一種交聯(lián)劑改性的透明質(zhì)酸-聚天冬氨酸原位交聯(lián)型水凝膠的制備方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種交聯(lián)劑改性的透明質(zhì)酸-聚天冬氨酸原位交聯(lián)型水凝膠的制備方法。本發(fā)明以具有雙醛基團或雙胺基團的物質(zhì)為改性交聯(lián)劑，在緩沖液中先后或同時加入交聯(lián)劑，具有雙胺基團的聚天冬氨酸衍生物和具有雙醛基團的透明質(zhì)酸衍生物，通過縮合反應(yīng)使其凝膠化。本發(fā)明的優(yōu)點為該水凝膠具有可調(diào)控的力學(xué)強度，凝膠化時間短，水凝膠性能穩(wěn)定，生物相容性好，生物可降解，可以通過注射的手段用于組織工程，栓塞材料和藥物控釋領(lǐng)域?！緦＠f明】一種交聯(lián)劑改性的透明質(zhì)酸-聚天冬氨酸原位交聯(lián)型水凝膠的制備方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬水凝膠系列，涉及交聯(lián)劑改性的透明質(zhì)酸和聚天冬氨酸原位交聯(lián)型凝膠?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]水凝膠是一種由高分子聚合物形成的，含水量達90%以上，且具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的的材料。這種材料質(zhì)地柔軟，生物相容性好，目前廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。[0003]近年來，可注射的原位交聯(lián)水凝膠也越來越受到人們的關(guān)注?？勺⑸湓唤宦?lián)水凝膠的特征在于，在注射之前呈可流動的液態(tài)，當(dāng)注射到目標(biāo)位置后，可形成與目標(biāo)位置形狀完全吻合的膠體。這種可注射的特性，不僅使得操作過程簡單方便，而且可避免植入手術(shù)給患者帶來的痛苦，大大降低手術(shù)的創(chuàng)傷性。[0004]透明質(zhì)酸廣泛存在于生物體內(nèi)，負(fù)責(zé)組織間的連接，具有很好的保水和潤滑的作用。透明質(zhì)酸用于人體是不會被免疫系統(tǒng)當(dāng)成外來物質(zhì)，不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，具有很好的生物相容性和生物可降解性。而且透明質(zhì)酸在骨組織再生，抗腫瘤以及傷口愈合等過程中發(fā)揮重要的作用，常被用于藥物控釋，組織工程及手術(shù)防粘連等領(lǐng)域。[0005]然而正因為透明質(zhì)酸具有上述的這些優(yōu)點，吸收迅速，降解速度快等，導(dǎo)致了透明質(zhì)酸材料的硬度，機械強度和穩(wěn)定性受到了一定的限制。因此有必要對透明質(zhì)酸進行改性或者引入交聯(lián)劑來提高材料的力學(xué)性能，使其得到更好的應(yīng)用。[0006]聚天冬氨酸也具有很好的生物相容性和生物可降解性，其主鏈上的肽鍵易受微生物的作用而斷裂，降解產(chǎn)物只有氨，水和二氧化碳。聚天冬氨酸也是一種環(huán)境友好型性的化學(xué)品，廣泛用于水處理，醫(yī)藥，農(nóng)業(yè)及日化行業(yè)。[0007]2007年，LongLiu,(Preparationandcharacterizationofsponge-likecompositesbycross-linkinghyaluronicacidandcarboxymethyIcellulosesodiumwithadipicdihydrazide,EuropeanPolymerJournal43(2007))制備了一種透明質(zhì)酸-羧甲基纖維素水凝膠，它以透明質(zhì)酸和羧甲基纖維素為原料，以1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳酰亞胺為交聯(lián)劑，在pH=4.75的水相中實現(xiàn)透明質(zhì)酸和羧甲基纖維素之間的交聯(lián)，生成水凝膠。其缺點在于反應(yīng)需要使用交聯(lián)劑，降低凝膠體系的生物相容性；且凝膠化時間長，不能實現(xiàn)原位交聯(lián)，限制了凝膠的應(yīng)用。[0008]已報道的原位交聯(lián)型水凝膠，大多是依靠天然大分子的物理性能或其離子鍵、靜電作用力或疏水作用力實現(xiàn)溶液-膠體之間的轉(zhuǎn)化。如MollyS.ShoichetCFast-gellinginjectableblendofhyaluronanandmethylcelluloseforintrathecal,localizeddeliverytotheinjuredspinalcord,Biomaterials,27(2006))報道了一種快速凝膠化的水凝膠，它利用甲基纖維素的溫敏性實現(xiàn)凝膠化。其缺點在于溶液-膠體之間的轉(zhuǎn)化是可逆的，導(dǎo)致水凝膠的性能不穩(wěn)定，極大程度上限制了水凝膠子啊生物領(lǐng)域的應(yīng)用。也有極少數(shù)的例子是利用聚合物之間的化學(xué)交聯(lián)制備可注射的原位交聯(lián)的7jC凝膠。如RuiZhang(Detailedcharacterizationofaninjectablehyaluronicacid-polyaspartylhydrazidehydrogelforproteindelivery,CarbohydratePolymers,4(2011))利用醛基化透明質(zhì)酸和聚天冬酰肼上醛基與酰肼基團之間的縮合反應(yīng)，制備了一種快速凝膠化的，可注射的原位交聯(lián)水凝膠。其缺點在于交聯(lián)時間過快導(dǎo)致水凝膠的力學(xué)強度差，限制了水凝膠的應(yīng)用。[0009]鑒于此，我們利用交聯(lián)劑交聯(lián)劑預(yù)處理聚天冬酰肼后，再和具有雙醛結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸進行進一步的縮合反應(yīng)制備出力學(xué)性能好，性能穩(wěn)定的可注射原位交聯(lián)型水凝膠?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0010]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于制備一種工藝簡單、凝膠化時間短且可控制、力學(xué)性能好、性能穩(wěn)定且生物相容性好的原位交聯(lián)的水凝膠。[0011]一種交聯(lián)劑改性的透明質(zhì)酸-聚天冬氨酸原位交聯(lián)型水凝膠的制備方法，包括如下步驟:[0012]在pH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中先后或同時加入透明質(zhì)酸衍生物，聚天冬氨酸衍生物和交聯(lián)劑；所述交聯(lián)劑為C2~8的二胺、水合肼、賴氨酸、C2~8的二醛、鄰苯二甲醛或京尼平；凝膠化時間為3秒~30分鐘；[0013]交聯(lián)劑的加入有如下幾種方式之一:[0014](I)按交聯(lián)劑的濃度為2X10_4~8X10_2mol/L，將交聯(lián)劑溶解在pH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中，得到交聯(lián)劑的緩沖溶液，透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物分別按照質(zhì)量百分比為I~10%溶解在交聯(lián)劑的緩沖溶液中，在4~50°C下，按透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物的質(zhì)量比為4:(I~16)混合；[0015](2)透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物分別按照質(zhì)量百分比為I~10%溶解在pH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中，在透明質(zhì)酸衍生物的緩沖溶液中加入交聯(lián)劑，在4~50°C下，反應(yīng)I分鐘~48小時后，與聚天冬氨酸衍生物的緩沖溶液按透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物的質(zhì)量比為4:(I~16)混合，混合溶液中交聯(lián)劑的濃度為2X10-4~8Χl(T2mol/L；[0016](3)透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物分別按照質(zhì)量百分比為I~10%溶解在PH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中，在聚天冬氨酸衍生物的緩沖溶液中加入交聯(lián)劑，在4~50°C下，反應(yīng)I分鐘~48小時后，與透明質(zhì)酸衍生物的緩沖溶液按透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物的質(zhì)量比為4:(I~16)混合，混合溶液中交聯(lián)劑的濃度為2X10-4~8Χl(T2mol/L；[0017](4)透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物分別按照質(zhì)量百分比為I~10%溶解在pH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中，在4~50°C下，按透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物的質(zhì)量比為4:(I~16)混合后，滴加交聯(lián)劑，混合溶液中交聯(lián)劑的濃度為2X10-4~8Χl(T2mol/L。[0018]所述緩沖液為檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液、模擬人工體液或人工淚液。[0019]所述的交聯(lián)劑為C2~8的二胺、水合肼、賴氨酸、C2~8的二醛、鄰苯二甲醛、京尼平。交聯(lián)劑的添加量為2X10_4~8X10_2mol/L，交聯(lián)劑用量的多少不僅是能否形成水凝膠的關(guān)鍵因素，還直接影響到水凝膠的成膠時間、成膠量、平衡溶脹比、三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能等理化性質(zhì)。一般來說隨著交聯(lián)劑用量的增加凝膠的凝膠化時間隨之縮短，生成的凝膠空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊湊，力學(xué)性能也隨之提高。但交聯(lián)劑的用量過多，將會因過量交聯(lián)劑的使用而具有較大的細(xì)胞毒性，限制水凝膠的應(yīng)用；交聯(lián)劑用量過少時，則改性效果不明顯。[0020]所述交聯(lián)反應(yīng)溫度范圍優(yōu)化為4~50°C。透明質(zhì)酸是一種多肽結(jié)構(gòu)，耐受溫度范圍較窄，若反應(yīng)溫度超過50°C，透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)易受到破壞，不宜使用過高的溫度。[0021]所述四種制備方法中最優(yōu)為(1)，即先按交聯(lián)劑的濃度為2X10_4~8X10_2mol/L，將交聯(lián)劑溶解在pH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中，得到交聯(lián)劑的緩沖溶液，再將透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物分別按照質(zhì)量百分比為I~10%溶解在交聯(lián)劑的緩沖溶液中，這種方法有利于交聯(lián)劑均勻分散在水凝膠體系中，形成更均一的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。[0022]所述透明質(zhì)酸衍生物的制備方法如下:將透明質(zhì)酸按質(zhì)量百分比0.1~5%溶解在pH值范圍為2~7的水中，在溫度為O~50°C的條件下，加入氧化劑氧化透明質(zhì)酸I~24h，再用乙二醇終止反應(yīng)，再將混合物用水透析3d，凍干得到具有雙醛基團的透明質(zhì)酸衍生物；[0023]所述氧化劑為高錳酸鉀、高碘酸鈉、雙氧水，氧化劑與透明質(zhì)酸的比例為5:(1~25)。[0024]所述聚天冬氨酸衍生物制備方法:將聚琥珀酰亞胺溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，在溫度為-10~80°C的條件下，用雙胺類物質(zhì)中的胺基進攻聚琥珀酰亞胺中的酰亞胺鍵使其開環(huán)，接枝改性聚琥珀酰亞胺，反應(yīng)時間為I~12h，生成的產(chǎn)物以沉淀的方式從溶劑中析出，再將沉淀物溶解于去離子水，`經(jīng)超濾凍干得到具有雙胺基團的聚天冬氨酸衍生物；[0025]所述雙胺類物質(zhì)為C2~8的二胺、水合肼或賴氨酸，雙胺類物質(zhì)與聚琥珀酰亞胺的質(zhì)量比例優(yōu)化為5:(I~25)。[0026]透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物分別按照質(zhì)量百分比I~10%溶解在緩沖溶液和中。隨著質(zhì)量百分比的增加，凝膠化時間隨之縮短，生成的凝膠空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊湊，力學(xué)性能也隨之提高；但當(dāng)質(zhì)量百分比過高時，溶液的粘稠度顯著增大，從而導(dǎo)致兩種大分子上的官能團不能完全交聯(lián)，生成的凝膠交聯(lián)度低，空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變疏松，力學(xué)性能下降。[0027]所述緩沖溶液為檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液、模擬人工體液或人工淚液；不同的緩沖液可以提供不同的PH值緩沖。[0028]所述緩沖液的pH值范圍控制為5.0~8.0，其濃度控制為0.01~0.5mol/L。緩沖液的PH值以及濃度是凝膠化時間長短的決定因素，也影響了水凝膠的理化性能。[0029]所述透明質(zhì)酸衍生物及聚天冬氨酸衍生物緩沖溶液按4:(I~16)的比例混合反應(yīng)，任何一種高聚物過量都會延長凝膠化時間，造成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不完整，降低水凝膠的力學(xué)性能。[0030]有益效果:[0031]本發(fā)明制備工藝簡單，反應(yīng)過程溫和。以具有雙醛基團或雙胺基團的物質(zhì)為改性交聯(lián)劑，在緩沖液中先后或同時加入交聯(lián)劑，具有雙胺基團的聚天冬氨酸衍生物和具有雙醛集基團的透明質(zhì)酸衍生物，通過縮合反應(yīng)使其凝膠化?？赏ㄟ^改變透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物的濃度，溶劑的PH值和濃度、交聯(lián)劑的選擇，用量及添加方式、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間來控制最終形成水凝膠的凝膠化時間，空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的緊湊性及其力學(xué)性能。[0032]交聯(lián)劑和透明質(zhì)酸衍生物及聚天冬氨酸衍生物之間發(fā)生的主要是氨基和醛基之間的縮合反應(yīng)，實現(xiàn)溶液-膠體之間的轉(zhuǎn)變，交聯(lián)制備出無交聯(lián)劑殘留，凝膠化時間短，且可通過交聯(lián)劑的種類、緩沖液的種類及其PH值、溶劑濃度的調(diào)節(jié)實現(xiàn)控制，水是凝膠化過程中的唯一副產(chǎn)物，被包裹在水凝膠中。[0033]制備得到的水凝膠性能穩(wěn)定、生物可降解、體外降解實驗表明在37°C水浴條件下，將水凝膠浸泡在人工淚液中28d，水凝膠的降解率為3~40%。[0034]制備得到的水凝膠生物相容性好，細(xì)胞毒性試驗結(jié)果符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，水凝膠適用于組織工程，栓塞材料，填充材料或藥物緩釋領(lǐng)域?！揪唧w實施方式】:[0035]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明中交聯(lián)劑改性的透明質(zhì)酸-聚天冬氨酸原位交聯(lián)型水凝膠及其制備方法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的培養(yǎng)劑組分、含量、培養(yǎng)條件、分離提取條件進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。[0036]以下給出本發(fā)明的實施例，進一步對本發(fā)明進行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于此。[0037]實施例1[0038]稱取0.015g乙二胺溶于50mL磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液中(ρΗ=5.0，濃度為0.2mol/L)中，得到乙二胺的緩沖溶液。[0039]稱取0.01g醛基化透明質(zhì)酸和0.01g聚天冬酰肼分別溶解在ImL上述乙二胺的緩沖溶液中，待其完全溶解后，混合ImL醛基化透明質(zhì)酸溶液和0.5mL聚天冬酰肼溶液，再放置于10°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為25min20.43s，彈性模量為4009Pa。[0040]實施例2[0041]稱取0.02g醛基化透明質(zhì)酸和0.02g聚天冬酰肼分別溶解在ImL檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液(pH=6.0，濃度為0.lmol/L)中，待其完全溶解后，混合ImL醛基化透明質(zhì)酸溶液和ImL聚天冬酰肼溶液，再向其中加入0.006g乙二胺，最后放置于20°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為13min58.09s，彈性模量為5991Pa。[0042]實施例3[0043]稱取0.012g戊二胺溶于50mLTris-鹽酸緩沖液(ρΗ=7.4，濃度為0.05mol/L)中，得到戊二胺的緩沖溶液。[0044]稱取0.05g醛基化透明質(zhì)酸溶解在ImLTris-鹽酸緩沖液(pH=7.4，濃度為0.05mol/L)中，得到醛基化透明質(zhì)酸的緩沖溶液。[0045]稱取0.045g聚天冬酰肼溶解在0.9mL上述戊二胺的緩沖溶液中，置于30°C水浴鍋中，反應(yīng)48h后，與0.3mL醛基化透明質(zhì)酸的緩沖溶液混合，仍置于30°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為25min37s，彈性模量為3432Pa。[0046]實施例4[0047]稱取0.0612g戊二胺溶于50mL磷酸二氫鉀-氫氧化鈉(ρΗ=8.0，濃度為0.01mol/L)中，得到戊二胺的緩沖溶液。[0048]稱取0.08g聚天冬酰肼溶解在ImL磷酸二氫鉀-氫氧化鈉(pH=8.0，濃度為0.01mol/L)中，得到聚天冬酰肼的緩沖溶液。[0049]稱取0.04g醛基化透明質(zhì)酸溶解在0.5mL上述戊二胺的緩沖溶液中，置于40°C水浴鍋中，反應(yīng)3min后，與ImL聚天冬酰肼的緩沖溶液混合，仍置于40°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為6min48.35s，彈性模量為5521Pa。[0050]實施例5[0051]稱取0.00232g己二胺溶于50mL磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液中(ρΗ=5.0，濃度為0.01mol/L)中，得到己二胺的緩沖溶液。[0052]稱取0.08g醛基化透明質(zhì)酸和0.08g聚天冬酰肼分別溶解在ImL上述己二胺的緩沖溶液中，待其完全溶解后，混合0.3mL醛基化透明質(zhì)酸溶液和0.9mL聚天冬酰肼溶液，再放置于50°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為13min59.98s，彈性模量為5360Pao`[0053]實施例6[0054]稱取0.1g醛基化透明質(zhì)酸和0.1g聚天冬酰肼分別溶解在ImL檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液(pH=6.0，濃度為0.2mol/L)中，待其完全溶解后，混合ImL醛基化透明質(zhì)酸溶液和ImL聚天冬酰肼溶液，再向其中加入0.007g己二胺，最后放置于10°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為8min58.09s，彈性模量為6402Pa。[0055]實施例7[0056]稱取0.0044g賴氨酸溶于50mL人工淚液(ρΗ=7.4，濃度為0.05mol/L)中，得到賴氨酸的緩沖溶液。[0057]稱取0.01g醛基化透明質(zhì)酸溶解在ImL人工淚液(pH=7.4，濃度為0.05mol/L)中，得到醛基化透明質(zhì)酸的緩沖溶液。[0058]稱取0.01g聚天冬酰肼溶解在ImL上述賴氨酸的緩沖溶液中，置于20°C水浴鍋中，反應(yīng)30h后，與ImL醛基化透明質(zhì)酸的緩沖溶液混合，仍置于20°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為19min7s，彈性模量為3837Pa。[0059]實施例8[0060]稱取0.0294g賴氨酸溶于50mL磷酸二氫鉀-氫氧化鈉(ρΗ=8.0，濃度為0.01mol/L)中，得到賴氨酸的緩沖溶液。[0061]稱取0.05g聚天冬酰肼溶解在ImL磷酸二氫鉀-氫氧化鈉(pH=8.0，濃度為0.01mol/L)中，得到聚天冬酰肼的緩沖溶液。[0062]稱取0.045g醛基化透明質(zhì)酸溶解在0.9mL上述戊二胺的緩沖溶液中，置于30°C水浴鍋中，反應(yīng)10min后，與0.3mL聚天冬酰肼的緩沖溶液混合，仍置于30°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為23min8.35s，彈性模量為4675Pa。[0063]實施例9[0064]稱取0.094g水合肼溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%)溶于50mL磷酸氫二鉀-磷酸二氫鈉緩沖溶液中(pH=5.0，濃度為0.05mol/L)中，得到水合肼的緩沖溶液。[0065]稱取0.08g醛基化透明質(zhì)酸和0.08g聚天冬酰肼分別溶解在ImL上述賴氨酸的緩沖溶液中，待其完全溶解后，混合0.5mL醛基化透明質(zhì)酸溶液和ImL聚天冬酰肼溶液，再放置于40°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為15.98s，彈性模量為8790Pa。[0066]實施例10[0067]稱取0.1g醛基化透明質(zhì)酸和0.1g聚天冬酰肼分別溶解在ImL檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液(pH=6.0，濃度為0.01mol/L)中，待其完全溶解后，混合0.3mL醛基化透明質(zhì)酸溶液和0.9mL聚天冬酰肼溶液，再向其中加入0.0015g水合肼溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%)，最后放置于50°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為10min38.09s，彈性模量為7132Pa。[0068]實施例11[0069]稱取0.058g乙二醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)溶于50mL模擬人工體液(ρΗ=7.4，濃度為0.2mol/L)中，得到乙二醛的緩沖溶液。[0070]稱取0.01g醛基化透明質(zhì)酸溶解在ImL模擬人工體液(pH=7.4，濃度為0.2mol/L)中，得到醛基化透明質(zhì)酸的緩沖溶液。[0071]稱取0.005g聚天冬酰肼溶解在0.5mL上述乙二醛的緩沖溶液中，置于10°C水浴鍋中，反應(yīng)Ih后，與ImL醛基化透明質(zhì)酸的緩沖溶液混合，仍置于10°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為26min24.56s，彈性模量為3698Pa。[0072]實施例12[0073]稱取0.0039g乙二醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%)溶于50mL磷酸二氫鉀-氫氧化鈉(pH=8.0，濃度為0.lmol/L)中，得到乙二醛的緩沖溶液。[0074]稱取0.05g聚天冬酰肼溶解在ImL磷酸二氫鉀-氫氧化鈉(pH=8.0，濃度為0.lmol/L)中，得到聚天冬酰肼的緩沖溶液。[0075]稱取0.05g醛基化透明質(zhì)酸溶解在ImL上述乙二醛的緩沖溶液中，置于20°C水浴鍋中，反應(yīng)Ih后，與ImL聚天冬酰肼的緩沖溶液混合，仍置于20°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為8min59.87s，彈性模量為4237Pa。[0076]實施例13[0077]稱取0.05g戊二醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%)溶于50mL磷酸氫二鉀-磷酸二氫鈉緩沖溶液中(pH=5.0，濃度為0.lmol/L)中，得到戊二醛的緩沖溶液。[0078]稱取0.08g醛基化透明質(zhì)酸和0.08g聚天冬酰肼分別溶解在ImL上述戊二醛的緩沖溶液中，待其完全溶解后，混合0.9mL醛基化透明質(zhì)酸溶液和0.3mL聚天冬酰肼溶液，再放置于30°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為17min5.09s，彈性模量為6505Pa。[0079]實施例14[0080]稱取0.1g醛基化透明質(zhì)酸和0.1g聚天冬酰肼分別溶解在ImL檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液(pH=6.0，濃度為0.05mol/L)中，待其完全溶解后，混合0.5mL醛基化透明質(zhì)酸溶液和ImL聚天冬酰肼溶液，再向其中加入0.0075g戊二醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%)，最后放置于40°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為58.07s，彈性模量為7327Pa。[0081]實施例15[0082]稱取0.0038g己二醛溶于50mLTris-鹽酸緩沖液(pH=7.4，濃度為0.01mol/L)中，得到己二醛的緩沖溶液。[0083]稱取0.01g醛基化透明質(zhì)酸溶解在ImLTris-鹽酸緩沖液(pH=7.4，濃度為0.01mol/L)中，得到醛基化透明質(zhì)酸的緩沖溶液。[0084]稱取0.009g聚天冬酰肼溶解在0.9mL上述乙二醛的緩沖溶液中，置于50°C水浴鍋中，反應(yīng)2h后，與0.3mL醛基化透明質(zhì)酸的緩沖溶液混合，仍置于50°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為28min36.87s，彈性模量為3478Pa。[0085]實施例16[0086]稱取0.0855g己二醛溶于50mL磷酸二氫鉀-氫氧化鈉(ρΗ=8.0,濃度為0.2mol/L)中，得到己二醛的緩沖溶液。[0087]稱取0.05g聚天冬酰肼溶解在ImL磷酸二氫鉀-氫氧化鈉(pH=8.0，濃度為0.2mol/L)中，得到聚天冬酰肼的緩沖溶液。[0088]稱取0.05g醛基化透明質(zhì)酸溶解在ImL上述乙二醛的緩沖溶液中，置于10°C水浴鍋中，反應(yīng)Imin后，與0.5mL聚天冬酰肼的緩沖溶液混合，仍置于10°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為17minl8.35s，彈性模量為6414Pa。[0089]實施例17[0090]稱取0.0023g京尼平溶于50mL磷酸氫二鉀-磷酸二氫鈉緩沖溶液中(pH=5.0，濃度為0.2mol/L)中，得到京尼平的緩沖溶液。[0091]稱取0.08g醛基化透明質(zhì)酸和0.08g聚天冬酰肼分別溶解在ImL上述京尼平的緩沖溶液中，待其完全溶解后，混合ImL醛基化透明質(zhì)酸溶液和ImL聚天冬酰肼溶液，再放置于20°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為4min36.98s，彈性模量為5491Pa。[0092]實施例18[0093]稱取0.0113g京尼平溶于50mL檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液(pH=6.0，濃度為0.2mol/L)中，得到京尼平的緩沖溶液。[0094]稱取0.1g醛基化透明質(zhì)酸和0.1g聚天冬酰肼分別溶解在ImL上述京尼平的緩沖溶液中，待其完全溶解后，混合0.9mL醛基化透明質(zhì)酸溶液和0.3mL聚天冬酰肼溶液，再放置于30°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為17min35.98s，彈性模量為5282Pa。[0095]實施例19[0096]稱取0.06g鄰苯二甲醛溶于50mLTris-鹽酸緩沖液(ρΗ=7.4，濃度為0.05mol/L)中，得到鄰苯二甲醛的緩沖溶液。[0097]稱取0.01g醛基化透明質(zhì)酸溶解在ImLTris-鹽酸緩沖液(pH=7.4，濃度為0.05mol/L)中，得到醛基化透明質(zhì)酸的緩沖溶液。[0098]稱取0.01g聚天冬酰肼溶解在ImL上述鄰苯二甲醛的緩沖溶液中，置于40°C水浴鍋中，反應(yīng)5min后，與0.5mL醛基化透明質(zhì)酸的緩沖溶液混合，仍置于40°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為18min37.83s，彈性模量為4450Pa。[0099]實施例20[0100]稱取0.016g鄰苯二甲醛溶于50mL磷酸二氫鉀-氫氧化鈉(pH=8.0，濃度為0.01mol/L)中，得到鄰苯二甲醛的緩沖溶液。[0101]稱取0.05g聚天冬酰肼溶解在ImL磷酸二氫鉀-氫氧化鈉(pH=8.0，濃度為0.01mol/L)中，得到聚天冬酰肼的緩沖溶液。[0102]稱取0.015g醛基化透明質(zhì)酸溶解在0.3mL上述乙二醛的緩沖溶液中，置于50°C水浴鍋中，反應(yīng)Imin后，與0.9mL聚天冬酰肼的緩沖溶液混合，仍置于50°C水浴中恒溫，靜止制得水凝膠，凝膠化時間為20min4.35s，彈性模量為4156Pa。[0103]實施例1-5中所用醛基化透明質(zhì)酸的制備方法為:稱取0.1g透明質(zhì)酸(分子量為1，200KDa)溶于50mLpH為3.0的水溶液中，待透明質(zhì)酸溶解完畢后加入0.5g雙氧水，在20°C下攪拌反應(yīng)12h，反應(yīng)完后加入20mL乙二醇終止反應(yīng)，再將混合物透析3天去除乙二醇等小分子物質(zhì)，冷凍干燥得到具有雙醛基團的透明質(zhì)酸衍生物，產(chǎn)物醛基含量為33.28%，分子量為390KDa。[0104]實施例6-15中所用醛基化透明質(zhì)酸的制備方法為:稱取0.2g透明質(zhì)酸(分子量為1，200KDa)溶于50mLpH為5.0的水溶液中，待透明質(zhì)酸溶解完畢后加入0.6g高錳酸鉀，在30°C下攪拌反應(yīng)4h，反應(yīng)完后加入20mL乙二醇終止反應(yīng)，再將混合物透析3天去除乙二醇等小分子物質(zhì)，冷凍干燥得到具有雙醛基團的透明質(zhì)酸衍生物，產(chǎn)物醛基含量為51.56%，分子量為730KDa。[0105]實施例16-20中所用醛基化透明質(zhì)酸的制備方法為:稱取0.1g透明質(zhì)酸(分子量為1，200KDa)溶于50mLpH為4.0的水溶液中，待透明質(zhì)酸溶解完畢后加入0.5g雙氧水，在10°C下攪拌反應(yīng)8h，反應(yīng)完后加入20mL乙二醇終止反應(yīng)，再將混合物透析3天去除乙二醇等小分子物質(zhì)，冷凍干燥得到具有雙醛基團的透明質(zhì)酸衍生物，產(chǎn)物醛基含量為42.16%，分子量為270KDa。[0106]實施例1-10中所用聚天冬酰肼的制備方法為:稱取Ig聚琥珀酰亞胺溶解于IOOmLN,N-二甲基甲酰胺中，加入Ig己二胺，在20°C水浴下，攪拌反應(yīng)12h，期間會有沉淀產(chǎn)生。反應(yīng)結(jié)束后過濾收集沉淀物，將沉淀物再次溶解于IOOmL去離子水中，經(jīng)過超濾去除未反應(yīng)的小分子，凍干收集得到具有雙胺基團的聚天冬氨酸衍生物。[0107]實施例11-20中所用聚天冬酰肼的制備方法為:稱取Ig聚琥珀酰亞胺溶解于IOOmLN，N-二甲基甲酰胺中，加入Ig水合肼，在40°C水浴下，攪拌反應(yīng)8h，期間會有沉淀產(chǎn)生。反應(yīng)結(jié)束后過濾收集沉淀物，將沉淀物再次溶解于IOOmL去離子水中，經(jīng)過超濾去除未反應(yīng)的小分子，凍干收集得到具有雙胺基團的聚天冬氨酸衍生物?！緳?quán)利要求】1.一種交聯(lián)劑改性的透明質(zhì)酸-聚天冬氨酸原位交聯(lián)型水凝膠的制備方法，包括如下步驟:在PH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中先后或同時加入透明質(zhì)酸衍生物，聚天冬氨酸衍生物和交聯(lián)劑；所述交聯(lián)劑為C2~8的二胺、水合肼、賴氨酸、C2~8的二醛、鄰苯二甲醛或京尼平；凝膠化時間為3秒~30分鐘；交聯(lián)劑的加入有如下幾種方式之一:(O按交聯(lián)劑的濃度為2X10_4~8X10_2mol/L，將交聯(lián)劑溶解在pH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中，得到交聯(lián)劑的緩沖溶液，透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物分別按照質(zhì)量百分比為I~10%溶解在交聯(lián)劑的緩沖溶液中，在4~50°C下，按透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物的質(zhì)量比為4:(I~16)混合；(2)透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物分別按照質(zhì)量百分比為I~10%溶解在pH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中，在透明質(zhì)酸衍生物的緩沖溶液中加入交聯(lián)劑，在4~50°C下，反應(yīng)I分鐘~48小時后，與聚天冬氨酸衍生物的緩沖溶液按透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物的質(zhì)量比為4:(I~16)混合，混合溶液中交聯(lián)劑的濃度為2Χ10-4~8Xl(T2mol/L；(3)透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物分別按照質(zhì)量百分比為I~10%溶解在pH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中，在聚天冬氨酸衍生物的緩沖溶液中加入交聯(lián)劑，在4~50°C下，反應(yīng)I分鐘~48小時后，與透明質(zhì)酸衍生物的緩沖溶液按透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物的質(zhì)量比為4:(I~16)混合，混合溶液中交聯(lián)劑的濃度為2Χ10-4~8Xl(T2mol/L；(4)透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物分別按照質(zhì)量百分比為I~10%溶解在pH值范圍為5.0~8.0，濃度為0.01~0.5mol/L的緩沖液中，在4~50°C下，按透明質(zhì)酸衍生物和聚天冬氨酸衍生物的質(zhì)量比為4:(I~16)混合后，滴加交聯(lián)劑，混合溶液中交聯(lián)劑的濃度為2XI(T4~8Xl(T2mol/L。2.如權(quán)利要求1所述一種交聯(lián)劑改性的透明質(zhì)酸-聚天冬氨酸原位交聯(lián)型水凝膠的制備方法，其特征在于所述緩沖液為檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液、模擬人工體液或人工淚液?！疚臋n編號】C08L5/08GK103554528SQ201310539910【公開日】2014年2月5日申請日期:2013年11月5日優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日【發(fā)明者】譚天偉,劉敏,曹輝,張睿,孫天玉申請人:北京化工大學(xué)