專利名稱：酶處理提取鎖陽(yáng)多糖的方法及鎖陽(yáng)多糖抗腫瘤制劑的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥有效成分的提取方法，具體的涉及一種鎖陽(yáng)多糖的制備方法和鎖陽(yáng)多糖抗腫瘤制劑的制備。
背景技術(shù)：
鎖陽(yáng)(Cynomorium songaricum Rupr.),又名鐵棒槌、銹鐵棒、地毛球、烏蘭高腰(蒙語(yǔ))，是鎖陽(yáng)科(Cynomoriaceae)鎖陽(yáng)屬的單科單屬單種植物，多寄生于蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬(Nityaria L)植物根部,全寄生種子植物,主產(chǎn)于甘肅、新疆、青海、寧夏、內(nèi)蒙古等地，其中尤其以甘肅河西走廊地區(qū)分布最廣。在中醫(yī)上，把鎖陽(yáng)植物的去花序干燥莖用做傳統(tǒng)的中藥鎖陽(yáng)，又名“不老藥”等。明代《本草綱目》記述:“鎖陽(yáng)性溫，補(bǔ)腎，益精血，潤(rùn)燥養(yǎng)精治痿弱”。《本草原始》鎖陽(yáng)補(bǔ)陰血、祛虛火、興陽(yáng)固精、強(qiáng)陽(yáng)益髓”，中醫(yī)臨床用鎖陽(yáng)補(bǔ)陽(yáng)氣，治陽(yáng)痿精虛，陰衰血竭，老年氣弱陰虛等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，鎖陽(yáng)具有清除自由基、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性。多糖是鎖陽(yáng)重要的有效成分，具有提高免疫力，抗衰老，抗疲勞等多種活性。蘇韞等研究表明鎖陽(yáng)多糖對(duì)D-半乳糖所致衰老模型大鼠脾臟病理變化、脾淋巴細(xì)胞免疫功能、自由基代謝相關(guān)指標(biāo)等具有明顯改善作用(可參考文獻(xiàn)《鎖陽(yáng)對(duì)衰老模型大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、脾病理學(xué)變化及血清SOD、MDA、NO水平的影響》，<中國(guó)老年學(xué)雜志>，2009年，第8期)。熊正英等研究結(jié)果表明鎖陽(yáng)多糖可以提高運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠不同組織SOD (超氧化物歧化酶)和CAT(過(guò)氧化氫酶 )活性，降低MDA (丙二醛)含量，延長(zhǎng)大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間，具有抗疲勞作用(可參考文獻(xiàn)《鎖陽(yáng)多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠抗氧化水平與運(yùn)動(dòng)能力的影響》，<遼東學(xué)院學(xué)報(bào)>，2011年，第4期)。本發(fā)明人研究表明鎖陽(yáng)多糖在體外對(duì)宮頸癌HeLa腫瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌SW620腫瘤細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。目前關(guān)于鎖陽(yáng)多糖提取工藝已有較多研究，已公開的發(fā)明專利，授權(quán)公告號(hào)為CN101580553 B，專利名稱為《一種鎖陽(yáng)多糖的制備方法》，該專利的技術(shù)以中藥鎖陽(yáng)為材料，采用以超聲波輔助、微波高效提取鎖陽(yáng)多糖。已公開的發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?01210119296.X，專利名稱為《一種從鎖陽(yáng)中制備鎖陽(yáng)萜和鎖陽(yáng)多糖的方法》，該專利的技術(shù)是將干燥的鎖陽(yáng)藥材粉碎成粒狀物進(jìn)行超臨界萃取提取鎖陽(yáng)萜和鎖陽(yáng)多糖。再如本行業(yè)的業(yè)類技術(shù)人員劉曄瑋等以浸膏得率和浸膏中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)綜合評(píng)價(jià)，利用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)，從水提和醇沉兩方面優(yōu)選鎖陽(yáng)中水溶性多糖的最佳提取工藝條件；(可參考文獻(xiàn)《鎖陽(yáng)多糖提取工藝的研究》，<天然產(chǎn)物研究與開發(fā)>，2006年，1007-1009)。王晉等以鎖陽(yáng)多糖提取率為考察指標(biāo)對(duì)水提醇沉提取鎖陽(yáng)多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，鎖陽(yáng)多糖的提取最佳工藝:提取溫度為90°C，料液比為1: 10，提取時(shí)間為2h;(可參考文獻(xiàn)《不同條件對(duì)鎖陽(yáng)多糖提取率的影響》，<內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)>，2008年，第6期，540-542)。李貴文等以多糖得率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)考察超聲提取時(shí)間、提取溫度、料液質(zhì)量比、超聲波功率4個(gè)因素對(duì)超聲提取鎖陽(yáng)多糖的影響，篩選超聲輔助提取鎖陽(yáng)多糖的最佳工藝；(可參考文獻(xiàn)《超聲輔助提取鎖陽(yáng)多糖的工藝優(yōu)化》，<甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)>，2011年，第5期，157-160)。羅光宏等采用水提醇沉法，利用L9(33)正交試驗(yàn)優(yōu)選鎖陽(yáng)多糖的提取工藝，用硫酸苯酚比色法對(duì)甘肅河西沙區(qū)不同地區(qū)鎖陽(yáng)中多糖含量進(jìn)行測(cè)定。提取最佳工藝條件為料液比1:15 (g/mL)、提取時(shí)間90min、提取次數(shù)為2次，甘肅河西沙區(qū)不同地區(qū)鎖陽(yáng)多糖含量差別顯著；(可參考文獻(xiàn)《甘肅河西沙區(qū)鎖陽(yáng)多糖提取工藝優(yōu)化及含量測(cè)定》，<食品科學(xué)>，2011年，第10期，79-83)。上述方法均對(duì)鎖陽(yáng)多糖提取工藝進(jìn)行研究，為鎖陽(yáng)活性多糖的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但是在工藝推廣至工業(yè)化生產(chǎn)上仍存在以下不足:①傳統(tǒng)水提法產(chǎn)率較低，提取時(shí)間較長(zhǎng)，耗能較大，提取成本較高；②微波和超聲波輔助提取鎖陽(yáng)多糖有提取時(shí)間短，提取率高的特點(diǎn)，但相對(duì)成本較高，并且目前適合于工業(yè)生產(chǎn)的設(shè)備尚未成熟；③超臨界萃取鎖陽(yáng)多糖具有原料利用率高，產(chǎn)品收率高等優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備復(fù)雜，運(yùn)行成本高。多糖等植物活性成分通常被包含在植物材料(如細(xì)胞壁、果膠等)中，在多糖的提取過(guò)程中，使用酶可在比較溫和的條件中分解植物組織，加速多糖的釋放或提取，達(dá)到提高提取率的效果。已授權(quán)的發(fā)明專利CN 101580553 B，專利名稱為《酶法輔助提取蒺藜多糖的方法》，該專利采用酶法(纖維素酶、木聚糖酶及果膠酶)輔助提取蒺藜多糖，可使多糖的提取率比不加酶處理的提高18-40.67%，純度提高15-42%。已授權(quán)的發(fā)明專利CN02158188.6，專利名稱為《酶處理提取黃芪多糖》，該專利的技術(shù)使用纖維素酶、半纖維素酶及蛋白酶提取黃芪多糖，相對(duì)于水提醇沉法和微波法，提取速度和提取效率均有明顯的提高。但尚未見到酶處理法提取鎖陽(yáng)多糖和鎖陽(yáng)多糖抗腫瘤制劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述現(xiàn)有 技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供一種利用生物酶提取鎖陽(yáng)多糖的方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，可提高鎖陽(yáng)多糖的提取率及其多糖含量，具有條件溫和、雜質(zhì)易除和得率高等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)鎖陽(yáng)多糖低成本的工業(yè)化生產(chǎn)。采用本發(fā)明所述的方法制備鎖陽(yáng)多糖提取物純度聞，可直接制備鎖陽(yáng)多糖制劑，具有提聞免疫力，抗疲勞、抗腫瘤等多種功效，適用于腫瘤患者。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種酶處理提取鎖陽(yáng)多糖的方法及鎖陽(yáng)多糖抗腫瘤制劑的制備，其特征在于包含以下步驟:I)粉碎過(guò)篩:將干燥的鎖陽(yáng)粉碎后過(guò)60目篩；2)浸泡:按質(zhì)量份數(shù)取I份過(guò)篩后的鎖陽(yáng)粉末放入帶攪拌的提取罐內(nèi)，添加10-25份的蒸餾水，然后升溫至75-90°C，并在75-90°C保溫靜置15-60分鐘；3)酶解:浸泡結(jié)束后降溫至25_55°C后添加酶制劑，并打開攪拌裝置，轉(zhuǎn)速調(diào)至20-40轉(zhuǎn)/分，25-55°C保溫?cái)嚢?_6小時(shí)，進(jìn)行酶解反應(yīng)；4)滅酶和高速攪拌:將浸泡液加熱至80_95°C，轉(zhuǎn)速調(diào)至120-2000轉(zhuǎn)/分，并保溫10-20分鐘，使加入的酶制劑變性失活，并通過(guò)高速攪拌破碎細(xì)胞；5)濃縮、醇沉、過(guò)濾及干燥:將步驟4)結(jié)束后攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)至10-40轉(zhuǎn)/分，80_95°C保溫20-60分鐘，隨后冷卻至室溫，過(guò)濾，收集濾液；得到的濾液減壓濃縮至原質(zhì)量的40-60%，加入95%乙醇，使溶液中乙醇終濃度為75-85%，靜置2_4小時(shí)過(guò)濾后得到鎖陽(yáng)濕多糖，真空干燥或低溫冷凍干燥，然后粉碎，即獲得鎖陽(yáng)多糖成品。所述步驟3)中酶制劑為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或幾種，酶的加入量為鎖陽(yáng)粉末質(zhì)量5%。-10% ;蛋白酶可使糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質(zhì)水解，降低它們對(duì)原料的結(jié)合力，有利于多糖的浸出；纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶水解纖維素、半纖維素和果膠，使植物組織細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂，多糖易從胞內(nèi)或細(xì)胞壁釋放。一種酶處理提取鎖陽(yáng)多糖的方法及鎖陽(yáng)多糖抗腫瘤制劑的制備，其特征是采用本發(fā)明所述的方法制備鎖陽(yáng)多糖提取物純度高，可加入賦型劑或矯味劑和防腐劑制成抗腫瘤膠囊制劑或抗腫瘤口服液。本發(fā)明的有益效果是:I)鎖陽(yáng)多糖主要存在與細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞壁中，本發(fā)明方法在提取過(guò)程中添加酶制齊U，可在比較溫和的條件下降解細(xì)胞壁，并通過(guò)高速攪拌造成無(wú)細(xì)胞壁細(xì)胞破碎，促進(jìn)多糖的釋放，達(dá)到提高提取率的效果。本發(fā)明方法相對(duì)于傳統(tǒng)的水提醇沉法可使鎖陽(yáng)多糖提取率提高10-65%，并可使鎖陽(yáng)多糖含量提高5-40%。2)本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單、提取成本較低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。采用本發(fā)明所述的方法制備鎖陽(yáng)多糖提取物純度高，可直接制備鎖陽(yáng)多糖制劑，具有提高免疫力、抗疲勞、抗腫瘤等多種功效，適用于腫瘤患者。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例I 鎖陽(yáng)多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果實(shí)驗(yàn)

供試細(xì)胞:結(jié)腸癌SW620細(xì)胞和子宮頸癌HeLa細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法:取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化、Hank’ s液洗滌后，用含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至lX105/ml。向96孔培養(yǎng)板各孔中分別加入上述細(xì)胞懸液100 μ 1，在5% C02、37°C和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組每孔加入用含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液配制的不同濃度的鎖陽(yáng)多糖100 μ 1，對(duì)照組每孔加入10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液100 μ 1，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72h。終止實(shí)驗(yàn)前4h，取培養(yǎng)板，每孔加入5mg/mL MTT試劑20 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，PBS沖洗，加DMSO100 μ 1，振蕩混勻15min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀492nm測(cè)值(0D值的大小與活細(xì)胞數(shù)的多少成線性正比)，重復(fù)3次，取平均值。按公式“抑制率=(1-藥物孔OD值/對(duì)照孔OD值)X 100%",計(jì)算體外對(duì)SW620細(xì)胞和HeLa細(xì)胞增殖的抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:鎖陽(yáng)多糖在10-160 μ g/ml劑量下對(duì)SW620細(xì)胞和HeLa細(xì)胞具有直接抑制作用，而且隨著劑量增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。表I鎖陽(yáng)多糖對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種酶處理提取鎖陽(yáng)多糖的方法，其特征在于，所述酶處理提取鎖陽(yáng)多糖的方法包含以下步驟: 1)粉碎過(guò)篩:將干燥的鎖陽(yáng)粉碎后過(guò)60目篩； 2)浸泡:按質(zhì)量份數(shù)取I份過(guò)篩后的鎖陽(yáng)粉末放入帶攪拌的提取罐內(nèi)，添加10-25份的蒸餾水，然后升溫至75-90°C，并在75-90°C保溫靜置15-60分鐘； 3)酶解:浸泡結(jié)束后降溫至25-55°C后添加酶制劑，并打開攪拌裝置，轉(zhuǎn)速調(diào)至20-40轉(zhuǎn)/分，25-55°C保溫?cái)嚢?-6小時(shí)，進(jìn)行酶解反應(yīng)； 4)滅酶和高速攪拌:將浸泡液加熱至80-95°C，轉(zhuǎn)速調(diào)至120-2000轉(zhuǎn)/分，并保溫10-20分鐘，使加入的酶制劑變性失活，并通過(guò)高速攪拌破碎細(xì)胞； 5)濃縮、醇沉、過(guò)濾及干燥:將步驟4)結(jié)束后攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)至10-40轉(zhuǎn)/分，80-95°C保溫20-60分鐘，隨后冷卻至室溫，過(guò)濾，收集濾液；得到的濾液減壓濃縮至原質(zhì)量的40-60%，加入95%乙醇，使溶液中乙醇終濃度為75-85%，靜置2-4小時(shí)過(guò)濾后得到鎖陽(yáng)濕多糖，真空干燥或低溫冷凍干燥，然后粉碎，即獲得鎖陽(yáng)多糖成品。
2.如權(quán)利要求1所述的酶處理提取鎖陽(yáng)多糖的方法，其特征在于，所述酶制劑為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種或幾種，酶的加入量為鎖陽(yáng)粉末質(zhì)量5%。-10%。
3.一種利用權(quán)利要求1所述的酶處理提取鎖陽(yáng)多糖的方法制備的鎖陽(yáng)多糖用于制備 抗腫瘤制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鎖陽(yáng)多糖的制備方法和鎖陽(yáng)多糖抗腫瘤制劑的制備方法，鎖陽(yáng)多糖主要存在與細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞壁中，本發(fā)明方法在提取過(guò)程中添加酶制劑，可在比較溫和的條件下降解細(xì)胞壁，并通過(guò)高速攪拌造成無(wú)細(xì)胞壁細(xì)胞破碎，促進(jìn)多糖的釋放，達(dá)到提高提取率的效果。本發(fā)明方法相對(duì)于傳統(tǒng)的水提醇沉法可使鎖陽(yáng)多糖提取率提高10-65％，并可使鎖陽(yáng)多糖含量提高5-40％。本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單、提取成本較低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。采用本發(fā)明所述的方法制備鎖陽(yáng)多糖提取物純度高，可直接制備鎖陽(yáng)多糖制劑，具有提高免疫力、抗疲勞、抗腫瘤等多種功效，適用于腫瘤患者。
文檔編號(hào)C08B37/00GK103145863SQ20131001513
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者羅光宏 申請(qǐng)人:甘肅凱源生物技術(shù)開發(fā)中心