脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺、制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供脂肪烴基接枝低分子量聚乙烯亞胺、其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明采用一步合成法將脂肪烴基接枝于低分子量聚乙烯亞胺的氨基上，脂肪烴基接枝后的低分子量聚乙烯亞胺與核酸復(fù)合形成的復(fù)合顆粒在水溶液中能自組裝形成膠束狀結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性大大提高；接枝后材料的親脂性特征增加了材料與細(xì)胞的親和力，提高核酸遞送效率的同時(shí)保持了低分子量聚乙烯亞胺較低的細(xì)胞毒性。另外，本發(fā)明提供的脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺在血清存在條件下遞送質(zhì)粒DNA的最高轉(zhuǎn)染效率和遞送siRNA的靶基因沉默效率與市售lipofectamine2000相當(dāng)，且無明顯細(xì)胞毒性，是一種高效低毒的核酸遞送載體，具有較好的應(yīng)用前景。
【專利說明】脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺、制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，涉及一種聚合物載體材料，具體涉及一種脂肪烴 基接枝的低分子量聚乙烯亞胺衍生物、其制備方法及用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 核酸治療是治療多種先天和后天疾病的一種有力工具，但是如何實(shí)現(xiàn)核酸藥物安 全有效的體內(nèi)遞送是核酸治療的一大技術(shù)瓶頸。目前常用的核酸輸送載體可以分為重組病 毒載體和人工合成載體(非病毒載體)。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但是制備及純化困難，攜載核 酸容量小，且具有潛在致病性。非病毒載體被認(rèn)為是比病毒載體更理想的核酸藥物輸送載 體。
[0003] 非病毒載體主要包括天然高分子和合成高分子兩大類。天然高分子來源受限且質(zhì) 量不易控制；合成高分子材料因來源可靠，質(zhì)量穩(wěn)定而更受青睞。在合成高分子材料中，聚 乙烯亞胺（P〇lyethylenimine，PEI)是目前研究最廣泛的一類聚陽離子非病毒載體。分子 量為25KDa的分枝狀PEI和In vivo jetPEI? (分子量為22KDa的直線型PEI)分別被認(rèn)為 是體外核酸遞送和體內(nèi)核酸遞送的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，未經(jīng)化學(xué)改性的PEI存在轉(zhuǎn)染活性-毒 性的相互制約關(guān)系，即PEI分子量越大，轉(zhuǎn)染活性越高，但同時(shí)毒性也越大。
[0004] 為了平衡聚乙烯亞胺的毒性和轉(zhuǎn)染活性，現(xiàn)在多采用結(jié)構(gòu)修飾的方法對(duì) 聚乙烯亞胺進(jìn)行化學(xué)改性，如采用PLGA嫁接分子量為22K Da的直線型PEI (參 見 Chumakova 0V，Liopo AV，Andreev VG et al. Composition of PLGA and PEI/DN nanoparticles improves ultrasound-mediated gene delivery in solid tumors in vivo. Cancer Lett. 2008;261 (2) :215-225.);采用肝素嫁接分子量為 18K 的分枝狀 PEI (參見 Jeon 0, Yang HS, Lee TJ, Kim BS. Heparin-conjugated polyethylenimine for gene delivery. J. Control. Release2008; 132 (3) : 236-242.);米用透明質(zhì)酸嫁接 分子量為 25K 的分枝狀 PEI (參見 Jiang G, Park K, Kim J, Kim KS, Hahn SK. Target specifc intracellular delivery of siRNA/PEI - HA complex by receptor mediated endocytosis.Mol.Pharm. 2009;6(3) :727-737.);采用 PEG 嫁接分子量為 25K 的分枝狀 PEI (參見 Merkel 0M, Beyerle A, Librizzi D et al. Nonviral siRNA delivery to the lung:investigation of PEG - PEI polyplexes and their in vivo performance. Mol. Pharm. 2009; 6 (4) :1246-1260.)。中國(guó)專利號(hào)CN102181053A公開了名稱為"一種疏水基團(tuán) 修飾的聚乙烯亞胺衍生物及其應(yīng)用"的發(fā)明專利，該專利提供了一種酸敏感疏水改性的聚 乙烯亞胺(分子量為9. 5K-10. 5K)，該修飾方法增強(qiáng)了 PEI與DNA的復(fù)合能力，且材料細(xì)胞毒 性較低。中國(guó)專利號(hào)CN101704949A公開了名稱為"丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺、制 法和在基因傳遞中的應(yīng)用"，該專利對(duì)分子量為25K的分枝狀PEI修飾后，不僅提高了轉(zhuǎn)染 效率，而且大大降低了毒性。
[0005] 前述文獻(xiàn)報(bào)道和專利等都是對(duì)大分子量PEI進(jìn)行化學(xué)改性，降低其毒性的同時(shí)保 留或增強(qiáng)其轉(zhuǎn)染活性，而對(duì)小分子量PEI的化學(xué)改性研究相對(duì)較少。因?yàn)椋毡檎J(rèn)為小分 子量的PEI (Mw < 2000)細(xì)胞毒性較小，但其轉(zhuǎn)染效率低下，無法達(dá)到治療的目的。中國(guó)專 利號(hào)CN102391509A公開了名為"聚乙烯亞胺衍生物及其制備方法和應(yīng)用"的發(fā)明專利，該 專利采用泊洛沙姆嫁接分子量為2000的分枝狀PEI，所得PEI衍生物毒性小，且轉(zhuǎn)染效率 高。采用膽固醇氯甲酸鹽對(duì)分子量為1800的分枝狀PEI進(jìn)行化學(xué)修飾后，毒性低，且體內(nèi) 遞送 siRNA 效率高（參見 Kim WJ, Chang CW, Lee M, Kim SW. Efficient siRNA delivery using water soluble lipopolymer for anti-angiogenic gene therapy. J. Control. Release2007; 118:357-363.)。以上專利及文獻(xiàn)結(jié)果說明，對(duì)小分子量PEI進(jìn)行化學(xué)修飾， 在增強(qiáng)其轉(zhuǎn)染活性的同時(shí)保留其低毒性是有可能的。
[0006] 目前，應(yīng)用比較成熟的市售轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000雖然轉(zhuǎn)染效率高，但毒 性較大，且價(jià)格昂貴，因此亟需開發(fā)高效安全且經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)染試劑。
[0007] 經(jīng)專利查詢及文獻(xiàn)檢索，目前尚無采用脂肪烴基接枝小分子量分枝狀PEI的文獻(xiàn) 報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺，其在 體內(nèi)外的穩(wěn)定性好，細(xì)胞毒性小，且轉(zhuǎn)染效率高。
[0009] 此外，還需要提供一種脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺的制備方法及其作為 核酸載體的應(yīng)用。
[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺，其分子 式如下：
[0012]

【權(quán)利要求】
1. 一種脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺，其特征在于，其分子式如下：
式中，X和y表示重復(fù)單元的個(gè)數(shù)；R基團(tuán)為脂肪經(jīng)基CH3(CH2)n-, η表示亞甲基CH2的 個(gè)數(shù)，聚乙烯亞胺的分子量為100-2000g/mol。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺，其特征在于，脂肪烴 基接枝的低分子量聚乙烯亞胺的分子式中，X與y之間滿足x=2y的配比關(guān)系；脂肪烴基 CH3(CH2)n-中的n=6?14,即脂肪烴基是己烷基、庚烷基、辛烷基、壬烷基、癸烷基、i^一烷 基、十二烷基、十三烷基或十四烷基，優(yōu)選己烷基和十二烷基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺的制備方法，其特 征在于，包括如下步驟： (1) 將聚乙烯亞胺溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中，在30-40°C下攪拌溶解，得到聚 乙烯亞胺溶液； (2) 將溴代或碘代脂肪烴溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶劑中，以一定速度滴加至聚乙 烯亞胺溶液中，在30-40°C下，避光反應(yīng)12-48h ; (3) 將所得混合溶液旋干溶劑得到半固體膏狀物，將該半固體膏狀物混懸于5-10ml蒸 餾水中，然后用一定截留分子量的透析袋進(jìn)行透析，冷凍干燥后制得脂肪烴基接枝的聚乙 烯亞胺。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，二氯甲烷和甲醇混合溶劑的體積比 為 90:10-99:1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，透析方法為先用40-60%乙醇溶液透 析4-6次，再用去離子水透析24-48h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺用于制備體內(nèi)或體 外核酸遞送載體的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺的應(yīng)用，其特征在于， 作為體內(nèi)或體外核酸遞送載體時(shí)，遞送的質(zhì)粒DNA的大小為l-30Kb。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺的應(yīng)用，其特征在于， 作為體內(nèi)或體外核酸遞送載體時(shí)，遞送的siRNA的大小為15-30bp。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺的應(yīng)用，其特征在于， 作為體內(nèi)或體外核酸遞送載體時(shí)，脂肪烴基接枝的低分子量聚乙烯亞胺與核酸的質(zhì)量比為 1:1-20:1，優(yōu)選 3:1-10:1。
【文檔編號(hào)】C08G73/04GK104231265SQ201310244851
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月19日
【發(fā)明者】高鐘稿, 黃偉, 柳珊, 楊飛飛, 金明姬 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所