專利名稱：一種海帶抗氧化多糖的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及海帶深加工技術技術領域，具體涉及一種海帶抗氧化多糖的提取方法。
背景技術：
海帶(Zaffiiaaria因生長在海底的巖石上，形狀像帶子而得名，又稱綸布、江白菜，藥用稱昆布，是一種營養(yǎng)非常豐富的海洋性蔬菜，含有多種對人體健康具有積極貢獻作用的物質，在古書《本草綱目》、《神農本草經》、《食療本草》等中均有記載，具有重要的食用和藥用價值，因此，常被稱為“長壽菜”、“健康食品”，深受人們的喜愛。海帶多糖是存在于海帶細胞間和細胞內的一類天然生物大分子物質，具有多種生物功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、調節(jié)免疫功能等作用，與海帶的多種保健功效密切相關，因此是近年來的研究熱點之一。如，福州大學(中國專利申請?zhí)?01210017025.3)公開一種具有抗氧化和抗腫瘤活性的海帶多糖及提取分離方法；合肥工業(yè)大學(中國專利申請?zhí)?01210217169.3)公開一種抗動脈粥硬化活性海帶多糖的制備方法；南通大學(中國專利申請?zhí)?01110202149.4)公開一種具有調節(jié)血脂的海帶多糖膠囊及其制備方法等。多糖的結構與活性的構效關系研究表明，多糖的結構決定了其理化性質，影響著其生物活性的發(fā)揮。因此，采用合適的提取分離手段，對獲得具有生物活性的多糖具有重要作用。然而，針對多糖的特點理化性質，建立特色的多糖制備方法的研究鮮見報道。作者先前已公開一種低分子量的海帶多糖提取分離方法及其在卷煙制品中的應用(中國專利申請?zhí)?01110437814.8)，一種海帶多糖及其制備方法和應用(中國專利申請?zhí)?01110321909.3)，一種海帶多糖乙醇提取液的制備方法及其應用(中國專利申請?zhí)?01110321907.4)等。在此研究基礎上，本專利進一步公開了有機酸提取海帶多糖工藝方法，采用柱層析法獲得一種具有高硫酸基含量、高半乳糖含量的海帶抗氧化多糖。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有高抗氧化活性海帶多糖的提取方法。本發(fā)明的目的通過如下技術方案予以實現:
(1)海帶除沙洗凈，晾干，粉碎，得提取原料；
(2)在提取原料中加入20-40倍重量蒸餾水，在100-125°C下提取2_5小時，過濾去除上清液，分離得到海帶渣；
(3)將步驟(2)所得的海帶渣用有機酸溶劑提取多糖，即于110-125°C下提取2-4小時，過濾，分離固液，得多糖提取液，用氫氧化鉀調節(jié)多糖提取液PH值至6.5-7.0 ；
(4)將步驟(3)所得的多糖提取液進行真空濃縮，至原來體積的1/6-1/4，得濃縮液；
(5)在濃縮液中加入乙醇，混合均勻，在0-4°C下靜置6-12小時，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀； (6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得海帶抗氧化多糖LJPA；(7)用蒸懼水溶解海帶抗氧化多糖,采用Sevag法去除游離蛋白質,將Sevag試劑加入海帶抗氧化多糖溶液中，室溫振蕩30-40min,離心去除游離蛋白沉淀,重復前述Sevag法5-6次去除游離蛋白質，除蛋白后的多糖溶液加入乙醇，混合均勻，0-4°C靜置6-12h，離心，除去上層清夜，得除蛋白后的多糖沉淀物；
(8)將步驟(7)所得的多糖沉淀物進行透析除鹽，冷凍干燥，獲得抗氧化多糖LJPA-P；
(9)用蒸餾水溶解多糖LJPA-P，采用DEAESepharose Fast Flow柱層析進行分離，分別用0M、0.1M、0.2M和0.3 M的NaCl溶液進行洗脫，收集0.3M濃度下洗脫液；
(10)將步驟(9)所得的洗脫液進行透析除鹽，冷凍干燥，得多糖LJPA-P3。步驟(I)所述海帶粉碎為粉碎至20-80目。步驟(3)所述有機酸溶劑為 檸檬酸、蘋果酸或醋酸中任意一種，且溶液的pH值為1.5-3。步驟(3)所述有機酸溶液的用量按海帶渣干重的20-40倍加入。步驟(5)、(7)所述乙醇添加量滿足混合均勻后乙醇最終濃度為70-85% (v/v)。步驟(7)所述Sevag試劑由氯仿和正丁醇按5:1-4:1的體積比例配制。步驟(7)所述Sevag試劑的用量按海帶抗氧化多糖溶液體積的1/5-1/4加入。步驟(8)、(10)所述透析除鹽的透析袋規(guī)格為800_1200Da的截留分子量。步驟(10)所得的海帶多糖組分LJPA-P3，呈淡褐色，易溶于水，具有較強的抗氧化活性。本發(fā)明采用了以上技術方案，具有如下的優(yōu)點和有益效果:
1、本發(fā)明提供了一種海帶抗氧化多糖的提取分離方法，獲得一種具有強抗氧化能力的海帶多糖組分。2、本發(fā)明所得的海帶抗氧化多糖組分具有特殊的結構特點，具有高含量的硫酸基和半乳糖，且組成的糖苷鍵結構較為單一。


圖1為海帶抗氧化多糖經DEAE Sepharose Fast Flow層析柱的洗脫曲線圖。圖2為海帶抗氧化多糖各組分的抗氧化能力對比圖。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖對本發(fā)明的具體實施作進一步說明，但本發(fā)明的實施和保護不限于此。實施例1
(1)海帶除沙洗凈，晾干，粉碎至20目，得提取原料；
(2)在提取原料中加入20倍重量的蒸餾水，在125°C下提取2小時，過濾去除上清液，分離得到海帶渣；
(3)將步驟(2)所得的海帶渣用醋酸溶劑提取多糖，即pH=l.5的醋酸溶劑按海帶渣干重的40倍加入，于110°C下提取4小時，過濾，分離固液，得多糖提取液，用氫氧化鉀調節(jié)多糖提取液PH值至6.5 ;
(4)將步驟(3)所得的多糖提取液進行真空濃縮，至原來體積的1/6，得濃縮液；(5)在濃縮液中加入乙醇，混合均勻，至乙醇最終濃度為70%(v/v)，在0°C下靜置6小時，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀；
(6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得海帶抗氧化多糖LJPA-a；
(7)用蒸懼水溶解海帶抗氧化多糖,采用Sevag法去除游離蛋白質,將Sevag試劑(由氯仿和正丁醇按4:1的體積比例配制)按海帶抗氧化多糖溶液體積的1/4加入多糖溶液中，室溫振蕩40min，離心去除游離蛋白沉淀，重復前述Sevag法6次去除游離蛋白質，除蛋白后的多糖溶液加入乙醇，混合均勻，至乙醇最終濃度為70% (V/V)，0°C靜置6h，離心，除去上層清夜，得除蛋白后的多糖沉淀物；
(8)將步驟(7)所得的多糖沉淀物進行透析除鹽，所用的透析袋規(guī)格為SOODa的截留分子量，冷凍干燥，獲得抗氧化多糖LJPA-P-a ；
(9)用蒸懼水溶解多糖LJPA-P-a,采用DEAESepharose Fast Flow柱層析(DEAESepharose Fast Flow填料裝于規(guī)格為2.6cmX 20cm的玻璃柱,柱床體積約為IOOmL)進行分離，分別用0M、0.1Μ、0.2Μ和0.3 MNaCl溶液進行洗脫，收集0.1Μ、0.2Μ和0.3Μ三個濃度下洗脫液；
(10)將步驟(9)所得的洗脫液進行透析除鹽，所用的透析袋規(guī)格為SOODa的截留分子量，冷凍干燥，得多糖 LJPA-P1-a、LJPA-P2-a 和 LJPA_P3_a。其中，海帶多糖組分LJPA-P3_a，呈淡褐色，易溶于水，具有較高含量的硫酸基和半乳糖，具有較強的抗氧化活性。
實施例2 (1)海帶除沙洗凈，晾干，粉碎至40目，得提取原料；
(2)在提取原料中加入30倍重量的蒸餾水，在110°C下提取3小時，過濾去除上清液，分離得到海帶渣；
(3)將步驟(2)所得的海帶渣用檸檬酸溶劑提取多糖，即pH=2的檸檬酸溶劑按海帶渣干重的30倍加入，于125°C下提取2小時，過濾，分離固液，得多糖提取液，用氫氧化鉀調節(jié)多糖提取液PH值至7.0 ;
(4)將步驟(3)所得的多糖提取液進行真空濃縮，至原來體積的1/5，得濃縮液；
(5)在濃縮液中加入乙醇，混合均勻，至乙醇最終濃度為85%(v/v)，在2°C下靜置10小時，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀；
(6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得海帶抗氧化多糖LJPA-b；
(7)用蒸懼水溶解海帶抗氧化多糖,采用Sevag法去除游離蛋白質,將Sevag試劑(由氯仿和正丁醇按5:1的體積比例配制)按海帶抗氧化多糖溶液體積的1/5加入多糖溶液中，室溫振蕩30min，離心去除游離蛋白沉淀，重復前述Sevag法5次去除游離蛋白質，除蛋白后的多糖溶液加入乙醇，混合均勻，至乙醇最終濃度為85% (v/v)，2°C靜置10h，離心，除去上層清夜，得除蛋白后的多糖沉淀物；
(8)將步驟(7)所得的多糖沉淀物進行透析除鹽，所用的透析袋規(guī)格為IOOODa的截留分子量，冷凍干燥，獲得抗氧化多糖LJPA-P-b ；
(9)用蒸懼水溶解多糖LJPA-P,采用DEAESepharose Fast Flow柱層析(DEAESepharose Fast Flow填料裝于規(guī)格為2.6cmX 20cm的玻璃柱,柱床體積約為IOOmL)進行分離，分別用OM、0.1Μ、0.2Μ和0.3 MNaCl溶液進行洗脫，收集0.1Μ、0.2Μ和0.3Μ三個濃度下洗脫液；
(10)將步驟(9)所得的洗脫液進行透析除鹽，所用的透析袋規(guī)格為IOOODa的截留分子量，冷凍干燥，得多糖 LJPA-P1-b、LJPA-P2-b 和 LJPA_P3_b。其中，海帶多糖組分LJPA-P3_b，呈淡褐色，易溶于水，具有較高含量的硫酸基和半乳糖，具有較強的抗氧化活性。
實施例3
(1)海帶除沙洗凈，晾干，粉碎至80目，得提取原料；
(2)在提取原料中加入40倍重量的蒸餾水，在100°C下提取5小時，過濾去除上清液，分離得到海帶渣；
(3)將步驟(2)所得的海帶渣用蘋果酸溶劑提取多糖，即pH=3的蘋果酸溶劑按海帶渣干重的20倍加入，于115°C下提取3小時，過濾，分離固液，得多糖提取液，用氫氧化鉀調節(jié)多糖提取液PH值至6.8 ;
(4)將步驟(3)所得的多糖提取液進行真空濃縮，至原來體積的1/4，得濃縮液；
(5)在濃縮液中加入乙醇，混合均勻，至乙醇最終濃度為75%&八)，在41:下靜置12小時，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀；
(6)收集沉淀物，冷 凍干燥，獲得海帶抗氧化多糖LJPA-c；
(7)用蒸懼水溶解海帶抗氧化多糖,采用Sevag法去除游離蛋白質,將Sevag試劑(由氯仿和正丁醇按4.5:1的體積比例配制)按海帶抗氧化多糖溶液體積的1/4.5加入多糖溶液中，室溫振蕩35min,離心去除游離蛋白沉淀,重復前述Sevag法5次去除游離蛋白質,除蛋白后的多糖溶液加入乙醇，混合均勻，至乙醇最終濃度為75% (v/v)，4°C靜置12h，離心，除去上層清夜，得除蛋白后的多糖沉淀物；
(8)將步驟(7)所得的多糖沉淀物進行透析除鹽，所用的透析袋規(guī)格為1200Da的截留分子量，冷凍干燥，獲得抗氧化多糖LJPA-P-c ；
(9)用蒸懼水溶解多糖LJPA-P,采用DEAESepharose Fast Flow柱層析(DEAESepharose Fast Flow填料裝于規(guī)格為2.6cmX 20cm的玻璃柱,柱床體積約為IOOmL)進行分離，分別用0M、0.1Μ、0.2Μ和0.3 MNaCl溶液進行洗脫，收集0.1Μ、0.2Μ和0.3Μ三個濃度下洗脫液；
(10)將步驟(9)所得的洗脫液進行透析除鹽，所用的透析袋規(guī)格為1200Da的截留分子量，冷凍干燥，得多糖 LJPA-P1-c、LJPA-P2-C 和 LJPA-P3-C。其中，海帶多糖組分LJPA-P3-C，呈淡褐色，易溶于水，具有較高含量的硫酸基和半乳糖，具有較強的抗氧化活性。
由實施例所得的LJPA-P3-a、LJPA-P3-b和LJPA-P3-C在結構與抗氧活性上沒有顯著性差異，均具有本專利發(fā)明的LJPA-P3所具有的結構特性與抗氧化活性。將本專利所獲得的LJPA-P、LJPA-P1、LJPA-P2和LJPA-P3進抗氧化活性與結構特性評價，如附圖、表所示。圖1為海帶抗氧化多糖經DEAE Sepharose Fast Flow層析柱的洗脫曲線圖。圖2為海帶抗氧化多糖各組分的抗氧化能力對比圖。表I為海帶抗氧化多糖各組分的硫酸基含量結果。表2為海帶抗氧化多糖各組分的單糖組成結果。由圖1可知，海帶抗氧化多糖LJPA-P經NaCl洗脫液洗脫出三個明顯的峰型，分別在0.1Μ、0.2Μ和0.3Μ三個濃度下獲得LJPA-PU LJPA-P2和LJPA-P3。此外，由于DEAE是一種陰離子交換劑，可以分離帶電荷的多糖。一般來說，洗脫液的離子強度越大，即鹽濃度越高，洗脫出來的組分酸性越強，因此，LJPA-PU LJPA-P2和LJPA-P3均為酸性多糖。由圖2可知，海帶抗氧化多糖各組分的抗氧化能力具有顯著性差異，圖2Α表示海帶抗氧化多糖各組分的氧自由基清除能力，LJPA-P3的ORAC值為1247.22 μ mo I Trolox/g,是LJPA-P的 ORAC 值(305.77 μ mo I Trolox/g)的 4 倍，甚至是 LJPA-P1 (129.0lymol Trolox/g)和LJPA-P2 (135.53 μ mo I Trolox/g)的10倍，LJPA-P3具有最強的氧自由基清除能力；圖2B表示海帶抗氧化多糖各組分的ABTS自由基清除能力，LJPA-P3的清除能力隨濃度增大的速度最快，LJPA-P次之，LJPA-Pl和LJPA-P2較慢，當多糖濃度為4mg/mL，LJPA-P3顯示出最強的ABTS自由基清除能力，清除能力達70%。兩種抗氧能力評價體系均表明LJPA-P3具有較強的抗氧化活性。由表I可知，LJPA-Pl和LJPA-P2幾乎不含硫酸基，而LJPA-P3的硫酸基含量是LJPA-P的3倍，表明LJPA-P3具有較高含量的硫酸基。由表2可知，LJPA-P3的單糖組成最為特別，只含有半乳糖與少量的巖藻糖和甘露糖，摩爾比為26.1: 1.3:1，半乳糖是LJPA-P3的主要糖骨架構成。綜上所述，本專利所得的LJPA-P3是一種具有較強抗氧化能力，且具有聞含量硫酸基和半乳糖的海帶多糖。
權利要求
1.一種海帶抗氧化多糖的提取方法，其特征在于包括如下步驟 (1)海帶除沙洗凈，晾干，粉碎，得提取原料； (2)在提取原料中加入20-40倍重量蒸餾水，在100-125°C下提取2_5小時，過濾去除上清液，分離得到海帶渣； (3)將步驟(2)所得的海帶渣用有機酸溶劑提取多糖，即于110-125°C下提取2-4小時，過濾，分離固液，得多糖提取液，用氫氧化鉀調節(jié)多糖提取液PH值至6. 5-7. O ； (4)將步驟(3)所得的多糖提取液進行真空濃縮，至原來體積的1/6-1/4，得濃縮液； (5)在濃縮液中加入乙醇，混合均勻，在0-4°C下靜置6-12小時，過濾，除去上層清液部分，得多糖沉淀； (6)收集沉淀物，冷凍干燥，獲得海帶抗氧化多糖LJPA； (7)用蒸懼水溶解海帶抗氧化多糖,采用Sevag法去除游離蛋白質,將Sevag試劑加入海帶抗氧化多糖溶液中，室溫振蕩30-40min,離心去除游離蛋白沉淀,重復前述Sevag法5-6次去除游離蛋白質，除蛋白后的多糖溶液加入乙醇，混合均勻，0-4°C靜置6-12h，離心，除去上層清夜，得除蛋白后的多糖沉淀物； (8)將步驟(7)所得的多糖沉淀物進行透析除鹽，冷凍干燥，獲得抗氧化多糖LJPA-P； (9)用蒸餾水溶解多糖LJPA-P，采用DEAESepharose Fast Flow柱層析進行分離，分別用0M、0. 1M、0. 2M和O. 3 M的NaCl水溶液進行洗脫，收集O. 3M濃度下洗脫液； (10)將步驟(9)所得的洗脫液進行透析除鹽，冷凍干燥，得多糖LJPA-P3。
2.根據權利要求I所述的海帶抗氧化多糖的提取方法，其特征在于步驟(I)所述海帶粉碎為粉碎至20-80目。
3.根據權利要求I所述的海帶抗氧化多糖的提取方法，其特征在于步驟(3)所述有機酸溶劑為檸檬酸、蘋果酸或醋酸中任意一種，且溶液的PH值為I. 5-3。
4.根據權利要求I所述的海帶抗氧化多糖的提取方法，其特征在于步驟(3)所述有機酸溶液的用量按海帶渣干重的20-40倍加入。
5.根據權利要求I所述的海帶抗氧化多糖的提取方法，其特征在于步驟(5)、(7)所述乙醇添加量滿足混合均勻后乙醇最終濃度為70-85% (v/v)0
6.根據權利要求I所述的海帶抗氧化多糖的提取方法，其特征在于步驟(7)所述Sevag試劑由氯仿和正丁醇按5:1-4:1的體積比例配制。
7.根據權利要求I所述的海帶抗氧化多糖的提取方法，其特征在于步驟(7)所述Sevag試劑的用量按海帶抗氧化多糖溶液體積的1/5-1/4加入。
8.根據權利要求I所述的海帶抗氧化多糖的提取方法，其特征在于步驟(8)、(10)所述透析除鹽的透析袋規(guī)格為800-1200Da的截留分子量。
全文摘要
本發(fā)明公開一種海帶抗氧化多糖的提取方法。本發(fā)明公開一種新型的海帶功能性多糖的提取方法，通過有機酸溶劑提取、濃縮和乙醇沉淀獲得具有抗氧化活性的海帶多糖，并采用柱層析法分離得到高硫酸基、高半乳糖含量的海帶多糖組分。該海帶多糖組分具有獨特的結構特性，以及較強的抗氧化活性功能。
文檔編號C08B37/00GK103254324SQ20131020889
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月30日 優(yōu)先權日2013年5月30日
發(fā)明者趙謀明, 崔春, 盧茳虹, 任嬌艷, 趙海峰 申請人:華南理工大學