專利名稱：殼聚糖6-OH固載環(huán)糊精衍生物的制備方法及其在H₂O₂檢測電化學傳感器膜材料中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法及其在H2O2檢測電化學傳感器膜材料中的應(yīng)用，屬于高分子材料的制備與改性領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
殼聚糖由于其來源豐富，價格低廉，易于化學修飾，可與酶結(jié)合，具有良好的成膜性、生物相容性、生物可降解性、滲透性、親水性、機械強度等優(yōu)異性能，在生物傳感器用功能膜材料中具有重要的應(yīng)用價值。目前文獻報道的通過殼聚糖構(gòu)筑傳感器膜的文獻報道中，主要是通過殼聚糖的2-NH2實現(xiàn)對酶的固定作用，通過電活性物質(zhì)(電子媒介體)與膜的摻雜促進電極與酶之間電子的傳遞。但摻雜一方面影響膜結(jié)構(gòu)均勻性及催化反應(yīng)的穩(wěn)定性，同時電子媒介體在膜中的穩(wěn)定性也不好，膜的使用壽命受到顯著影響。與殼聚糖相比，以環(huán)糊精的疏水性空腔包絡(luò)有機電子媒介體，促進酶反應(yīng)中心的電子轉(zhuǎn)移到電極表面，既避免了電子媒介體的流失又保證了電子媒介體有充分的流動性，使傳感器具有較高的靈敏度和較好的穩(wěn)定性。但環(huán)糊精本身無法成膜，為使環(huán)糊精在傳感器電極表面均勻分散，主要是通過其與PVC、PVA、PDMS、PU等通過共混的方式成膜。由于環(huán)糊精結(jié)構(gòu)相對較穩(wěn)定，較難引入膜內(nèi)，或者在膜內(nèi)難以控制其位置，使得制得的膜的均勻性和穩(wěn)定性較差。將環(huán)糊精在殼聚糖的 分子鏈上通過化學方法進行固載，可將殼聚糖的易成膜，易在電極表面固定，可固載酶，易修飾等性能與環(huán)糊精空腔良好的包合作用相結(jié)合，發(fā)揮各自優(yōu)勢，制備出性能優(yōu)異的傳感器用功能膜材料。但目前制備的殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物中，環(huán)糊精主要固載在殼聚糖較易于改性的2-NH2上。對于傳感器用功能膜材料而言，若在殼聚糖2-NH2上固載體積較大的環(huán)糊精大環(huán)化合物，將產(chǎn)生較大的位阻，影響在殼聚糖2-NH2上酶的固定，并使2-NH2通過交聯(lián)作用與電極表面結(jié)合的位點減少，破壞殼聚糖衍生電極膜材料的固載穩(wěn)定性和均勻性。在殼聚糖的6-0H定位取代環(huán)糊精，同時保留其2-NH2，可制得性能優(yōu)異的殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物，但目前文獻所報道的固載方法均存在一定的缺陷，環(huán)糊精的固載效率不高，均小于50 μ mo I.g—1。環(huán)糊精固載率較低時，固載的疏水性空腔難以包埋足夠的電子媒介體，導致電子媒介體的傳遞效果變差。專利CN201110441171.4提出了一種通過點擊化學反應(yīng)制備具有高固載率的殼聚
糖6-0H定位固載環(huán)糊精衍生物的制備方法。該方法的反應(yīng)方程式為:
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 具體制備步驟為: 第一步:殼聚糖2-NH2保護衍生物的制備 1)稱取I份殼聚糖溶于30 400份的質(zhì)量濃度為0.1% 10%的醋酸的水溶液中； 2)將I 10份鄰苯二甲酸酐溶于30 400份有機化合物A中后滴加到I)得到的反應(yīng)體系中，在O 80°C下攪拌反應(yīng)0.5 8小時；然后加入溶劑B使產(chǎn)生的殼聚糖衍生物沉淀析出，用有機溶劑C洗滌2次以上以除去多余鄰苯二甲酸酐化合物，然后50 80°C下真空干燥得到鄰苯二甲酸酐保護的殼聚糖衍生物a ； 有機化合物A為乙醇、乙醚、苯或DMF ； 有機溶劑B為甲醇、丙酮或乙腈； 有機溶劑C為乙醇、乙醚或苯； 第二步:殼聚糖2-NH2保護，6-OH對甲苯磺酰酯化衍生物的制備將I份第一步得到的鄰苯二甲酸酐化殼聚糖衍生物a溶解在20-400份的有機溶劑D中，向其中加入10 100份的對甲苯磺酰氯的有機溶液E，I 60分鐘滴完，然后在-10 80°C下反應(yīng)0.5 8小時，抽濾，得淺黃色固體，用有機溶劑F洗去未反應(yīng)的對甲苯磺酰氯，在50 80°C下真空干燥得到殼聚糖衍生物b ； 有機溶劑D為D MF，DMSO或DMAc ； 有機溶液E中的溶劑為三氯甲烷、丙酮、N-甲基吡咯烷酮或DMSO ;有機溶液E中對甲苯磺酰氯的質(zhì)量濃度為2% 40% ； 有機溶劑F為三氯甲烷、丙酮或N-甲基吡咯烷酮； 第三步:殼聚糖2-NH2保護，6-0H疊氮化衍生物的制備 稱取I份第二步得到的殼聚糖衍生物b溶于10 60份的有機溶劑G中，O 80°C下攪拌使之溶解，加入I 10份的疊氮化鈉，在20 100°C條件下攪拌反應(yīng)I 8小時，反應(yīng)結(jié)束后，使用50 300份水沉淀，用水洗滌析出物，最后依次用有機溶劑H和水洗滌2次以上，抽濾后50 100°C真空干燥得到殼聚糖的疊氮化衍生物c ； 有機溶劑G為DMF、DMSO或DMAc ； 有機溶劑H為甲醇、乙醇、丙酮、乙腈或四氫呋喃； 第四步:環(huán)糊精單對甲苯磺?；苌锏闹苽? O稱取I份β -環(huán)糊精，加入3 20份質(zhì)量濃度為0.2% 5%的堿I的水溶液中，在-10 50°C下攪拌使β -環(huán)糊精完全溶解； 2)將0.5 5份對甲苯磺酰氯溶解于I 10份的有機溶劑J中，用恒壓滴液漏斗在5 30分鐘內(nèi)滴加到I)得到的反應(yīng)體系中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)0.5 6小時后，加入氯化銨調(diào)節(jié)溶液的PH值到7 9，有大量的白色物質(zhì)析出；用去離子水和有機溶劑J分別清洗抽濾2次以上，然后將濾餅在50 80°C下真空干燥得到環(huán)糊精的對甲苯磺?；苌飀 ； 堿I為NaOH、KOH或氨水； 有機溶劑J為三氯甲烷、丙酮、N-甲基吡咯烷酮或DMSO ； 第五步:環(huán)糊精單炔基化衍生物的制備 將I份第四步得到的對甲苯磺酰化衍生物d和I 10份炔丙胺或炔丙醇分散在10 150份的水和有機溶劑K的混合物中，在20 80°C、N2保護下，攪拌反應(yīng)12 48小時后，加入沉淀劑L，析出沉淀，過濾，用水、有機溶劑K洗滌2次以上后，將濾餅在50 80°C下真空干燥得到環(huán)糊精的單炔基化衍生物e ； 有機溶劑K為乙醇、丙醇、DMF或DMSO ； 水和有機溶劑K的混合物中水與有機溶劑O的質(zhì)量比為1:9 9:1 ; 沉淀劑L為乙腈、丙酮、四氫呋喃或N-甲基吡咯烷酮； 第六步:點擊化學反應(yīng)制備殼聚糖2-NH2保護，6-0H定位固載化環(huán)糊精衍生物 1)稱取I份第三步得到的殼聚糖的疊氮化衍生物c，溶解于I 30份的有機溶劑M中； 2)稱取0.01 0.1份CuSO4.5H20分散于I 10份有機溶劑N中，加入0.01 0.1份抗壞血酸鈉及0.01 0.5份水,增進溶解； 3)將I)得到的溶液和2)得到的溶液進行混合； 4)稱取I 5份第五步得到的環(huán)糊精的單炔基化衍生物e加入3)得到的混合溶液中，在O 80°C下攪拌反應(yīng)0.5 8小時，停止反應(yīng)，加入沉淀劑O后，用水洗滌2次以上，將濾餅在50 80°C下真空干燥得到鄰苯二甲酸酐化殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物f ； 有機溶劑M為DMSO、DMF或DMAc ； 有機溶劑N為乙醇、丙醇、DMF或DMSO ； 沉淀劑O為乙腈、丙酮、四氫呋喃或N-甲基吡咯燒酮； 第七步:2-NH2的脫保護反應(yīng)及殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的獲得將I份第六步得到的鄰苯二甲`酸酐化殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物f浸泡在20 200份的水合肼溶液中(其中H2NNH2與H2O的摩爾比為1:0.5 1:3)，20 60°C下加熱攪拌反應(yīng)12 36小時，用有機溶劑P沉淀后，用有機溶劑Q洗滌兩次后在50 80°C下真空干燥得到殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物g ； 有機溶劑P為甲醇、丙酮或乙腈； 有機溶劑Q為乙醇、乙醚或苯。
2.如權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第二步的殼聚糖2-NH2保護，6-0H對甲苯磺酰酯化衍生物的制備，其具體制備方法為: 將I份第一步得到的鄰苯二甲酸酐化殼聚糖衍生物a溶解在20-100份的有機溶劑D中，向其中加入20 60份的對甲苯磺酰氯的有機溶液E，10 40分鐘滴完，然后在-10 80°C下反應(yīng)3 6小時，抽濾，得淺黃色固體，用有機溶劑F洗去未反應(yīng)的對甲苯磺酰氯，在50 80°C下真空干燥得到殼聚糖衍生物b ； 有機溶劑D為DMF，DMSO或DMAc ； 有機溶液E中的溶劑為三氯甲烷或DMSO ;有機溶液E中對甲苯磺酰氯的質(zhì)量濃度為2% 40% ； 有機溶劑F為三氯甲烷、丙酮或N-甲基吡咯烷酮。
3.如權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第三步的殼聚糖2-NH2保護，6-0H疊氮化衍生物的制備，其具體制備方法為: 稱取I份殼聚糖衍生物b溶于20 40份的有機溶劑G中，O 80°C下攪拌使之溶解，加入I 4份的疊氮化鈉，在50 90°C條件下攪拌反應(yīng)3 6小時，反應(yīng)結(jié)束后，使用50 300份水沉淀，用水洗滌析出物，最后依次用有機溶劑H和水洗滌2次以上，抽濾后50 80°C真空干燥得到殼聚糖的疊氮化衍生物c ； 有機溶劑G為DMF、DMSO或DMAc ； 有機溶劑H為乙醇、丙酮或四氫呋喃。
4.如權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第四步的環(huán)糊精單對甲苯磺酰化衍生物的制備，其具體制備方法為: O稱取I份β -環(huán)糊精，加入5 12份質(zhì)量濃度為0.5% 2%的堿I的水溶液中，在-10 30°C下攪拌使β -環(huán)糊精完全溶解； 2)將I 3份對甲苯磺酰氯溶解于I 5份的有機溶劑J中，用恒壓滴液漏斗在10 20分鐘內(nèi)滴加到I)得到的反應(yīng)體系中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)I 3小時后，加入氯化銨調(diào)節(jié)溶液的pH值到7 9，有大量的白色物質(zhì)析出；用去離子水和有機溶劑J分別清洗抽濾2次以上，然后將濾餅在50 80°C下真空干燥得到環(huán)糊精的對甲苯磺酰化衍生物d ； 堿I為NaOH或KOH ； 有機溶劑J為三氯甲烷或DMSO。
5.如權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第五步的環(huán)糊精單炔基化衍生物的制備，其具體制備方法為: 將I份第四步得到的對甲苯磺酰化衍生物d和I 5份炔丙胺或炔丙醇分散在20 70份的水和 有機溶劑K的混合物中，在40 70°C、N2保護下，攪拌反應(yīng)20 30小時后，力口入沉淀劑L，析出沉淀，過濾，用水、有機溶劑K洗滌2次以上后，將濾餅在50 80°C下真空干燥得到環(huán)糊精的單炔基化衍生物e ； 有機溶劑K為乙醇或DMSO ； 水和有機溶劑K的混合物中水與有機溶劑O的質(zhì)量比為3:7 7:3 ; 沉淀劑L為乙腈或四氫呋喃。
6.如權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第六步的點擊化學反應(yīng)制備殼聚糖2-順2保護，6-0H定位固載化環(huán)糊精衍生物，其具體制備方法為: 1)稱取I份殼聚糖的疊氮化衍生物c，溶解于5 15份的有機溶劑M中； 2)稱取0.01 0.05份CuSO4.5Η20分散于I 10份有機溶劑N中，加入0.01 0.05份抗壞血酸鈉及0.01 0.2份水增進溶解； 3)將I)得到的溶液和2)得到的溶液進行混合； 4)稱取I 5份第五步得到的環(huán)糊精的單炔基化衍生物e加入3)得到的混合溶液中，在20 60°C下攪拌反應(yīng)3 6小時，停止反應(yīng)，加入沉淀劑O后，用水洗滌2次以上，將濾餅在50 80°C下真空干燥得到鄰苯二甲酸酐化殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物f ； 有機溶劑M為DMSO、DMF或DMAc ； 有機溶劑N為乙醇或DMSO ; 沉淀劑O為乙腈或四氫呋喃。
7.如權(quán)利要求1所述的一種殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的制備方法，其特征是: 其中第七步的2-NH2的脫保護反應(yīng)及殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物的獲得，其具體制備方法為: 將第六步得到的I份鄰苯二甲酸酐化殼聚糖固載環(huán)糊精衍生物f浸泡在30 100份的水合肼溶液中(其中H2NNH2與H2O的摩爾比為1:0.5 1:2)，20 40°C下加熱攪拌反應(yīng)12 20小時，用有機溶劑P沉淀后，用有機溶劑Q洗滌兩次后在50 80°C下真空干燥得到殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物g ； 有機溶劑P為甲醇、丙酮或乙腈； 有機溶劑Q為乙醇、乙醚或苯。
8.一種利用權(quán)利要求1、2、3、4、5、6或7所述的殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物制備用于H2O2電化學檢測的生物傳感器膜材料的方法，其特征是: 具體制備步驟如下: 第一步:殼聚糖6-0 H固載環(huán)糊精衍生物包合電子媒介體的制備將殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物g溶于溶劑R中；再將溶于溶劑S的電子媒介體的溶液加入上述溶液中；然后將反應(yīng)體系在30 90°C油浴中回流攪拌反應(yīng)I 8小時；反應(yīng)完畢后，用去離子水沉淀包合物，用溶劑S洗去未發(fā)生包合的電子媒介體，干燥，得殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合電子媒介體產(chǎn)物； 其中殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物在溶劑R中的濃度為0.001 0.05mol/L ;殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物g與電子媒介體的摩爾投料比1: 0.5 1:10，電子媒介體在溶劑S中的摩爾濃度為0.lmol/L 15mol/L ； 溶劑 R 為:DMF，DMSO，DMAc ； 溶劑S為:四氫呋喃，乙腈，乙醚，N-甲基吡咯烷酮； 電子媒介體為:二茂鐵，氫醌，四硫富瓦烯中的一種； 第二步:殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合電子媒介體-固載過氧化氫酶的制備將第一步得到的殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合電子媒介體產(chǎn)物溶解于溶劑R中，使該溶液的摩爾濃度為0.001 0.05mol/L ;將過氧化氫酶加入pH=7的0.05 0.2mol/L的PBS緩沖溶液中，配制成質(zhì)量濃度為10.0 50.0mg/mL的過氧化氫酶溶液； 稱取I份的殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合電子媒介體溶液，按照過氧化氫酶占溶液用量為0.0005 0.01份加入過氧化氫酶溶液，在4 70攝氏度反應(yīng)0.5 10小時后，加入0.0001 0.008份的戊二醛，在4 70攝氏度再反應(yīng)0.5 10小時后，加入5 40份的去離子水，攪拌后離心分離，抽濾，用去離子水洗滌固體產(chǎn)物，洗去未發(fā)生交聯(lián)的戊二醛，抽濾，用0.05 0.2mol/L的PBS緩沖溶液洗去未發(fā)生固定化的過氧化氫酶，制得殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包結(jié)電子媒介體-固載過氧化氫酶產(chǎn)物，即為用于H2O2電化學檢測的生物傳感器膜材料。
9.一種利用權(quán)利要求8所述的殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合電子媒介體-固載過氧化氫酶產(chǎn)物對H2O2進行電化學生物檢測的方法，其特征是: 首先將殼聚糖6-0H固載環(huán)糊精衍生物包合電子媒介體-固載過氧化氫酶產(chǎn)物修飾在玻碳電極表面；再配制不同濃度的H2O2標準溶液，測量修飾后電極在各H2O2標準溶液的循環(huán)伏安曲線，將所有循環(huán)伏安曲線中峰電流與H2O2標準溶液濃度作圖，得到該修飾電極的對H2O2的有效檢測范圍及工作曲線，最后測量修飾后電極在H2O2待測溶液的循環(huán)伏安曲線，對應(yīng)該修飾電極的工作曲線，得到待測溶液中H2O2的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殼聚糖6-OH固載環(huán)糊精衍生物的制備方法及其在H2O2檢測電化學傳感器膜材料中的應(yīng)用，屬于高分子材料的制備與改性領(lǐng)域。本發(fā)明以鄰苯二甲酸酐保護殼聚糖2-NH2，通過點擊化學反應(yīng)在其6-OH位置固載環(huán)糊精后，再以水合肼脫除殼聚糖2-NH2的保護，制得在水和部分有機溶劑中具有良好溶解性的，具有高固載率的殼聚糖6-OH定位固載環(huán)糊精衍生物。將本發(fā)明制得的殼聚糖6-OH固載環(huán)糊精衍生物的環(huán)糊精疏水性空腔中固載電子媒介體，殼聚糖吡喃環(huán)的2-NH2固載過氧化氫酶后，修飾在玻碳電極的表面，形成用于對H2O2含量檢測用的電化學生物傳感器膜材料。本發(fā)明使殼聚糖6-OH固載環(huán)糊精衍生物在以酶催化作用配合電化學檢測的酶基生物傳感器中的應(yīng)用成為可能。
文檔編號C08B37/16GK103102491SQ20131004095
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者陳煜 , 葉彥春, 李偉萍, 郭燕文 申請人:北京理工大學