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      含有重復(fù)的二糖單元的非抗凝的葡糖胺聚糖及其醫(yī)藥用途

      文檔序號:3676657閱讀:810來源:國知局
      含有重復(fù)的二糖單元的非抗凝的葡糖胺聚糖及其醫(yī)藥用途
      【專利摘要】本發(fā)明涉及化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其具有10IU/mg以下的抗因子II活性、10IU/mg以下的抗因子Xa活性和約4.6至6.9kDa的平均分子量(Mw,重均分子量)。本發(fā)明還公開了制備修飾的葡糖胺聚糖的方法及其醫(yī)藥用途。
      【專利說明】含有重復(fù)的二糖單元的非抗凝的葡糖胺聚糖及其醫(yī)藥用途

      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明涉及新的具有低抗凝活性的修飾的葡糖胺聚糖及其制備方法。特別地,所 述制備方法適合于生產(chǎn)具有例如胃腸外注射后高生物利用度的和產(chǎn)生有利的儲存和處理 特性的高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的修飾的肝素和硫酸肝素。

      【背景技術(shù)】
      [0002] 肝素是多分散的、天然存在的抑制凝血的多糖,經(jīng)由所述凝血過程發(fā)生血栓形成。 肝素由不同長度和分子量的無支鏈多糖鏈組成。分子量從5000至超過40, 000道爾頓的鏈 構(gòu)成了醫(yī)藥級肝素。
      [0003] 天然來源的肝素(主要是豬腸或牛肺組織)可在治療上施用以預(yù)防和治療血栓形 成。然而,未分級肝素 (unfractionated heparin)的作用是難以預(yù)料的。在用未分級肝素 治療血栓形成期間,必須非常密切地監(jiān)測凝血參數(shù)以防止過強或過弱抗凝。
      [0004] 眾多品牌的肝素和低分子量肝素(LMWH),如達肝素和依諾肝素可用于依賴于它們 的抗凝血活性的治療方法。大量體外和動物實驗研究,甚至臨床試驗表明,肝素及其衍生物 還具有與其抗凝血作用相關(guān)的那些特性以外的有益特性。然而,由于與抗凝血作用相關(guān)的 出血風(fēng)險,現(xiàn)有的肝素和LMWH不適合用于治療其它醫(yī)學(xué)病癥。盡管LMWH與肝素相比代表 了顯著的臨床優(yōu)勢,但是這一類物質(zhì),顧名思義,仍保留可引起潛在的威脅生命的副作用的 較高的抗凝血活性。
      [0005] 因為LMWH可以皮下給予,并且不需要APTT監(jiān)測,因此LMWH允許深靜脈血栓形成 或肺栓塞等病癥的門診治療,所述病癥以前施用未分級肝素強制性住院治療。
      [0006] LMWH達肝素已被證明減少接受預(yù)防深靜脈血栓形成的婦女的滯產(chǎn)。該機制被認為 是涉及到達肝素誘導(dǎo)的增加的白介素水平,這導(dǎo)致有利的炎癥反應(yīng),并促進子宮頸成熟。另 夕卜,達肝素已被證明能增加子宮的收縮力(Acta Obstetricia et Gynecologica,2010 ;89 : 147-150)。
      [0007] 然而,出于若干原因,肝素和LMWH不適合用于預(yù)防或治療這樣的疾病。首先,由于 出血風(fēng)險,肝素和LMWH具有顯著的、眾所周知的抗凝血作用,限制其在妊娠晚期及分娩過 程中使用(無論是預(yù)防還是急性使用)。例如當給予硬膜外麻醉時(在孩子出生經(jīng)常采取 的措施),嚴格禁止使用達肝素。第二,肝素已與肝素引起的血小板減少聯(lián)系起來,所述血小 板減少是可以發(fā)生在任何肝素暴露的病人中的嚴重的免疫介導(dǎo)的藥物反應(yīng)。其是在病人使 用肝素5天或以上或者如果病人之前已經(jīng)肝素暴露而發(fā)展起來的,由肝素依賴性抗體引起 的潛在毀滅性的凝血疾病。肝素長期治療的另一種可能的不良影響是,它可能會導(dǎo)致骨頭 的去礦化,造成骨質(zhì)疏松。
      [0008] 已經(jīng)有許多嘗試,以消除或減少肝素或低分子量肝素的抗凝血活性,以提供低抗 凝肝素(LAH),其目的是從肝素鏈的抗凝血作用以外的其它潛在臨床效果中獲益,而不具有 與肝素有關(guān)的不良反應(yīng)的風(fēng)險(主要是出血)。然而,限于這種類型的肝素的臨床經(jīng)驗,至 今沒有這樣的產(chǎn)品被允許用于臨床。
      [0009] 歐洲專利1059304公開了酶促降解或氧化肝素從而得到具有低的抗凝血作用的 產(chǎn)品,其具有9至13kDa的平均分子量,其被建議用于神經(jīng)退行性疾病的治療。
      [0010] 美國專利4, 990, 502闡明了一種處理天然肝素的方法,以裂解負責(zé)抗凝血作用的 五糖殘基的殘基和隨后的解聚,其得到低抗凝血、平均分子量5. 8至7. OkDa的低分子量肝 素。在US4, 990, 502耗時的方法中,需要約15小時的滲析以終止氧化過程。這樣的過程會 影響最終產(chǎn)品的分子量分布。控制多糖鏈的分子量和長度是獲得合意的化合物的生物效應(yīng) 的關(guān)鍵。
      [0011] 長鏈肝素皮下給藥后的生物利用度低,肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HIT)誘導(dǎo)的可 能性也與鏈長度正相關(guān)。為了減少這些臨床上不需要的性質(zhì),肝素衍生物不應(yīng)該是全長度 的。某些分子量的肝素鏈可以通過標準肝素分級分離得到。然而,通過分級分離方法如凝 膠過濾法、醇沉淀和離子交換色譜法制得的中間或低分子量肝素衍生物與原料的顯著浪費 有關(guān),因為高分子量肝素被因此丟棄。
      [0012] 本發(fā)明,如在下面的段落中所概述的,描述了一種新的方法,其中多糖鏈被縮短, 并且將獲得一個合適的平均分子量分布,以有利于其臨床應(yīng)用并減少與最大多糖鏈有關(guān)的 風(fēng)險,以及原料損失最小化。

      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0013] 圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的低抗凝血肝素的合成方案。
      [0014] 圖2顯示藥物物質(zhì)的穩(wěn)定性研究結(jié)果。
      [0015] 圖3顯示藥物產(chǎn)物的穩(wěn)定性研究結(jié)果。


      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0016] 本發(fā)明涉及化學(xué)修飾的選自肝素和硫酸乙酰肝素的葡糖胺聚糖,其具有l(wèi)〇IU/mg 以下的抗因子Π活性,10IU/mg以下的抗因子Xa活性,和約4. 6至6. 9kDa的平均分子量 (重均分子量,Mw),其中:
      [0017] -對應(yīng)于1. 2至12kDa之間的分子量,多糖鏈具有2至20個(式I中的η)聚合二 糖單元;
      [0018] -主要出現(xiàn)的糖為(式I)
      [0019]

      【權(quán)利要求】
      1. 一種化學(xué)修飾的選自肝素和硫酸乙酰肝素的葡糖胺聚糖,其具有10iu/mg以下的抗 因子II活性,l〇IU/mg以下的抗因子Xa活性,和約4. 6至6. 9kDa的平均分子量(Mw),其 中: -對應(yīng)于1.2至12kDa之間的分子量,多糖鏈具有2至20個(式III中的η)二糖單 元; -所述多糖鏈基本上不含調(diào)節(jié)抗凝血作用的化學(xué)完整的糖序列;和 -主要出現(xiàn)的二糖為(式I)
      η是2至20的整數(shù)。
      2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中主要出現(xiàn)的多糖鏈具有6至12 之間個分子量為3. 6-7. 2kDa的二糖單兀。
      3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中至少70%的多糖鏈具 有至少3kDa以上的分子量。
      4. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其具有根據(jù)下表所示的多 糖分布及其相應(yīng)的以重量累積%表示的分子質(zhì)量:

      5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中所述多糖含有具有如 式I所示的還原性末端殘基的糖鏈。
      6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其含有作為在1H-NMR波譜 中的5. 0至6. 5之間的信號存在的非還原性末端不飽和葡糖胺,所述信號具有相對于來自 天然肝素的5. 42ppm處的信號4%以下的強度(比例% )。
      7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中所述葡糖胺信號存在于 6. 15ppm 和 5. 95ppm〇
      8. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中1%以下的總葡糖胺 含量被修飾。
      9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中所述修飾的葡糖胺包含非還原 性末端不飽和葡糖胺。
      10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中所述修飾的葡糖胺以在 ?-ΝΙ?波譜中的5. 95ppm和6. 15ppm處的信號存在。
      11. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中所述化學(xué)修飾的葡 糖胺聚糖基本上不含完整的非硫酸化艾杜糖醛酸和/或葡萄糖醛酸。
      12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中所述化學(xué)修飾的葡 糖胺聚糖為肝素。
      13. -種制備化學(xué)修飾的硫酸化的葡糖胺聚糖的方法,所述硫酸化的葡糖胺聚糖選自 肝素和硫酸乙酰肝素,所述化學(xué)修飾的硫酸化的葡糖胺聚糖具有l(wèi)〇IU/mg以下的抗因子II 活性、10IU/mg以下的抗因子Xa活性,以及約4. 6至6. 9kDa的平均分子量(Mw),所述方法 包含以下步驟: (a) 通過用高碘酸鹽處理,氧化葡糖醛酸和艾杜糖醛酸, (b) 消除或最小化氧化含碘化合物的影響, (c) 堿性條件下多糖鏈的解聚,和 (b)通過與還原劑的反應(yīng)還原并穩(wěn)定末端醛基。
      14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法,其中通過選自一個或兩個步驟的沉淀、淬滅的方法 進行步驟b),并且以一個直接序列進行步驟a)、b)、c)和d)。
      15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法,其中通過沉淀步驟(a)得到的產(chǎn)物進行步驟b。
      16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法,其中通過添加乙醇完成沉淀。
      17. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法,其中以直接序列進行步驟a)、b)、c)和d)。
      18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法,其中步驟a)的結(jié)束與步驟d)的開始所經(jīng)歷的時間 不超過約5小時。
      19. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法,其中通過添加淬滅劑進行步驟b)。
      20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法,其中所述淬滅劑是含有兩個相鄰羥基的任何化合 物。
      21. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法,其中于10°C以上的溫度進行高碘酸鹽氧化。
      22. 根據(jù)權(quán)利要求13-21任一項所述的方法,其中在初始葡糖胺聚糖濃度為約10-20% w/v的溶液中進行高碘酸鹽氧化。
      23. 根據(jù)權(quán)利要求13-22任一項所述的方法,其中所述氧化過程進行至少15小時,優(yōu)選 約18-24小時。
      24. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法,其中于約15±2°C的溫度,以約15%的葡糖胺聚糖濃 度,于約5的pH,進行高碘酸鹽氧化約18-24小時。
      25. 根據(jù)權(quán)利要求13-24任一項所述的方法,其中于約20°C以上的溫度進行解聚。
      26. 根據(jù)權(quán)利要求13-25任一項所述的方法,其中使葡糖胺聚糖衍生物富集具有約1. 2 至約12kDa的分子量的多糖鏈。
      27. 根據(jù)權(quán)利要求13-26任一項所述的方法,其中所述葡糖胺聚糖是肝素。
      28. 根據(jù)權(quán)利要求13-27任一項所述的方法制備的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖。
      29. 根據(jù)權(quán)利要求1-12和28任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中作為水性磷酸 鹽緩沖液的平均分子量于5°C穩(wěn)定至少36個月,優(yōu)選至少48個月。
      30. 根據(jù)權(quán)利要求1-12和28任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其中當以粉末儲存 時,平均分子量于25°C的溫度保持穩(wěn)定至少5年。
      31. -種藥物組合物,其包含治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-12和28任一項所述的化學(xué) 修飾的硫酸化葡糖胺聚糖和治療學(xué)上可接受的載體。
      32. 根據(jù)權(quán)利要求1-12和28任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其用于不依賴于抗 凝血作用的醫(yī)藥治療。
      33. 根據(jù)權(quán)利要求1-12和28任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖,其用于治療和預(yù)防 選自難產(chǎn)和其中內(nèi)皮和上皮層蛋白漏出為并發(fā)癥的病癥的疾病。
      34. 根據(jù)權(quán)利要求1-12和28任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖在制備用于不依賴 于抗凝血作用的醫(yī)藥治療的藥物中的用途。
      35. 根據(jù)權(quán)利要求1-12和28任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖用于制備治療和預(yù) 防選自難產(chǎn)和其中內(nèi)皮和上皮層蛋白漏出為并發(fā)癥的病癥的疾病的藥物中的用途。
      36. -種不依賴于抗凝血作用的疾病的治療方法,其中以治療有效量將根據(jù)權(quán)利要求 1-12任一項所述的化學(xué)修飾的葡糖胺聚糖施用給患者。
      37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法,其中所述疾病選自難產(chǎn)和其中內(nèi)皮和上皮層蛋白漏 出為并發(fā)癥的病癥。
      【文檔編號】C08B37/10GK104144950SQ201280062050
      【公開日】2014年11月12日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月19日
      【發(fā)明者】H-P·??死? P-O·埃里克森, U·林達爾, E·霍爾默 申請人:迪樂方有限責(zé)任公司
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