專利名稱：一種基因載體材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因治療技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基因載體材料及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)。糾正的途徑可以是原位修復(fù)有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞基因組的某一部位，以替代缺陷基因來發(fā)揮作用。自1990年第一例基因治療的嘗試后，基因療法在腫瘤、免疫缺陷疾病、AIDS等難以攻克的疾病中多有研究及應(yīng)用。基因療法多依靠固定的基因轉(zhuǎn)染體系將所需要的目的基 因轉(zhuǎn)染至目標(biāo)細(xì)胞中以表達(dá)所需產(chǎn)物?；蜣D(zhuǎn)染體系主要有病毒載體轉(zhuǎn)染體系和非病毒載體轉(zhuǎn)染體系，客觀來講，兩種體系都有自身的優(yōu)缺點(diǎn)。病毒載體轉(zhuǎn)染體系以其轉(zhuǎn)染的高效性在當(dāng)前的研究中有著廣泛的應(yīng)用。但是隨著研究的深入，在臨床應(yīng)用及研究中，病毒載體的安全性越來越遭受懷疑，病毒載體在應(yīng)用中出現(xiàn)的免疫源性、組織富集性等問題以及在臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)的嚴(yán)重副反應(yīng)使研究者的目光開始轉(zhuǎn)向另一種轉(zhuǎn)染體系——非病毒載體轉(zhuǎn)染體系。非病毒轉(zhuǎn)染體系以其存在較低的毒性和免疫原性、較容易合成獲取而為研究者所青睞，但是低下的轉(zhuǎn)染效率是非病毒載體無法逾越的瓶頸，使得非病毒載體在基因治療中的應(yīng)用受到了極大的限制。因此，基因治療中，載體的安全性和合成載體的低運(yùn)轉(zhuǎn)效率等問題是目前的主要局限。肝臟疾病是臨床常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重危害人體健康。肝臟主要由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(PC)、竇狀上皮細(xì)胞(SEC)、枯否細(xì)胞(KC)、肝星狀細(xì)胞(HSC)組成，其中占肝細(xì)胞約20%的SEC細(xì)胞和占肝細(xì)胞約15%的KC細(xì)胞表面都大量表達(dá)甘露糖受體。甘露糖受體是一類廣泛存在于抗原呈遞細(xì)胞表面的受體，其功能表現(xiàn)在抗原呈遞細(xì)胞(APC)的抗原呈遞和T細(xì)胞傳遞上。甘露糖受體屬于C型凝集素家族，是一類鈣依賴型的受體，該受體含多糖識(shí)別的結(jié)構(gòu)域(Carbohyrate Recognition Domain, CRD),主要有存在于巨噬細(xì)胞表面的巨噬細(xì)胞甘露糖受體⑶206，存在于Langerhans細(xì)胞上的Langerin(CD207)，存在于樹突狀細(xì)胞上的 DC-SIGN (Dendritic cell specificICAM-3grabbing non_integrin),以及存在于肝竇內(nèi)表皮細(xì)胞上的甘露糖受體。針對(duì)樹突狀細(xì)胞上的特異性受體DC-SIGN，研究表明甘露糖對(duì)其有特異性結(jié)合，且其結(jié)合程度隨著寡糖鏈的增加而增加。針對(duì)肝臟疾病的治療方案是需基于高治療指數(shù)和肝臟靶向的給藥系統(tǒng)，為了實(shí)現(xiàn)肝臟靶向的給藥要求，構(gòu)建能傳遞至肝細(xì)胞內(nèi)的基因傳遞系統(tǒng)為當(dāng)務(wù)之急
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種基因載體材料，該基因載體材料能被細(xì)胞表面的甘露糖受體特異性識(shí)別，具有良好的肝臟靶向性；且毒性低，基因轉(zhuǎn)染效率高。一種基因載體材料，它為多聚糖6-羥基位接枝多胺形成的聚合物。若無特殊說明，本發(fā)明所述多聚糖6-羥基位是指多聚糖分子中各個(gè)單糖的6-羥基位。為能被細(xì)胞表面的甘露糖受體特異性識(shí)別，所述多聚糖優(yōu)選為殼聚糖、葡甘露聚糖或甘露聚糖。多聚糖的分子量優(yōu)選為l(T200kDa，該分子量范圍之外的多聚糖長度不適宜，會(huì)降低基因載體材料的轉(zhuǎn)染效率。多胺分子具有帶正電荷的氨基，有利于與具有帶負(fù)電荷的磷酸基的DNA或RNA結(jié)合，從而增強(qiáng)所述基因載體材料攜帶基因的能力，提高基因轉(zhuǎn)染效率。 本發(fā)明所述多胺優(yōu)選為精胺、亞精胺或腐胺，這些化合物在生物體中發(fā)揮重要功能，毒性較低。所述多胺的接枝率優(yōu)選為6 27%。本發(fā)明還提供了所述基因載體材料的制備方法，包括(I)將多聚糖用酰化試劑?；?，制備?；虚g體；(2)將所述酰化中間體與多胺反應(yīng)，獲得所述基因載體材料。由于多胺難以直接與羥基反應(yīng)而接枝到多聚糖上，因此，本發(fā)明利用酰化試劑對(duì)多聚糖6-羥基位進(jìn)行?；偻ㄟ^?；牧u基與多胺反應(yīng)，制備所述基因載體材料。所述酰化試劑優(yōu)選為羰基二咪唑、二環(huán)已基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺。優(yōu)選地，步驟(I)和(2)中的反應(yīng)均在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為三氯甲烷、四氫呋喃或二甲基亞砜。有機(jī)溶劑能將反應(yīng)原料、反應(yīng)中間體、反應(yīng)產(chǎn)物充分溶解并形成均一穩(wěn)定溶液，提供良好的反應(yīng)環(huán)境，促使反應(yīng)進(jìn)行完全。其中，步驟(I)中，所述?；噭┡c多聚糖中活性羥基的摩爾比優(yōu)選為3:廣18:1 ;所述?；姆磻?yīng)時(shí)間為l(T60min，反應(yīng)溫度為25飛(TC。合理的?；瘯r(shí)間及溫度保證了多聚糖的酰化程度。步驟(2)中，所述多胺與?；噭┑哪柋葍?yōu)選為1:廣3:1 ;反應(yīng)時(shí)間為12 48h，反應(yīng)溫度為25飛(TC。較長的反應(yīng)時(shí)間保證了反應(yīng)充分進(jìn)行。經(jīng)步驟(2)反應(yīng)獲得的反應(yīng)物經(jīng)透析純化后即獲得所述的基因載體材料。為維持較高的活性，優(yōu)選將該基因載體材料低溫凍干并保存在(T4°C下，凍干后的固體型基因載體材料經(jīng)復(fù)溶后也能在4°C下保存較長時(shí)間。本發(fā)明還提供了所述基因載體材料在制備基因轉(zhuǎn)染體系中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括將所述基因載體材料與目的基因混合，經(jīng)孵育后制備得到所述基因轉(zhuǎn)染體系。所述基因載體材料與基因的氮磷比優(yōu)選為1: f 40:1，在這一比例范圍內(nèi)，所述基因載體材料能充分結(jié)合DNA，從而達(dá)到攜載基因的效果。為達(dá)到更好的孵育效果，所述基因載體材料與基因加到緩沖液中進(jìn)行混合，所述緩沖液優(yōu)選為PH為7. 2 . 4的磷酸緩沖液。所述孵育的時(shí)間為l(T30min，合理的孵育時(shí)間確保了所述基因轉(zhuǎn)染體系的形成。所述基因轉(zhuǎn)染體系可加入到細(xì)胞中，完成目的基因在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染；也可直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，完成目的基因的肝臟靶向累積。
所述細(xì)胞優(yōu)選為細(xì)胞表面的甘露糖受體較高表達(dá)的細(xì)胞，更優(yōu)選為肝腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞中至少一種。所述轉(zhuǎn)染時(shí)間優(yōu)選為24 48h。不同氮磷比下結(jié)合獲得的所述基因轉(zhuǎn)染體系在不同細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率會(huì)有所差異。所述基因轉(zhuǎn)染體系對(duì)動(dòng)物體種類無過多限制，優(yōu)選為C57/BL6小鼠、BALB/c小鼠、DBA/2小鼠中的一種，靶向累積時(shí)間優(yōu)選為f4h。不同氮磷比下結(jié)合獲得的所述基因轉(zhuǎn)染體系都能將基因特異靶向動(dòng)物肝臟，但效果會(huì)有所差異。本發(fā)明基因載體材料適用于包括編碼蟲熒光素酶、綠色熒光蛋白、半乳糖苷酶等報(bào)告基因在內(nèi)的功能基因，也適用于其他各種實(shí)驗(yàn)所需的功能基因及功能性信使RNA、小干擾RNA等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為 (I)本發(fā)明的制備方法操作簡便，采用的反應(yīng)試劑及得到的產(chǎn)物無毒無污染，且成本低廉，具有較好的推廣性；反應(yīng)中無須加入特殊的催化劑，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少且純化簡單；能通過改變?cè)噭┍壤刂品磻?yīng)產(chǎn)物的接枝效率，具有良好的可控性；可廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究及生產(chǎn)；(2)本發(fā)明的基因載體材料能被細(xì)胞表面的甘露糖受體特異性識(shí)別，具有良好的肝臟靶向性；且具有低毒性和較高的基因轉(zhuǎn)染效率；在針對(duì)該受體的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染中均具有很好的研究及應(yīng)用前景。


圖1為甘露聚糖的紅外光譜圖；圖2為本發(fā)明基因載體材料的紅外光譜圖；圖3為甘露聚糖的核磁共振氫譜圖；圖4為精胺的核磁共振氫譜圖；圖5為本發(fā)明基因載體材料的核磁共振氫譜圖；圖6為不同氮磷比下結(jié)合的基因轉(zhuǎn)染體系的肝臟靶向效果圖；圖7為不同氮磷比下結(jié)合的基因轉(zhuǎn)染體系對(duì)H印G2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率圖；圖8為不同氮磷比下結(jié)合的基因轉(zhuǎn)染體系對(duì)樹突狀細(xì)胞DC2. 4的轉(zhuǎn)染效率圖；圖9為不同氮磷比下結(jié)合的基因轉(zhuǎn)染體系對(duì)H印G2細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)圖；圖10為不同氮磷比下結(jié)合的基因轉(zhuǎn)染體系對(duì)樹突狀細(xì)胞DC2. 4的毒性評(píng)價(jià)圖；圖11為競爭抑制劑存在下HepG2細(xì)胞對(duì)基因轉(zhuǎn)染體系的攝取率對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備基因載體材料( I)基因載體材料的制備I)將25mg甘露聚糖(平均分子量為IOOkDa)溶解于13mL無水二甲基亞砜中，60°C攪拌至完全溶解；加入213mg的羰基二咪唑?；?0min，得到?；母事毒厶侨芤?；2)將798mg的精胺溶解于15mL無水二甲基亞砜中，緩緩加入酰化的甘露聚糖溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)18h ；3)收集產(chǎn)物，以分子量為8000-12000WM透析袋透析48h，凍干成白色固定后置于4°C保存。(2)元素分析取獲得的基因載體材料進(jìn)行元素分析測試，結(jié)果如表I所示。計(jì)算可得精胺的接枝率為12. 07%。表I基因載體材料的元素分析表
權(quán)利要求
1.一種基因載體材料，其特征在于，它為多聚糖6-羥基位接枝多胺形成的聚合物。
2.如權(quán)利要求1所述的基因載體材料，其特征在于，所述多聚糖為殼聚糖、葡甘露聚糖或甘露聚糖。
3.如權(quán)利要求2所述的基因載體材料，其特征在于，所述多聚糖的分子量為10 200kDao
4.如權(quán)利要求1所述的基因載體材料，其特征在于，所述多胺為精胺、亞精胺或腐胺。
5.如權(quán)利要求1所述的基因載體材料，其特征在于，所述多胺的接枝率為6 27%。
6.—種權(quán)利要求1 5任一所述基因載體材料的制備方法,其特征在于,包括 (1)將多聚糖用?；噭；?，制備酰化中間體； (2)將所述酰化中間體與多胺反應(yīng)，獲得所述基因載體材料。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述?；噭轸驶溥?、二環(huán)己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺。
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述?；噭┡c多聚糖中活性輕基的摩爾比為3 :1 18 :1 ;所述?；姆磻?yīng)時(shí)間為10 60min,反應(yīng)溫度為25 60V。
9.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述多胺與?；噭┑哪柋葹?:1 3 I ;反應(yīng)時(shí)間為12 48h，反應(yīng)溫度為25°C 60°C。
10.如權(quán)利要求1 5任一所述基因載體材料在制備基因轉(zhuǎn)染體系中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因載體材料及其制備方法和應(yīng)用，該基因載體材料為多聚糖6-羥基位接枝多胺形成的聚合物，所述方法包括(1)將多聚糖用?；噭；?，制備酰化中間體；(2)將所述酰化中間體與多胺反應(yīng)，獲得所述基因載體材料。本發(fā)明還公開了所述基因載體材料在制備基因轉(zhuǎn)染體系中的應(yīng)用。本發(fā)明的基因載體材料能被細(xì)胞表面的甘露糖受體特異性識(shí)別，具有良好的肝臟靶向性；且具有低毒性和較高的基因轉(zhuǎn)染效率；在針對(duì)該受體的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染中均具有很好的研究及應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08B37/02GK103014065SQ20121056001
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者高建青, 阮桂鑫, 苗佩宏, 胡忠杰 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 中國人民武裝警察部隊(duì)浙江省總隊(duì)醫(yī)院