專利名稱:酵母β-D-葡聚糖衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及葡聚糖衍生物,尤其涉及酵母β-D-葡聚糖衍生物及其制備方法,本發(fā)明進(jìn)一步涉及酵母β-D-葡聚糖衍生物作為霉菌毒素吸附劑的用途,屬于酵母β-D-葡聚糖衍生物的制備及其應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù):
霉菌毒素是由多種真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,主要包括曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌等,在谷物、牧草、水果及副產(chǎn)品中均可發(fā)現(xiàn),很多農(nóng)作物和飼料易被霉菌毒素污染,從而對(duì)人類食品、飼料工業(yè)和動(dòng)物生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響。這些真菌毒素能夠?qū)θ撕蛣?dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重危害,如致癌、致突變、致畸、 雌激素中毒、神經(jīng)中毒或者降低免疫力等。動(dòng)物飼料、農(nóng)作物和食品中霉菌毒素的污染日益引起人們的關(guān)注。CAST報(bào)道稱全球至少有25%的飼料受到霉菌毒素的污染。張丞等對(duì)全國(guó)各地具有代表性的244份飼料和原料樣品進(jìn)行霉菌毒素污染情況調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)93%的樣品都受到霉菌毒素的污染,主要以玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和伏馬毒素為主,并且出現(xiàn)受多種霉菌毒素同時(shí)污染的現(xiàn)象(張丞,劉穎莉.2009年上半年中國(guó)飼料和原料中霉菌毒素污染調(diào)查報(bào)告.飼料廣角,2010,4:57-59)。王金勇等(2011)對(duì)來(lái)自全國(guó)各地199份樣品進(jìn)行檢測(cè),統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)與之相似的檢測(cè)的結(jié)果,玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和煙曲霉毒素的污染比較常見(jiàn)(王金勇,劉穎莉.2011年第三季度中國(guó)飼料和原料中霉菌毒素污染調(diào)查報(bào)告[J].今日養(yǎng)豬業(yè),2012(01))。玉米赤霉烯酮(簡(jiǎn)稱為ZEA,又稱F-2毒素),主要由玉米赤霉菌、禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌等真菌所產(chǎn)生的非類固醇雌激素。這些鐮刀菌都是土壤真菌,在高溫、高濕環(huán)境條件下容易污染農(nóng)作物。最初是從受禾谷鐮刀菌污染的發(fā)霉玉米中分離得到(Stob M, BaldwinR S,Tuite J,et al.1solation of an anabolic, uterotrophic compound from corninfected with Gibberella zeae[J].Nature,1962,196:1318)。ZEA 能夠引發(fā)動(dòng)物繁殖功能紊亂,還能夠引起人類的高雌激素綜合癥。有報(bào)道指出ZEA及其代謝產(chǎn)物對(duì)豬、牛和羊起著類雌激素活性的作用,而對(duì)于大鼠、小鼠口服或者腹腔注射給予ZEA則會(huì)表現(xiàn)出急性毒性。田間和倉(cāng)儲(chǔ)期間預(yù)防和控制霉菌毒素是首要途徑,但是這種污染不能夠完全避免,所以需要應(yīng)用各種脫霉措施處理霉變飼料。目前有多種脫毒處理方式,主要包括物理脫毒、化學(xué)脫毒、生物降解和吸附法等。具體可以根據(jù)不同的污染情況及實(shí)際條件,選擇合適的方式、方法降低或避免霉菌毒素的危害,減少經(jīng)濟(jì)損失。吸附劑脫毒原理是在體內(nèi),吸附劑與霉菌毒素結(jié)合形成螯合物,這種螯合物經(jīng)過(guò)胃腸道時(shí)不被吸收而直接排出體外。目前,報(bào)道較多的吸附劑主要有無(wú)機(jī)吸附劑和有機(jī)吸附劑,如活性炭、鋁硅酸鹽類和酵母細(xì)胞壁類等。酵母或酵母細(xì)胞壁對(duì)霉菌毒素具有較好的吸附作用。通常作為霉菌毒素吸附劑使用的僅僅是利用酵母細(xì)胞壁,而不是整個(gè)酵母細(xì)胞。大量的試驗(yàn)證明酵母細(xì)胞壁對(duì)霉菌毒素具有較好的吸附效果。酵母細(xì)胞壁位于酵母細(xì)胞的最外層,其厚度約0.05 0.2 μ m,約占細(xì)胞干物質(zhì)重的30%左右。酵母多糖是酵母細(xì)胞壁的主要成分,由內(nèi)到外依次為葡聚糖層、蛋白質(zhì)層、甘露聚糖層,層與層之間可部分鑲嵌,此外還有幾丁質(zhì)和脂類等。酵母葡聚糖可分為堿不溶、熱醋酸不溶性β -1, 3-D-葡聚糖,約占細(xì)胞壁的34% ;堿可溶性β_1,3-D-葡聚糖占細(xì)胞壁的20%;堿不溶性、熱醋酸可溶性β-1,6-葡聚糖約占細(xì)胞壁的6%;其中堿不溶性、熱醋酸不溶性的β-1,3-葡聚糖所占比例較大。從酵母細(xì)胞壁中分離的β_1,3-D-葡聚糖不帶電荷,呈中性,并且有少量i3-l,6-D-的支鏈結(jié)構(gòu),由于其分子內(nèi)多羥基作用,形成了致密的超螺旋結(jié)構(gòu),導(dǎo)致β-1,3- -葡聚糖不溶于水,另外其比表面積較小,所以使其應(yīng)用受到限制。β-D-葡聚糖是一種很好的免疫增強(qiáng)劑,具有多種生物活性。近年來(lái),國(guó)外許多研究者發(fā)現(xiàn)β-D-葡聚糖對(duì)霉菌毒素有很強(qiáng)的吸附特性,其吸附特性與其高分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)(YiannikourisA,F(xiàn)rancois J,Poughon L,Dussap C G., Bertin G., Jeminet G., et al., Adsorptionof zearalenone by β -D-glucans in the Saccharomyces cerevisiae cell wall.Journal of Food Protection, 2004a,67,1195 - 1200 ;Yiannikouris A,F(xiàn)rancoisJjPoughon LjDussap C G.,Bertin G.,Jeminet G.,et al.Alkali extractionof β -D-glucans from Saccharomyces cerevisiae cell wall and study of theiradsorptive properties toward zearalenone.Journal of Agricultural and FoodChemistry, 2004b,52,3666 - 3673)。霉菌毒素的危害和所造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失已是不容忽視的問(wèn)題。只有保證飼料及其原料的安全,才能保持飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。如何有效控制或降低霉菌毒素對(duì)農(nóng)作物、動(dòng)物和人類的危害一直是困擾人們的難題。隨著對(duì)霉菌毒素污染狀況的重視程度逐漸增加,吸附劑的研究也不斷深入,酵母多糖作為一種新型霉菌毒素吸附劑已經(jīng)也引起人們的關(guān)注。由于酵母多糖結(jié)構(gòu)緊密、不溶于水,需要對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)?shù)母男蕴幚碓黾悠渌苄?、提高生物活性,從而改善其吸附霉菌毒素的效果?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供酵母β-D-葡聚糖衍生物,相比于酵母β-D-葡聚糖,該酵母β-D-葡聚糖衍生物對(duì)于 霉菌毒素的吸附效果有顯著提升;本發(fā)明目的之二是提供一種制備所述酵母β-D-葡聚糖衍生物的方法;本發(fā)明目的之三是將所述的酵母β-D-葡聚糖衍生物作為毒素吸附劑應(yīng)用于吸
附霉菌毒素。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明提供了酵母β-D-葡聚糖衍生物,所述酵母β-D-葡聚糖衍生物由硫酸基取代酵母β-D-葡聚糖分子的羥基得到;其中,硫酸基的取代度是0.28-0.32或0.40-0.51 ;優(yōu)選的,所述取代度是0.29或0.49。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備所述酵母β -D-葡聚糖衍生物的方法,包括以下步驟:將酵母β -D-葡聚糖溶于有機(jī)溶劑中,加入酯化劑進(jìn)行酯化反應(yīng),即得。其中,所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選為二甲基甲酰胺。所述的酯化劑由氯磺酸與吡啶組成;優(yōu)選的,氯磺酸與吡啶的體積比例為1:2-10,更優(yōu)選為1:4-6,最優(yōu)選為1:6。
所述酯化劑可參考下述方法制備得到:在0°C以下溫度條件下,向吡啶中滴加氯磺酸,得到酯化劑。所述的酯化反應(yīng)溫度優(yōu)選為30_90°C,進(jìn)一步優(yōu)選為45_75°C,更優(yōu)選為45_60°C,最優(yōu)選為45 °C ;所述的酯化反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為0.5-4小時(shí),更優(yōu)選為1-3小時(shí),最優(yōu)選為2小時(shí)。本發(fā)明中所述的霉菌毒素包括但不限于玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、煙曲霉毒素或伏馬毒素等霉菌毒素,優(yōu)選為玉米赤霉烯酮。影響酵母β -D-葡聚糖硫酸酯的取代度受酯化條件的影響,即酯化反應(yīng)的反應(yīng)條件不同,酯化產(chǎn)物的取代度也會(huì)不同。酯化反應(yīng)過(guò)程中的條件有氯磺酸與吡啶的體積比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度。本發(fā)明首先采用單因素試驗(yàn)考察每個(gè)條件的具體水平對(duì)取代度的影響。單因素試驗(yàn)考察發(fā)現(xiàn),不同氯磺酸與吡啶體積比對(duì)取代度的影響,隨著氯磺酸的增力口,取代度逐漸增大,當(dāng)二者體積比為1:6時(shí)取代度達(dá)到最高為0.43,然后繼續(xù)增加氯磺酸的量,取代度下降,分析原因可能是隨著氯磺酸的量逐漸增加,使反應(yīng)處于酸度較高的環(huán)境下,易使多糖鏈發(fā)生斷裂,甚至發(fā)生碳化所致。酯化時(shí)間、酯化溫度也出現(xiàn)這一現(xiàn)象。通過(guò)單因素試驗(yàn)條件優(yōu)化,本發(fā)明對(duì)酯化反應(yīng)的單因素初步確定:氯磺酸與吡啶體積比優(yōu)選為1:2-10,更優(yōu)選為1:4-6 ;酯化反應(yīng)溫度優(yōu)選為30-90°C,進(jìn)一步優(yōu)選為45_75°C ;酯化反應(yīng)時(shí)間為0.5-4小時(shí),優(yōu)選為1-3小時(shí)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,本發(fā)明通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)影響取代度大小的順序?yàn)?氯磺酸與吡啶的體積比 > 酯化時(shí)間 > 酯化溫度。
由于酯化劑是由氯磺酸和吡啶反應(yīng)配制,氯磺酸含量的高低直接決定取代度的大小,但是含量過(guò)高會(huì)使取代度降低。不同取代度的酵母β-D-葡聚糖硫酸酯對(duì)ZEA的體外吸附效果不同。酵母β-D-葡聚糖由于其分子上羥基的氫被磺酸基取代,使得酵母β-D-葡聚糖水溶性增加、分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。取代度不同說(shuō)明酵母β-D-葡聚糖分子上羥基的氫被取代的程度不同,所以導(dǎo)致產(chǎn)物的水溶性和分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使得致密的三螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞,所以對(duì)ZEA的吸附效果發(fā)生變化。本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)非常意外的發(fā)現(xiàn),當(dāng)酵母β -D-葡聚糖硫酸酯的取代度是0.49時(shí)(取代度是0.49的產(chǎn)物通過(guò)以下條件制備得到:氯磺酸與吡啶的體積比為1:6,酯化溫度為45°C,酯化時(shí)間為2h,),產(chǎn)物對(duì)ZEA的吸附量達(dá)到最高,其吸附量為18.6528ug/mg ;當(dāng)酵母β -D-葡聚糖硫酸酯的取代度超過(guò)0.49后,酵母β -D-葡聚糖衍生物產(chǎn)物對(duì)ZEA的吸附量呈顯著下降的趨勢(shì),說(shuō)明并不是取代度越高,其對(duì)ZEA的吸附力就越強(qiáng),其原因可能是與酵母β-D-葡聚糖的空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。此外,當(dāng)糖硫酸酯的取代度是0.29 (取代度是
0.29的產(chǎn)物通過(guò)以下酯化反應(yīng)條件制備得到:氯磺酸與吡啶的體積比為1:4,酯化溫度為750C,酯化時(shí)間為3h),該取代度的酯化產(chǎn)物對(duì)ZEA的吸附量為18.356ug/mg,僅次于取代度為0.49時(shí)對(duì)ZEA的的吸附量。掃面電鏡對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)硫酸酯化修飾后,酵母β -D-葡聚糖酯化產(chǎn)物物理形態(tài)發(fā)生變化,酵母β-D-葡聚糖硫酸酯的圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)消失,顆粒表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,呈現(xiàn)網(wǎng)格狀,有明顯的溝紋,比表面積增大,吸附能力顯著增強(qiáng);吸附效果試驗(yàn)表明,本發(fā)明所制備的酵母β -D-葡聚糖衍生物對(duì)玉米赤霉烯酮吸附量達(dá)到18.6528 μ g/mg,非常顯著的高于酵母細(xì)胞壁以及酵母β -D-葡聚糖對(duì)玉米赤霉烯酮的吸附量。
圖1硫酸基的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2氯磺酸與吡啶不同體積比對(duì)取代度的影響。圖3酯化溫度對(duì)取代度的影響。圖4酯化時(shí)間對(duì)取代度的影響。圖5酵母β -葡聚糖硫酸酯樣品的紅外光譜圖。圖6酵母β -D-葡聚糖硫酸酯化改性前后掃描電鏡圖。圖7不同取代度的酵母β -D-葡聚糖硫酸酯對(duì)ZEA吸附效果。圖8三種不同產(chǎn)品體外吸附ZEA的效果比較。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明,本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的,并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是,在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換,但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。試劑及通用的實(shí)驗(yàn)方法1.主要試劑及材料:三氯乙酸、硫酸鉀、吡啶、二甲基甲酰胺、氫氧化鈉、苯酚、氯磺酸、明膠、氯化鋇、鹽酸、色譜級(jí)甲醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純(上海國(guó)藥國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),玉米赤霉烯酮(ZEA)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)`自sigma公司,玉米赤霉烯酮試劑盒購(gòu)自安德珍有限責(zé)任公司。2.氯磺酸-吡啶法制備酵母β -D-葡聚糖硫酸酯酯化劑的制備:將附有冷凝管、攪拌裝置和測(cè)定溫度裝置的四頸燒瓶置于鹽水冰浴中,加入吡唆,攪拌,使之冷卻到0°c以下,然后用恒壓滴液漏斗慢慢加入氯磺酸,在30min左右滴加完畢,燒瓶出現(xiàn)大量淡黃色固體,即得到酯化劑。稱取一定量的酵母β-D-葡聚糖溶于二甲基甲酰胺中,室溫下充分?jǐn)嚢钁腋?,然后加入到制備好的酯化劑中。迅速將四頸燒瓶移入熱水浴中,恒溫?cái)嚢?,反?yīng)一定時(shí)間,再移置冰水浴中冷卻至室溫,將反應(yīng)液傾入冰水中,用2.5%Na0H中和到pH7.5左右,加入無(wú)水乙醇1:3 (V/V),析出淡黃色沉淀,抽濾收集沉淀。將沉淀溶于水,用透析袋流水透析48h,蒸餾水透析24h。透析液冷凍干燥,得到淡黃色粉末。3.酵母β -D-葡聚糖硫酸酯的定量與定性分析方法3.1硫酸基含量的測(cè)定3.1.1硫酸鋇比濁法基本原理是:通過(guò)酸水解從糖復(fù)合物中釋放出硫酸基,生成硫酸鋇,使其在氯化鋇明膠溶液中渾濁,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。測(cè)定方法:稱取硫酸多糖IOmg,加入lmol/L鹽酸5ml,真空封管,100°C水解6h,按標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定方法測(cè)定其吸光值。3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取干燥的硫酸鉀準(zhǔn)確配制成0.6mg/ml的溶液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)硫酸鹽溶液 0.04ml、0.08ml、0.12ml、0.16ml,0.2ml,加 lmol/L HCl 補(bǔ)至 0.2ml,依次加入 3.8ml 三氯乙酸。Iml氯化鋇-明膠溶液,混合室溫放置15min,以lmol/L HCl作為參比,360nm測(cè)定吸光值;以硫酸基的濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)建立線性回歸方程,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1 ;圖1表明,硫酸基含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)為0.9995,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.0031x - 0.0384。3.1.3硫酸取代度計(jì)算酵母β-D-葡聚糖硫酸酯中的硫酸基含量通常用取代度(degree of sulfur,DS)來(lái)表示。DS是指酵母β-D-葡聚糖硫酸酯上每個(gè)葡萄糖殘基中含有的硫酸基團(tuán)的平均個(gè)數(shù)。計(jì)算公式如下:
權(quán)利要求
1.酵母β-D-葡聚糖衍生物,其特征在于:通過(guò)硫酸基取代酵母β-D-葡聚糖分子的羥基獲得;其中,硫酸基的取代度是0.28-0.32或0.40-0.51。
2.按照權(quán)利要求1所述的酵母β-D-葡聚糖衍生物,其特征在于:硫酸基的取代度是.0.29 或 0.49。
3.一種制備權(quán)利要求1或2所述酵母β-D-葡聚糖衍生物的方法,其特征在于,包括以下步驟:將酵母β -D-葡聚糖溶于有機(jī)溶劑中,加入酯化劑進(jìn)行酯化反應(yīng),即得。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于:所述的有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于:所述酯化劑按照以下方法制備得到:在(TC以下溫度條件下,向吡啶中滴加氯磺酸得到酯化劑。
6.按照權(quán)利要求3或5所述的方法,其特征在于:所述的酯化劑由氯磺酸與吡啶組成。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于:氯磺酸與吡啶的體積比例為1:2-10 ;優(yōu)選為1:4-6 ;更優(yōu)選為1:6。
8.按照權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于:所述的酯化反應(yīng)溫度為30-90°C;優(yōu)選為.45-750C ;更優(yōu)選為45-60°C ;最優(yōu)選為45°C。
9.按照權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于:所述的酯化反應(yīng)時(shí)間為0.5-4小時(shí);優(yōu)選為1-3小時(shí);最優(yōu)選為2小時(shí)。
10.權(quán)利要求1或2所述酵母β-D-葡聚糖衍生物作為霉菌毒素吸附劑的用途;優(yōu)選的,所述霉菌毒素包括玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、煙曲霉毒素或伏馬毒素。
全文摘要
本發(fā)明公開了酵母β-D-葡聚糖衍生物及其制備方法和用途。所述酵母β-D-葡聚糖衍生物由硫酸基取代酵母β-D-葡聚糖分子的羥基得到,其中,硫酸基的取代度是0.28-0.32或0.40-0.51。本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備酵母β-D-葡聚糖衍生物的方法,包括將酵母β-D-葡聚糖溶于有機(jī)溶劑中,加入酯化劑進(jìn)行酯化反應(yīng),即得。掃面電鏡對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)硫酸酯化修飾后的酵母β-D-葡聚糖衍生物呈現(xiàn)網(wǎng)格狀,有明顯溝紋,比表面積明顯增大,吸附能力顯著增強(qiáng)。吸附效果試驗(yàn)表明,本發(fā)明酵母β-D-葡聚糖衍生物對(duì)玉米赤霉烯酮吸附量達(dá)到18.6528μg/mg,顯著高于酵母細(xì)胞壁以及酵母β-D-葡聚糖對(duì)玉米赤霉烯酮的吸附量。
文檔編號(hào)C08B37/02GK103183741SQ20131009105
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月21日
發(fā)明者馬立保, 榮迪, 胡曉芬, 吳艷麗 申請(qǐng)人:馬立保