專利名稱：表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡聚合物整體柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種原位聚合法制備表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子印跡聚合物整體柱的方法。
背景技術(shù)：
分子印跡技術(shù)是指以特定的分子為模板，制備對該分子有特殊識別功能和高選擇性材料的技術(shù)，通常被人們描述為制造識別“分子鑰匙”的“人工鎖”技術(shù)。它將模板分子、單體、交聯(lián)劑溶解在一定的溶液中形成預(yù)聚合溶液，經(jīng)過聚合反應(yīng)形成具有與模板分子在空間結(jié)構(gòu)上完全匹配、并與模板分子特異性結(jié)合的功能基的三維空穴的聚合物。當(dāng)前MIP的制備方法很多，主要有:(I)本體聚合法；(2)懸浮聚合法；(3)分散聚合法；(4)沉淀聚合法；(5)表面印跡聚合法等等。但這些方法存在一些缺陷，如本體聚合制備的MIP，必須經(jīng)過研磨、篩分等處理。但在研磨過程中不可避免地破壞部分結(jié)合位點，得到粒子形狀不均勻，最終MIP的產(chǎn)率只有50%左右；懸浮聚合法制備平均粒徑小于10 μ m的MIP時，產(chǎn)物的單分散性和規(guī)整性都急劇下降，且亞微米級的微球難以得到；分散聚合法制備過程較為復(fù)雜，且所用到的分散劑和惰性分散體系昂貴；沉淀聚合法產(chǎn)率低；表面模板聚合法制備方法雖然較為簡單，但只能進(jìn)行少部分特定分子的印跡，應(yīng)用范圍較窄。此外，上述方法在實際應(yīng)用前都需要經(jīng)過繁瑣的裝柱技術(shù)。原位聚合是近期發(fā)展的制備MIP的新技術(shù)，可通過一步聚合完成反應(yīng)，在空的色譜柱內(nèi)用該法形成的整體柱通過洗脫除去模板分子后可直接應(yīng)用。該技術(shù)的關(guān)鍵是針對不同的模板分子尋找具有合適的致孔劑體系和聚合體系，以獲得具有良好的通透性、選擇性及高柱效的MIP整體柱。表沒食子兒茶素沒食子酸酯為茶多酚中最有效的活性成分，具有顯著的抗突變、抗氧化作用，能夠增強免疫系統(tǒng)功能，抑制肝脂和膽固醇的增長，抑制腫瘤的生長，對痢疾、傷寒、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌也有極強的抑制作用?，F(xiàn)已被列為潛在的抗癌藥物在中美等國被研究。由于表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)與兒茶素中其它組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)十分相近，而且極易氧化，聚(縮)合，因而很難得到高純度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)單體。因此對分離提純表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)單體的研究具有很重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種原位聚合制備表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡聚合物整體柱的方法，該方法將預(yù)聚合混合溶液直接注入到不銹鋼管柱內(nèi)制備連續(xù)棒形聚合物，得到具有固定空穴大小和形狀、有確定排列功能團(tuán)、識別模板分子的交聯(lián)高聚物材料，即分子印跡聚合物(MIP)。經(jīng)該方法得到的分子印跡聚合物(MIP)整體柱不僅具有印跡效果，而且具有滲透性好的優(yōu)點，印跡因子可達(dá)3.09，同時該方法制備過程簡單，內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻，重現(xiàn)性好，避免了繁瑣的裝柱手續(xù)，可直接用于分析。本發(fā)明所述的一種表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡聚合物整體柱的制備方法，采用原位聚合法制備，具體操作按下列步驟進(jìn)行a、將質(zhì)量百分?jǐn)?shù)模板分子為表沒食子兒茶素沒食子酸酯2. 88-5. 6%、功能單體為丙烯酰胺5. 1-5. 45%、交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯72. 62-74. 71%、致孔劑為聚苯乙烯溶于四氫呋喃的溶液5. 28-5. 50%混合，再加入異辛烷10. 5-10. 53%，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈O. 90-0. 93%進(jìn)行混合，超聲20分鐘，使其均勻，澄清，然后轉(zhuǎn)移到干凈的不銹鋼管柱中，超聲脫氣15分鐘，將不銹鋼管柱兩端封住，于溫度60°C的恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)20-28小時；b、將不銹鋼管柱取出并連接到HPLC的高壓泵上，先用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑，然后用甲醇和乙酸的混合液沖洗至除去模板分子，流速由O. lml/mim逐漸增大，沖洗液總體積為150ml，即可得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子印跡整體柱。步驟a中的致孔劑聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液中的濃度為40mg/ml。步驟a中的不銹鋼管柱為100 X 4. 6mm1. D.。步驟b中甲醇和乙酸的混合液為體積比甲醇乙酸=9:1。本發(fā)明所述的表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡聚合物整體柱的制備方法，該方法首次采用原位聚合合成表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子印跡聚合物整體柱，該方法通過將預(yù)聚合溶液注入到空的色譜柱中，在柱管內(nèi)一步完成聚合；該方法制備過程簡單，簡化實驗過程，容易操作，由于聚合過程一步完成，避免了復(fù)雜的裝柱程序，大大減少操作時間。本發(fā)明采用通過實驗設(shè)計，找到合成表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡整體柱的最適宜反應(yīng)物配比；即印跡分子、功能單體和交聯(lián)劑的及致孔劑的比例，制備得到對表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)具有較好選擇性的分子印跡整體柱。在同組分配比下，合成不加模板分子的空白柱，相同條件下進(jìn)行色譜分析，可獲得高的印跡因子，且印跡柱可以用來進(jìn)行表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)與類似物的分離。


圖1為本發(fā)明印跡整體柱上表沒食子兒茶素沒食子酸酯與其類似物鞣花酸、兒茶素、沒食子酸、沒食子酸甲酯、對羥基苯甲酸、鄰羥基苯甲酸、間羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸在柱溫為40度時的色譜保留圖，該印跡整體柱的模板功能單體交聯(lián)劑比例為1:12:60，其中I為丙酮，2為表沒食子兒茶素沒食子酸酯，3為兒茶素，4為沒食子酸，5為沒食子酸甲酯，6為3，4- 二羥基苯甲酸，7為間羥基苯甲酸，8為對羥基苯甲酸，9為鄰羥基苯甲酸，10為鞣花酸，其中丙酮峰表示色譜柱死時間；圖2為本發(fā)明無表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡的空白整體柱上表沒食子兒茶素沒食子酸酯與其類似物鞣花酸、兒茶素、沒食子酸、沒食子酸甲酯、對羥基苯甲酸、鄰羥基苯甲酸、間羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸的色譜保留圖，其中I為丙酮，2為表沒食子兒茶素沒食子酸酯，3為兒茶素，4為沒食子酸，5為沒食子酸甲酯，6為3，4- 二羥基苯甲酸，7為間羥基苯甲酸，8為對羥基苯甲酸，9為鄰羥基苯甲酸，10為鞣花酸，其中丙酮峰表示色譜柱死時間；圖3為本發(fā)明表沒食子兒茶素沒食子酸酯與其類似物鞣花酸、兒茶素、沒食子酸、沒食子酸甲酯、對羥基苯甲酸、鄰羥基苯甲酸、間羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸在改變柱溫及增加模板量的印跡柱上的保留色譜圖，其模板功能單體交聯(lián)劑=1:6:30，其中I為丙酮，2為表沒食子兒茶素沒食子酸酯，3為兒茶素，4為沒食子酸，5為沒食子酸甲酯，6為3，4-二羥基苯甲酸，7為間羥基苯甲酸，8為對羥基苯甲酸，9為鄰羥基苯甲酸，10為鞣花酸，其中丙酮峰表示色譜柱死時間；圖4為本發(fā)明表沒食子兒茶素沒食子酸酯與其類似物鞣花酸、兒茶素、沒食子酸、沒食子酸甲酯、對羥基苯甲酸、鄰羥基苯甲酸、間羥基苯甲酸、3，4-二羥基苯甲酸在改變柱溫及增加模板和功能單體量的保留色譜圖，其模板功能單體交聯(lián)劑=1:8:32，其中I為丙酮，2為表沒食子兒茶素沒食子酸酯，3為兒茶素，4為沒食子酸，5為沒食子酸甲酯，6為3，4-二羥基苯甲酸，7為間羥基苯甲酸，8為對羥基苯甲酸，9為鄰羥基苯甲酸，10為鞣花酸，其中丙酮峰表示色譜柱死時間。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明。表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子印跡整體柱制備，利用原位聚合法合成EGCG為模板的分子印跡整體柱，在合適的色譜條件下，連于高效液相色譜儀評價其保留性能實施例1原位聚合法制備表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡整體柱a、按一根不銹鋼管柱內(nèi)合成表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡整體柱的質(zhì)量數(shù)，準(zhǔn)確稱取模板分子為表沒食子兒茶素沒食子酸酯2. 88%、功能單體為丙烯酰胺5. 45%、交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯74. 71%，致孔劑為將聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液(濃度40mg/ml)5. 5%再加入異辛烷10. 53%，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈O. 93%混合，超聲20分鐘，使其均勻，澄清，然后轉(zhuǎn)移到干凈的不銹鋼管柱100X4. 6mml. D.中，超聲脫氣15分鐘，將不銹鋼管柱兩端封住，于溫度60°C的恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)24小時；b、模板分子的去除將合成好的不銹鋼管柱取出并連接到HPLC的高壓泵上，先用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑，然后用體積比甲醇乙酸=9:1混合液沖洗至完全除去模板分子，流速由O. lml/mim逐漸增大，沖洗液總體積為150ml，即可得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子印跡整體柱；用高效液相色譜法對其進(jìn)行色譜分析，檢測波長設(shè)置為254nm，先用緩沖溶液沖表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子印跡高效液相整體柱，使系統(tǒng)穩(wěn)定至基線水平，進(jìn)樣，測定表沒食子兒茶素沒食子酸酯的保留時間tK和丙酮的保留時間h，表沒食子兒茶素沒食子酸酯的保留因子用公式k’ =(Vt0)/t0計算；結(jié)果表明，在流動相條件為乙腈/乙酸鹽緩沖液(90/10，v/v)(其中鹽濃度為50mmol/L, pH3. 6),流速1. Oml/min時,柱溫為40°C,模板表沒食子兒茶素沒食子酸酯可與類似物得到分離(圖1)。實施例2 (對照)空白整體柱分離表沒食子兒茶素沒食子酸酯及其結(jié)構(gòu)類似物為考察表沒食子兒茶素沒食子酸酯及其結(jié)構(gòu)類似物在非印跡柱上的保留情況，合成不加模板表沒食子兒茶素沒食子酸酯的空白柱作為對照。具體操作步驟如下除不加模板分子表沒食子兒茶素沒食子酸酯外，用實施例1相同的方法和實驗條件合成非印跡空白柱，聚合完成后，用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑和未反應(yīng)的試劑；
色譜評價同實施例1中對印跡柱的考察，即在相同流動相條件下，通過測定表沒食子兒茶素沒食子酸酯及其類似物的保留時間tK和丙酮的保留時間h，計算保留因子k’ ；結(jié)果表明，在空白柱上模板與類似物出峰時間相近，沒有達(dá)到基線分離(圖2)；通過比較模板分子在印跡整體柱和空白整體柱上的保留因子，計算印跡因子IF，IF=k’ MIPs/k，NIPs,來評價印跡柱的保留性能,結(jié)果顯示,k’ MIPs=2. 460, k，NIPs=0. 795, IF=3. 09,表明印跡柱對表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子具有很強的特異識別能力，保留因子遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他類似物，對分離表沒食子兒茶素沒食子酸酯和其類似物可達(dá)到基線分離，因此可以用來作為從混合物中提取分離表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法。實施例3原位聚合法制備表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡整體柱a、按一根不銹鋼管柱內(nèi)合成表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡整體柱的質(zhì)量數(shù)，準(zhǔn)確稱取模板分子為表沒食子兒茶素沒食子酸酯5. 60%、功能單體為丙烯酰胺5. 1%、交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯72. 62%、致孔劑為將聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液(濃度40mg/ml)5. 28%、再加入異辛烷10. 5%、引發(fā)劑為偶氮二異丁腈O. 90%混合，放入超聲器中，超聲20分鐘，使其均勻，澄清，然后轉(zhuǎn)移到干凈的不銹鋼管柱內(nèi)(100X4. 6_1.D.)，超聲脫氣15分鐘，將不銹鋼管柱兩端封住，于溫度60°C的恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)24小時；b、模板分子的去除將合成好的不銹鋼管柱取出并連接到HPLC的高壓泵上，先用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑，然后用體積比甲醇乙酸=9:1混合液沖洗至完全除去模板分子，流速由O. lml/mim逐漸增大，沖洗液總體積為150ml，即可得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子印跡整體柱。色譜評價同實施例1，在流動相為乙腈/乙酸鹽緩沖液(90/10，v/v)(其中鹽濃度50mmol/L，pH3. 6)，流速為1. Oml/min，柱溫為25°C時，得到色譜分離圖(圖3)。實驗結(jié)果表明，模板表沒食子兒茶素沒食子酸酯可與類似物得到分離實施例4原位聚合法制備表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡整體柱a、按一根不銹鋼管柱內(nèi)合成表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡整體柱的質(zhì)量數(shù)，準(zhǔn)確稱取模板分子為表沒食子兒茶素沒食子酸酯3. 94%、功能單體為丙烯酰胺5. 28%、交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯73. 93%、致孔劑為將聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液(濃度40mg/ml)5. 41%、再加入異辛烷10. 52%、引發(fā)劑為偶氮二異丁腈O. 92%混合，放入超聲器中，超聲20分鐘，使其均勻，澄清，然后轉(zhuǎn)移到干凈的不銹鋼管柱內(nèi)(100X4. 6_1.D.)，超聲脫氣15分鐘，將不銹鋼管柱兩端封住，于溫度60°C的恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)28小時；b、模板分子的去除將合成好的不銹鋼管柱取出并連接到HPLC的高壓泵上，先用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑，然后用體積比甲醇乙酸=9:1混合液沖洗至完全除去模板分子，流速由O. lml/mim逐漸增大，沖洗液總體積為150ml，即可得到?jīng)]食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)分子印跡整體柱；色譜評價同實施例1，在流動相為乙腈/乙酸鹽緩沖液(90/10，v/v)(其中鹽濃度50mmol/L,pH3. 6)，流速1. Oml/min時，柱溫為25°C時，得到色譜分離圖(圖4)，實驗結(jié)果表明，模板沒食子兒茶素沒食子酸酯可與類似物得到分離。
權(quán)利要求
1.一種表沒食子兒茶素沒食子酸酯印跡聚合物整體柱的制備方法，其特征在于采用原位聚合法制備，具體操作按下列步驟進(jìn)行: a、將質(zhì)量百分?jǐn)?shù)模板分子為表沒食子兒茶素沒食子酸酯2.88-5.6%、功能單體為丙烯酰胺5.1-5.45%、交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯72.62-74.71%、致孔劑為聚苯乙烯溶于四氫呋喃的溶液5.28-5.50%混合，再加入異辛烷10.5-10.53%，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈0.90-0.93%進(jìn)行混合，超聲20分鐘，使其均勻，澄清，然后轉(zhuǎn)移到干凈的不銹鋼管柱中，超聲脫氣15分鐘，將不銹鋼管柱兩端封住，于溫度60°C的恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)20-28小時； b、將不銹鋼管柱取出并連接到HPLC的高壓泵上，先用四氫呋喃沖洗，以除去整體柱中殘留的致孔劑，然后用甲醇和乙酸的混合液沖洗至除去模板分子，流速由0.lml/mim逐漸增大，沖洗液總體積為150ml，即可得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子印跡整體柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中的致孔劑聚苯乙烯溶于四氫呋喃溶液中的濃度為40mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中的不銹鋼管柱為100X4.6mm 1.D.。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中甲醇和乙酸的混合液為體積比甲醇:乙酸=9:1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種原位聚合法制備表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子印跡聚合物整體柱的方法，該方法將預(yù)聚合混合溶液直接注入到不銹鋼管柱內(nèi)制備連續(xù)棒形聚合物，得到具有固定空穴大小和形狀、有確定排列功能團(tuán)、識別模板分子的交聯(lián)高聚物材料，即分子印跡聚合物(MIP)。經(jīng)該方法得到的分子印跡聚合物(MIP)整體柱不僅具有印跡效果，而且具有滲透性好的優(yōu)點，印跡因子可達(dá)3.09，同時該方法制備過程簡單，內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻，重現(xiàn)性好，避免了繁瑣的裝柱手續(xù)，可直接用于分析。
文檔編號C08F220/56GK103071471SQ20131004148
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者劉照勝, 孫璇, 黃艷萍, 阿吉艾克拜爾·艾薩 申請人:中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所