃表面生長或淀積鉻(約50nm)/金(約20nm)導(dǎo)電層；然后按照實施例一步驟I中(I)和步驟2中(I)、(2)、(3)在玻璃表面制得聚苯胺薄膜；選用巰基乙醇作為R-SH化學(xué)試劑用于還原聚苯胺中氧化單元，將完成鍍膜并清洗過的玻璃迅速浸泡到濃度為O. lmol/L的β -巰基乙醇溶液中，20min后取出，并用去離子水快速沖洗；末端帶有羧基的核酸分子與濃度為O. 2mM的EDC和濃度為O. 5mM的Sulf0-NHS反應(yīng)，反應(yīng)Ih后將混合溶液滴在已處理的聚苯胺薄膜玻璃上，反應(yīng)30min后用磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4和NaH2PO4配置，pH=7. 4)快速沖洗，這樣帶有羧基的核酸分子就固定在玻璃表面，如圖6所示。
權(quán)利要求
1.用于生物分子固定的薄膜，其特征在于在電化學(xué)聚合沉積的聚苯胺薄膜中加入含有疏基分子的化學(xué)試劑R-SH，將還原單元中的二級胺部分還原成一級胺，將氧化單元中的三級胺叔胺還原成二級胺，使沒有活性的氧化單元與醛基反應(yīng)生成烯胺，從而增加了生物分子的固定效率。
2.按權(quán)利要求I所述的薄膜，其特征在于所述的還原態(tài)聚苯胺薄膜利用戊二醛、I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽或N-羥基硫代琥珀酰亞胺Sulfo-NHS交聯(lián)試劑處理后可連接不同活性基團修飾的生物分子。
3.按權(quán)利要求2所述的薄膜，其特征在于 a)用戊二醛作為交聯(lián)試劑，固定氨基修飾的生物分子的步驟為聚苯胺膜初步處理后，立即將淺綠色聚苯胺薄膜浸泡于濃度為29Γ5%的交聯(lián)劑中，Ih后取出；在聚苯胺薄膜表面滴加含有氨基的生物分子溶液，過一段時間用清洗液清洗，氮氣吹干，使生物分子固定在聚苯胺薄膜表面； b)用EDC和NHS作為交聯(lián)試劑，固定氨基修飾的生物分子的步驟為先將氨基修飾的生物分子與濃度為O. Γ0. 5mM的EDC和濃度為O. Γ . OmM的Sulfo-NHS反應(yīng)(EDC:NHS=2:5)混合反應(yīng)lh，然后將反應(yīng)好的混合溶液浸泡或滴在聚苯胺薄膜，30min后生物分子就被固定在薄膜表面。
4.按權(quán)利要求I所述的薄膜的制備方法，其特征在于根據(jù)傳感器表面的導(dǎo)電性不同，分兩大部分進行①導(dǎo)電表面在清潔后用循環(huán)伏安法、恒電流法或恒電壓法電化學(xué)聚合沉積方法在表面形成聚苯胺薄膜，根據(jù)電解液溶質(zhì)的不同調(diào)節(jié)該薄膜的氧化態(tài)和還原態(tài)組分，然后將聚苯胺薄膜浸泡在含有巰基-SH的化學(xué)試劑中，薄膜表面氧化態(tài)三級胺被完全還原；②非導(dǎo)電表面需要在表面預(yù)先電鍍、蒸發(fā)或濺射一層薄導(dǎo)電層，然后按照導(dǎo)電表面處理過程可以形成具有還原態(tài)聚苯胺薄膜。
5.按權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于對于非導(dǎo)電表面和以循環(huán)伏安電化學(xué)聚合沉積法制作還原態(tài)聚苯胺薄膜的制作流程為 (1)利用丙酮和乙醇溶液依次超聲清洗傳感器表面3-5min，在光學(xué)顯微鏡下觀察，確保傳感器表面潔凈，然后將傳感器浸泡在去離子水中待用； (2)在傳感器表面利用熱蒸發(fā)工藝或濺射工藝制作一層厚度為幾百納米的金屬層； (3)配制濃度為O.5^1. 5mol/L的酸溶液，并在其中溶解濃度為O. 05、. 2mol/L的苯胺單體，形成用于聚合苯胺的電解質(zhì)溶液，并通氮氣除氧； (4)分別以所述的傳感器表面為工作電極、以甘汞電極為參比電極、以鉬電極為對電極，在上述配制的電解質(zhì)溶液中利用電化學(xué)工作站以循環(huán)伏安電化學(xué)方法在傳感器表面聚合聚苯胺，形成一層很薄的深綠色聚苯胺膜； (5)將聚苯胺薄膜浸泡于含有巰基-SH分子的化學(xué)試劑溶液中，20min后取出，生成的聚苯胺薄膜表面呈淺綠色。
6.按權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于 a)步驟(3)所述的酸溶液為硫酸、鹽酸或硝酸溶液； b)步驟(2)所述的金屬層為Ti/Au或Ti/Pt。
7.按權(quán)利要求I所述的薄膜的應(yīng)用，其特征在于在石英晶體微天平表面利用還原態(tài)聚苯胺固定量的質(zhì)分子甲胎蛋白抗體，具體分為4方面A、石英晶體微天平QCM芯片的清洗與預(yù)處理 (1)依次采用丙酮、乙醇以及去離子水對QCM芯片的金Au膜電極進行超聲清洗，清洗結(jié)束后用氮氣吹干待用； (2)將PDMS涂覆在QCM芯片的引線上，在80°C下烘烤2h使聚二甲基硅氧烷PDMS固化，PDMS對芯片引線起到絕緣保護作用； (3)測量預(yù)處理后的QCM芯片的基頻&，作為頻率變化的參考值； B、還原態(tài)聚苯胺薄膜的制備 (1)配置濃度為I.Omol/L的硫酸溶液,并在其中添加苯胺單體,苯胺單體最終濃度為O.lmol/L，充分混合后得到聚苯胺制備所需電解液，對配置好的電解液通氮氣30min除 氧； (2)采用三電極體系，以QCM芯片的Au膜為工作電極WE，飽和甘汞電極為參比電極RE，鉬絲電極Pt為對電極CE ;采用循環(huán)伏安法制備聚苯胺膜，其中掃描電壓范圍為-O. 2^0. 9V,掃描速度為20mV/s，掃描周期數(shù)為5 ； (3)鍍膜結(jié)束后用去離子水快速沖洗聚苯胺膜表面除去膜上附帶的雜質(zhì)離子； (4)將完成鍍膜并清洗過的QCM芯片迅速浸泡到濃度為O.01mol/L的半胱胺溶液中，20min后取出，并用去離子水快速沖洗； C、還原態(tài)聚苯胺膜表面的修飾處理 (1)將半胱胺處理后的芯片浸泡到濃度為2%pH=7.4的戊二醛溶液中，30min后取出，并用磷酸鹽緩沖液快速沖洗；pH=7. 4的磷酸鹽緩沖液由Na2HPO4和NaH2PO4配置； (2)測量聚苯胺膜改性修飾后QCM芯片的基頻&/，根據(jù)QCM諧振頻率變化量與電極表面沉積物質(zhì)量變化的正比關(guān)系通過比較fo與f/可得到聚苯胺的沉積情況并進行優(yōu)化； D、甲胎蛋白抗體的固定 (1)配置濃度為O.5mg/mL的甲胎蛋白抗體溶液，在保濕盒中將修飾后的聚苯胺膜浸泡在甲胎蛋白抗體溶液中鮮化Ih進打蛋白固定； (2)孵化結(jié)束后，用PBS溶液沖洗聚苯胺膜表面，以除去非共價連接固定的蛋白； (3)測量固定蛋白后的QCM芯片的基頻f/； (4)同樣根據(jù)QCM的頻率變化量正比于電極表面沉積量的特性，通過比較f/和f/的值可以得出固定在QCM表面金電極上的甲胎蛋白抗體的量。
8.按權(quán)利要求I所述的薄膜的應(yīng)用，其特征在于在玻璃表面利用還原態(tài)聚苯胺薄膜固定核酸分子；利用還原態(tài)聚苯胺在玻璃表面固定核酸分子，玻璃表面不導(dǎo)電，需要在玻璃表面生長或淀積鉻/金導(dǎo)電層；然后按照權(quán)利要求7中步驟A中(I)和步驟B中(I)、(2)、(3)在玻璃表面制得聚苯胺薄膜；選用β_巰基乙醇作為R-SH化學(xué)試劑用于還原聚苯胺中氧化單元，將完成鍍膜并清洗過的玻璃迅速浸泡到濃度為O. lmol/L的β -巰基乙醇溶液中，20min后取出，并用去離子水快速沖洗；末端帶有羧基的核酸分子與濃度為O. 2mM的EDC和濃度為O. 5mM的Sulfo-NHS反應(yīng)，反應(yīng)Ih后將混合溶液滴在已處理的聚苯胺薄膜玻璃上，反應(yīng)30min后用磷酸鹽緩沖液快速沖洗，使帶有羧基的核酸分子固定在玻璃表面。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于生物分子固定的薄膜、制作方法及應(yīng)用。所述用于生物分子固定的薄膜，其特征在于在電化學(xué)聚合沉積的聚苯胺薄膜中加入含有疏基分子的化學(xué)試劑R-SH，將還原單元中的二級胺部分還原成一級胺，將氧化單元中的三級胺叔胺還原成二級胺，使沒有活性的氧化單元與醛基反應(yīng)生成烯胺，從而增加了生物分子的固定效率。本發(fā)明提供的薄膜制備分為導(dǎo)電和非導(dǎo)電兩大類，以QCM表面利用還原態(tài)聚苯胺固定蛋白質(zhì)分子甲胎蛋白抗體和在不導(dǎo)電玻璃表面利用還原態(tài)聚苯胺固定核酸分子作為實例說明其應(yīng)用。
文檔編號C08J7/12GK102964617SQ20121052146
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者許寶建, 蔡奇, 金慶輝, 趙建龍 申請人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所