專利名稱：一種葉下珠多糖的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種葉下珠多糖TOLP III的提取分離方法。
背景技術(shù)：
珠^Phyllanthus urinaria L ),又名珍珠草、夜合草、陰陽草,屬于大戟科(Euphorbi aceae)葉下珠屬植物葉下珠的干燥全草，在民間廣泛用于利水解毒、平肝清熱。1988年，印度學(xué)者Thyagarajan等人[2]首次通過實(shí)驗(yàn)證明苦味葉下珠可以使59%患者的乙肝表面抗原(HBsAg)轉(zhuǎn)陰，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果引起了國內(nèi)外學(xué)者對葉下珠的關(guān)注。大量研究表明]葉下珠具有抗乙肝病毒、保肝降酶、抗肝纖維化、防止肝損傷和抗癌變的效果，且毒副作用低，是一種值得深入開發(fā)的治療乙型肝炎的天然藥材。葉下珠中含有多種化學(xué)成分，文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道過的有木脂素、萜類、黃酮、糅質(zhì)、生物堿等，包括正十八烷、去氫訶子次酸、阿魏酸、沒食子酸、短葉蘇木酚酸、丁二酸、甲氧基糅花酸、山茶素、老鶴草素、短葉蘇木酸甲脂、短葉蘇術(shù)酚酸乙脂、柯里拉京、去氫訶子次酸三甲月旨、多糖等等。多糖類化合物具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗消化性潰瘍、抗凝血、降血糖、降血脂、抗輻射、抗血栓、抗水腫、抗毒物損傷等多種生物活性。乙型病毒性肝炎(HBV)是全球性的公共衛(wèi)生問題，根據(jù)全球衛(wèi)生組織(WHO)數(shù)據(jù)，全世界有3. 5 4. O億乙肝病毒感染者，其中每年有近100萬患者死于HBV感染引起的肝功能衰竭、肝硬化和肝癌_。目前應(yīng)用于乙型肝炎治療的藥物主要是干擾素和核苷類似物，然而這些藥物只能獲得某種程度上的治療效果，對大多數(shù)病人達(dá)不到完全治愈的目的，并且停藥后會(huì)出現(xiàn)反跳的現(xiàn)象。所以開發(fā)研制高效、低毒、不“反跳”的乙肝治療新藥是一個(gè)刻不容緩的問題。在尋找乙肝治療藥物的過程中，中藥多糖成分越來越受到人們的重視。葉下珠具有抗乙肝病毒，保肝，抗腫瘤等功效已得到普遍證實(shí)，并且相關(guān)學(xué)者也對其中的幾種化學(xué)成分，如沒食子酸、黃酮類及葉下珠素等做了結(jié)構(gòu)和生物活性的研究，但對其中的多糖研究卻很少。開展對葉下珠中多糖成分的提取分離，結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性的檢測，有利于進(jìn)一步確定葉下珠用于治療乙型肝炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，更好地開發(fā)葉下珠這一藥用植物資源，為尋找乙肝治療新藥打下理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種葉下珠多糖TOLP III的提取分離方法，通過對葉下珠粗多糖的分離純化，得到了純凈單一的葉下珠多糖成分。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明所述的葉下珠多糖PULP III的提取分離方法，包括如下步驟
O葉下珠全草蒸餾水洗滌去土，干燥后，粉碎，用石油醚脫脂，乙醇脫小分子糖后，藥渣用水浸提，浸提液離心分離，取濾液濃縮后加入一定體積的乙醇醇沉，取醇沉物即為粗總多糖；粗總多糖經(jīng)2)除蛋白，3)洗滌，除雜和4)透析，干燥即得葉下珠精總多糖(PULP)，多糖含量在95%以上。5)總多糖各組分分離純化經(jīng)過脫蛋白，透析處理后的葉下珠精總多糖(PULP)，過離子交換柱，依次用適宜的NaCl梯度溶液洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，得洗脫曲線，從曲線上能夠明顯宣示出四個(gè)峰形對稱的洗脫峰，分別代表四個(gè)組分，按照出峰的順序分別記為I3ULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV。其中第2個(gè)、第3個(gè)兩個(gè)洗脫峰較大，收集第3主峰組分，濃縮，重蒸水透析48h，冷凍干燥得葉下珠多糖I3ULP III純組分。所述的葉下珠多糖TOIPIII，為土黃色片狀固體，是一類不含有N、S元素酸性多糖，相對平均分子量為418793. 5 PULPIII單糖組成及其比例為鼠李糖(Rha):阿拉伯糖(Ara):甘露糖(Man):葡萄糖(Glc)為 O. 27:0. 28:0. 1:0. 35 ;主鏈由 Rha, Ara, Man 和 Glc 組成。各單糖通過吡喃糖苷鍵連接，糖苷鍵以I — 6連接為主，同時(shí)還存在I — 4和I — 3連接方式。上述步驟I)優(yōu)選條件是粉碎的葉下珠粉末，用石油醚浸沒藥材且液面高出藥材O. 5 1cm，在80°C和常壓力回流提取3次，每次2小時(shí)，棄去回流液。藥渣繼續(xù)用50 100%乙醇按同樣方法在80°C °C下回流提取3次，每次2小時(shí)，棄去回流液。藥渣再用90 °〇水浸提3次，每次2小時(shí)，合并3次浸提液進(jìn)行離心分離，離心速度4000r/min，取濾液濃縮至原體積1/4，加入4倍體積的95%乙醇，靜置24h，離心，取醇沉物即為粗多糖。步驟2)除蛋白即用Sevag法脫蛋白將步驟I)得到的醇沉物用蒸餾水復(fù)溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液的優(yōu)選體系是粗多糖溶液氯仿和正丁醇混合液以體積比計(jì)量是3 :1，混合液=氯仿正丁醇=4:1(體積比計(jì)量),磁力攪拌30min,充分靜置分層，棄去沉淀。重復(fù)7 8次后直至界面無白色沉淀。步驟3)洗滌，除雜的優(yōu)選條件是在除蛋白后的多糖溶液中加入4倍體積的95%乙醇沉淀24h，離心，棄濾液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重復(fù)3次。步驟4)透析， 干燥即醇沉洗滌后濾渣加適量蒸餾水，充分復(fù)溶后透析，透析在磁力攪拌下進(jìn)行，樣品液與透析液(蒸餾水)體積比優(yōu)選條件為1:20，8h換一次水，透析72h。透析完畢后將糖溶液放入冷凍干燥機(jī)中干燥得葉下珠總多糖(PULP)，經(jīng)測定本發(fā)明總多糖(PULP)含量在95%以上。步驟5)的離子交換柱為DEAE-52陰離子交換樹脂，使用前將DEAE-52纖維素填料進(jìn)行處理，其優(yōu)選條件使用蒸餾水浸泡48h，期間3h換一次水，并用傾瀉法除去懸浮雜質(zhì)，然后進(jìn)行堿一酸一堿處理。先用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性，再用O. 5 mol/L的HCl溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，最后用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，得到0!Γ型纖維素。濕法裝柱(柱尺寸為500 X 50mm)，蒸餾水平衡48h，裝柱過程中避免氣泡及斷層現(xiàn)象。步驟5)的較適宜NaCl的物質(zhì)的量濃度的梯度范圍=0 lmol/L的NaCl梯度溶液。步驟5)優(yōu)選的NaCl的物質(zhì)的量濃度的梯度溶液分別為0、0. U0. 25,0.5,O.75mol/L。步驟5)依次用適宜的NaCl梯度溶液洗脫，較優(yōu)化的操作是每種NaCl的物質(zhì)的量濃度溶液洗脫8小時(shí)，流速4mL/min，用管收集洗脫液，每IOmin收集一管。步驟5)所述的洗脫曲線是為以收集的管序(管數(shù))為橫坐標(biāo)，溶液的光吸收度為縱坐標(biāo)繪圖而得到。本發(fā)明所述的葉下珠多糖TOIP III，具有一定的抗氧化、抗乙肝病毒活性。本發(fā)明的有益效果通過對葉下珠粗多糖的分離純化，得到了純凈單一的葉下珠多糖成分。通過對多糖的純組分PULP III的結(jié)構(gòu)分析及體外抗氧化、抗病毒活性實(shí)驗(yàn)的研究，確證了葉下珠多糖是葉下珠治療乙肝的有效成分，這為研究葉下珠多糖的抗乙肝病毒作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)；同時(shí)，對葉下珠多糖組分PULP III的理化性質(zhì)，元素組成，官能團(tuán)，單糖組成比例及糖苷鍵位置進(jìn)行了初步分析，為以后葉下珠多糖分子結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步深入研究提供理論基礎(chǔ)。今后可在此基礎(chǔ)上，結(jié)合多糖的構(gòu)效關(guān)系，進(jìn)一步開發(fā)以葉下珠多糖為原材料的抗乙肝病毒藥物奠定基礎(chǔ)。


圖1是葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2是多糖梯度洗脫曲線。圖3是H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的規(guī)律。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明
葉下珠多糖的提取
葉下珠全草蒸餾水洗滌去土，50°C低溫干燥后，粉碎，密封備用。其粉末為黃綠色。石油醚80 1回流脫脂一95%乙醇80 1回流脫小分子糖一90 °C水回流提取3次，合并3次濾液4000r/m in離心，濃縮至1/4體積一加入4倍體積的95%乙醇，靜置24h，離心，蒸懼水復(fù)溶一sevag法除蛋白(氯仿正丁醇=4:1,多糖溶液混合液=3:1),磁力攪拌30min，充分靜置分層，重復(fù)7 8次操作即可除去游離蛋白質(zhì)一除蛋白后的多糖溶液加入4倍體積的95%乙醇沉淀24h —依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重復(fù)三次一透析72h —冷凍干燥得葉下珠總多糖(PULP)。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和樣品供試液的制備
精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(在105°C下干燥到重量不再發(fā)生變化)10mg，用蒸餾水溶解后，置于IOOmL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成O. lmg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，備用。精密稱取干燥至恒重的葉下珠多糖10mg，用蒸餾水溶解后，置于IOOmL容量瓶中加蒸懼水定容至刻度，搖勻，制成O. lmg/mL的樣品供試液備用。吸收波長的確定
取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各I mL,分別加入ImL 5%苯酹溶液(取5g重蒸苯酹于IOOmL棕色容量瓶中加蒸餾水定容)，搖勻后，懸空垂直加入5mL濃硫酸，置沸水浴中加熱15min，然后置冷水浴中冷卻，在400 600 nm范圍內(nèi)全波長掃描，確定吸收波長。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液O. 2,0. 4,0. 6,0. 8、ImL于IOmL具塞刻度試管中，依次添加水使終體積為ImL,空白對照為ImL水,然后加入ImL 5%苯酹溶液搖勻,迅速加入5mL濃硫酸(懸空垂直加入)，置沸水浴中加熱15min,然后置冷水浴中冷卻，于490nm處測定吸光度。以吸光度為Y軸，葡萄糖質(zhì)量為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。
糖含量的計(jì)算
精密吸取供試液lmL，于490nm處測定吸光度。按照公式計(jì)算糖含量
糖含量=C / (C0X V) X 100%
C :由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖微克數(shù) C0 :樣品溶液的濃度(O.1 mg/mL)
V :測定時(shí)用的樣品溶液體積(1. OmL)
多糖的提取率
多糖的提取率=多糖的質(zhì)量/原材料的質(zhì)量X 100 %
樣品溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的最大吸收峰波長都在490 nm左右處，所以選取490 nm作為多糖含量的測定波長。以吸光度為Y軸，葡萄糖微克數(shù)( μ g)為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1，可以看出在20 100 μ g范圍內(nèi)，葡萄糖量與吸光度有良好的線性關(guān)系。測得樣品液的吸光度A為 O. 388，根據(jù)回歸方程計(jì)算其相應(yīng)葡萄糖的微克數(shù)為28. 27 μ g。根據(jù)公式得糖含量
糖含量=C / (C0X V) X 100%=28. 27/(0. 1X1) X 100%=28. 27%
多糖的提取率==1. 5/100X 100 %=1. 5%
本實(shí)驗(yàn)通過石油醚脫脂，再以95%的乙醇脫去低聚糖等小分子物質(zhì)，然后以水提醇沉法從葉下珠中分離出多糖，并采用sevag法脫蛋白，苯酚一硫酸法測定其含量，其最大吸收波長為490nm，多糖提取率為1. 5%，糖含量為28. 27%。葉下珠多糖的分離純化 柱分離
DEAE-52填料預(yù)處理
DEAE-52纖維素填料用蒸餾水浸泡48h，期間4 5h換一次水，并用傾瀉法除去懸浮雜質(zhì)，然后進(jìn)行堿-酸-堿處理。先用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性，再用O. 5 mol/L的HCl溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，最后用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，得到0H_型纖維素。濕法裝柱(柱尺寸為500 X 50mm)，蒸餾水平衡48h，裝柱過程中避免氣泡及斷層現(xiàn)象。過DEAE-52層析柱分離純化
稱取640mg葉下珠總多糖溶于80mL重蒸水中(8 mg/mL),過O. 45 μ m濾膜后上樣。依次用 0、0· 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl 梯度洗脫，每 IOmin 收集一管，流速 4mL/min ;苯酚-硫酸法跟蹤檢測，收集各主峰組分，濃縮，重蒸水透析48h，冷凍干燥得葉下珠多糖各組分。SephadexG-200葡聚糖凝膠過濾法
的預(yù)處理SephadexG-200填料加適量蒸懼水浸泡24h,期間4 5h換一次水，并用傾瀉法除去懸浮雜質(zhì)，然后超聲脫氣直到凝膠液中沒有氣泡出現(xiàn)為止。濕法裝柱(柱尺寸為500X25mm)，用O. 05 mol/L的NaCl溶液平衡48 h后備用。柱層析將上面收集的各組分配制成25mg/mL的樣品液，上樣2mL，用O. 05 mol/L的NaCl洗脫。自動(dòng)部分收集器收集，每管5 mL,每30 min收集一管，苯酚-硫酸法跟蹤檢測。
HPLC高效液相色譜法
將純化后的各組分多糖配制成lmg/mL的樣品液,過O. 45 μ m的濾膜后進(jìn)樣。高效液相色譜條件
色譜柱PolySep-SEC 4000 Part No: 00H-3144-K0 Column Size :300 X 7. 8mm ；
檢測器示差檢測器；柱溫30°C;流動(dòng)相雙蒸水；流速0. 8 mL/min ;進(jìn)樣量20 μ L。柱層析分離結(jié)果
經(jīng)過脫蛋白，透析處理后的葉下珠精多糖(PULP)，過DEAE - 52離子交換柱，依次用O、O. U0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl溶液梯度洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，得如圖2所示中洗脫曲線。由圖2可以看出，TOLP經(jīng)DEAE-52柱層析分離后，能夠明顯分離出四個(gè)峰形對稱的洗脫峰，分別代表四個(gè)組分，記為I3ULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV。收集含量較大的組分PULP III做進(jìn)一步分析。柱和HPLC純度鑒定 SephadexG-200 柱結(jié)果
取葉下珠多糖組分I3ULP III過S印hadexG-200凝膠柱，NaCl洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，用吸光度值與洗脫管數(shù)作洗脫曲線，PULP III在Sephadex G-200柱上的洗脫曲線是對稱的單一峰，說明TOLP III組分是分子量相對均一的多糖組分。HPLC法純度鑒定
利用HPLC法檢測葉下 珠多糖組分TOLP III的純度時(shí)，結(jié)果顯示，經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離純化后的多糖組分PULP III，在高效液相圖譜上峰型比較對稱，且經(jīng)過面積歸一法計(jì)算其純度達(dá)到95%以上，與S印hadex G-200凝膠色譜圖結(jié)果相吻合，說明純度比較高，可以用來做結(jié)構(gòu)鑒定。水提醇沉脫蛋白后的葉下珠多糖經(jīng)過DEAE-52纖維素柱分離純化后得到四個(gè)組分，分別記為PULP1、PULP I1、PULP III和PULP IV。收集含量較大的組分PULP III，用SephadexG-200凝膠柱層析法和高效液相色譜法(HPLC)兩種方法進(jìn)行純度鑒定，證明其組分相對均一，可以進(jìn)一步做結(jié)構(gòu)分析。III的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析 狀態(tài)、溶解性試驗(yàn)
稱取適量分離純化后的多糖組分PULP III溶解于純水、無水乙醇、丙酮、乙醚和乙酸乙酯等溶劑，觀察其溶解性。卻三酮反應(yīng)
取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中，加入1. OmL O. 5%茚三酮試劑，沸水浴5min，冷卻后觀察顏色變化，若出現(xiàn)紫紅色，則證明有蛋白質(zhì)，反之則無。以蒸餾水和小牛血清溶液作為對照。Molish 反應(yīng)
取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中，滴加兩滴Molish試劑,搖勻。傾斜試管,沿管壁加入約ImL濃硫酸，小心豎直后，2 3min后仔細(xì)觀察兩層液面交界處的顏色變化，若有紫紅色出現(xiàn)，則證明有糖類物質(zhì)。以蒸餾水和淀粉溶液作為對照。苯酹一硫酸反應(yīng)
取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中，加入ImL 5%的苯酹,再加入5mL濃硫酸,振蕩，若呈橙黃色，說明含糖。以蒸餾水為對照。碘-碘化鉀反應(yīng)
取1. OmL1. Omg/mL的樣品溶液，滴加250 μ L碘-碘化鉀溶液后，若不顯藍(lán)色，說明此多糖為非淀粉類。以蒸餾水為陰性對照，O. 5%的淀粉指示液為陽性對照。硫酸一咔唑反應(yīng)
取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中，在冰水浴中向管中加入6mL濃硫酸，搖勻后置于85°C水浴中20min，取出冷卻至室溫，加入O. 2mL 0.1%的咔唑液，室溫下保持2h，若有紫紅色物質(zhì)出現(xiàn)，說明含有糖醛酸，是酸性糖，以蒸餾水為陰性對照。斐林反應(yīng)
取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中,加入過量的斐林試劑,煮沸2 min,若產(chǎn)生紅色的氧化亞酮沉淀，則證明含還原糖。三氯化鐵試驗(yàn)
取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中，調(diào)節(jié)pH值為4 5，加入1%的三氯化鐵水溶液，若出現(xiàn)藍(lán)、墨綠或藍(lán)紫色，則證明含有鞣質(zhì)類或酚類。

硫酸基定性試驗(yàn)
取2mg多糖樣品，加入1. OmL lmol/L HCl, 110°C密閉水解3h，然后滴加0. 5mL的氯化鋇-明膠試劑，若有白色沉淀生成，說明含有硫酸基。法測定分子量 高效液相色譜條件
色譜柱PolySep-SEC 4000 Part No: 00H-3144-K0 Column Size :300 X 7. 8mm ；
檢測器示差檢測器；柱溫30°C;流動(dòng)相雙蒸水；流速0. 8 mL/min ;進(jìn)樣量20 μ L。樣品溶液的制備
將多糖組分PULP III配制成濃度為lmg/mL的溶液，以10000r/min離心10 min后，過0.45 μ m濾膜，備用。標(biāo)準(zhǔn)對照溶液
將各種已知分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品系列(T-10、T-20、T-110、T-500、T-2000)配制成濃度為lmg/mL的溶液，處理方法同樣品溶液，備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
將各種已知分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品由小分子到大分子依次平均進(jìn)樣3次，記錄相應(yīng)的保留時(shí)間tK和色譜圖，以保留時(shí)間tK為橫坐標(biāo)，分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。I3ULP III相對分子質(zhì)量的測定
將上面配制好的樣品溶液各進(jìn)樣三次，HPLC色譜條件同標(biāo)準(zhǔn)品一樣，記錄相應(yīng)的保留時(shí)間tK和色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程計(jì)算分子量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
采用硫酸咔唑法測定糖醛酸含量。配制0. 2mg/mL的葡萄糖醛酸溶液25mL，依次量取 0. 25,0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5mL 上述溶液，定容于 IOmL 容量瓶中，制成 5、10、20、30、40、50 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液置4°C冰箱中備用。量取5mL硼砂硫酸溶液(0. 025 mol/L)于具塞試管中，冰浴，然后將ImL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液小心加入酸液層上方，以蒸餾水作為空白對照，邊搖勻(先輕輕搖勻，后劇烈搖晃)邊冰浴冷卻。然后將試管在沸水浴中加熱lOmin，冷卻至室溫后加入O. 2mL咔唑溶液(O. 125%的無水乙醇溶液)，搖勻，沸水加熱15min，冷卻至室溫，測定530nm處的吸光值，以葡萄糖醛酸的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中糖醛酸含量的測定
將多糖組分PULP III配成5 μ g/mL的溶液，操作同上，測定其在530nm處的吸光值。蛋白質(zhì)和核酸測定
將純化后的多糖組分PULP III配制成lmg/mL的多糖水溶液，用UV紫外分光光度計(jì)在200 400nm范圍內(nèi)掃描看其在260nm(核酸)，280nm (Pr)處是否有吸收峰，以判定有無蛋白質(zhì)和核酸的存在。、H、N元素分析
分別稱取兩份完全干燥的PULP III樣品2. 5mg,采用Elementar Vario EL III元素分析儀測定C、H、N的含量。IR)的檢測
取2mg多糖樣品，用溴化鉀(KBr)壓片后在400 4000CHT1波長范圍內(nèi)做紅外光譜分析。采用糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法進(jìn)行單糖組成測定。根據(jù)出峰時(shí)間可以確定樣品的單糖組成成分，根據(jù)出峰面積可以確定單糖的組成比例。單糖糖腈乙酸酯衍生化分別稱取鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)，甘露糖(Man)各10 mg，分別加入IOmg鹽酸輕胺，O. 5 mL卩比唳振蕩后，90 °C水浴30 min，并不時(shí)振蕩，取出冷卻至室溫后，加入O. 5 mL乙酸酐，于90 °〇水浴中?；?0 mim，得到的產(chǎn)物即是糖腈乙酸酯衍生物，直接注入GC分析。多糖糖腈乙酸酯衍生化稱取多糖10mg，加入2mol/L三氟乙酸5mL，110°C真空封管水解4h后，在40°C下減壓濃縮至干，然后加入4mL甲醇，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，重復(fù)3 4次，以除去三氟乙酸。然后加入10 mg鹽酸羥胺和O. 5 mL吡啶，放入90°C水浴加熱反應(yīng)30 min，并不時(shí)振蕩取出后冷至室溫，加入0.5 mL醋酸酐，在90°C水浴中繼續(xù)反應(yīng)30min進(jìn)行乙?；?，反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行氣相色譜分析
色譜條件
色譜柱0V1701 (30. O mXO. 32 ymXO. 25 μ m)毛細(xì)管柱；
進(jìn)樣口溫度250 V ；(FID )檢測器溫度240 V ；
載氣壓力0.4 MPa;程序升溫150 °C下保持4 min，然后以10 °C /min升至200 °C,保持 8 min,再以 15 °C/min 升至 280min。取20mg PULP III多糖組分，用2mL O. 05mol/L三氟乙酸進(jìn)行部分酸水解，水解16h后離心，沉淀進(jìn)行GC分析。上清液中加入甲醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，重復(fù)3 4次除去三氟乙酸，然后用水復(fù)溶后，透析袋(分子截留量3500)透析。透析結(jié)束后，袋外部分真空干燥后進(jìn)行GC分析；袋內(nèi)部分加入4倍體積的乙醇醇析，上清部分和醇沉部分分別真空干燥后進(jìn)行GC分析。smith 降解
高碘酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取6支干燥試管，按下表操作制作標(biāo)準(zhǔn) 曲線
權(quán)利要求
1.一種葉下珠多糖PULP III的提取分離方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟O葉下珠全草蒸餾水洗滌去土，干燥后，粉碎，用石油醚脫脂，乙醇脫小分子糖后，藥渣用水浸提，浸提液離心分離，取濾液濃縮后加入乙醇醇沉，取醇沉物即為粗總多糖；粗總多糖經(jīng)2)除蛋白，3)洗滌，除雜和4)透析，干燥即得葉下珠精總多糖，多糖含量在95%以上；5) 多糖各組分分離純化經(jīng)過脫蛋白，透析處理后的葉下珠精總多糖，過離子交換柱，依次用適宜的NaCl梯度溶液洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，得洗脫曲線，從曲線上能夠明顯宣示出四個(gè)峰形對稱的洗脫峰，分別代表四個(gè)組分，按照出峰的順序分別記為PULP I ,PULP I1、 PULP III和I3ULP IV ;其中第2個(gè)、第3個(gè)兩個(gè)洗脫峰較大，收集第3主峰組分，濃縮，重蒸水透析48h，冷凍干燥得葉下珠多糖I3ULP III純組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖PULPIII的提取分離方法，其特征在于步驟I)粉碎的葉下珠粉末，用石油醚浸沒藥材且液面高出藥材O. 5 1cm，在70 90°C和常壓力回流提取2 4次，每次I 3小時(shí)，棄去回流液；藥渣繼續(xù)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 100%的乙醇溶液按同樣方法在80 95°C下回流提取2 4次，每次I 3小時(shí)，棄去回流液；藥渣再用 60 95°C水浸提3次，每次I 3小時(shí)，合并3次浸提液進(jìn)行離心分離，離心速度2000 6000r/min，取濾液濃縮至原體積1/4，加入4倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90 100%的乙醇溶液， 靜置24h，離心，取醇沉物即為粗多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖PULPIII的提取分離方法，其特征在于步驟2)除蛋白即用Sevag法脫蛋白將步驟I)得到的醇沉物用蒸餾水復(fù)溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液，其中粗多糖溶液氯仿和正丁醇混合液的體積比為I 6 :1 3 ;混合液中氯仿正丁醇的體積比為I 4 :1 4 ;磁力攪拌20 40min,充分靜置分層，棄去沉淀；重復(fù)I 10后直至界面無白色沉淀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖PULPIII的提取分離方法，其特征在于步驟3)洗滌，除雜在除蛋白后的多糖溶液中加入3 6倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75 100%的乙醇溶液沉淀12 36h，離心，棄濾液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗，重復(fù)2 5次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖PULPIII的提取分離方法，其特征在于步驟4)透析，干燥即醇沉洗滌后濾渣加適量蒸餾水，充分復(fù)溶后透析，透析在磁力攪拌下進(jìn)行，樣品液與透析液即蒸餾水的體積比為1:10 30，4 8h換一次水，透析12 120h ;透析完畢后將糖溶液放入冷凍干燥機(jī)中干燥得葉下珠精總多糖，含量在95%以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖PULPIII的提取分離方法，其特征在于步驟5)的離子交換柱為DEAE-52陰離子交換樹脂，使用前將DEAE-52纖維素填料用蒸餾水浸泡48h， 期間4 5h換一次水，并用傾瀉法除去懸浮雜質(zhì)，然后進(jìn)行堿一酸一堿處理；先用O. 5 mol/ L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性，再用O. 5 mol/L的HCl溶液浸泡30 min 后蒸懼水洗至中性，最后用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性,得到 0!1_型纖維素；濕法裝柱，柱尺寸為500 X 50mm，蒸餾水平衡48h，裝柱過程中避免氣泡及斷層現(xiàn)象。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖PULPIII的提取分離方法，其特征在于步驟5)的 NaCl梯度溶液的物質(zhì)的量濃度為O 3mol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的葉下珠多糖PULPIII的提取分離方法，其特征在于步驟5)的 NaCl梯度溶液的物質(zhì)的量濃度分別為0、0. 1,0.25,0. 5,0. 75mol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖PULPIII的提取分離方法，其特征在于步驟5)依次用適宜的NaCl梯度溶液洗脫，每種NaCl的物質(zhì)的量濃度溶液洗脫8小時(shí)，流速4mL/min， 用管收集洗脫液，每IOmin收集一管。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖PULPIII的提取分離方法，其特征在于步驟5) 洗脫曲線為以收集的管序?yàn)闄M坐標(biāo)，溶液的光吸收度為縱坐標(biāo)繪圖而得到。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葉下珠多糖PULPⅢ的提取分離方法，包括如下步驟葉下珠全草蒸餾水洗滌去土，干燥后，粉碎，用石油醚脫脂，乙醇脫小分子糖后，藥渣用水浸提，浸提液離心分離，取濾液濃縮后加入乙醇醇沉，醇沉物經(jīng)除蛋白，洗滌，除雜和透析后干燥即得葉下珠精總多糖，經(jīng)過脫蛋白，透析處理后，過離子交換柱，依次用適宜的NaCl梯度溶液洗脫，苯酚－硫酸法跟蹤檢測，得洗脫曲線，收集第3主峰組分，濃縮，重蒸水透析48h，冷凍干燥得葉下珠多糖PULPⅢ純組分。本發(fā)明通過對葉下珠粗多糖的分離純化，得到了純凈單一的葉下珠多糖成分。
文檔編號(hào)C08B37/00GK103044567SQ20131000570
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月8日
發(fā)明者李清祿, 李宇翔, 李凌峰, 張麗麗, 謝勇平, 周學(xué)酬, 黃志堅(jiān) 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)