一種猴頭菌大分子量多糖及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種猴頭菌大分子量多糖及其制備方法，其是通過(guò)水提醇沉、冷凍、溶解制備得到的。本發(fā)明猴頭菌大分子量多糖分子量大于100萬(wàn)，且色素少，多糖含量大大提高，超過(guò)80%；對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞株釋放NO有明顯地促進(jìn)作用，從而可增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤能力。
【專利說(shuō)明】—種猴頭菌大分子量多糖及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食藥用菌提取純化領(lǐng)域，具體地涉及一種猴頭菌大分子量多糖及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]猴頭菌(Hericium erinaceus)是一種食藥兩用菌，肉嫩味美,營(yíng)養(yǎng)豐富。在古代，人們把它與鱉魚(yú)、海參、熊掌刺并列為“四大名菜”，并且有“山珍猴頭，海味燕窩”的美稱。文獻(xiàn)報(bào)道，猴頭菌具有抗?jié)?、抗炎癥、抗腫瘤、降血糖、抗衰老、抗突變、保肝等多方面的藥理作用。猴頭菌多糖作為猴頭菌中最重要的活性成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗氧化延緩衰老、抗炎癥等多種生物活性和藥理作用。
[0003]對(duì)猴頭菌多糖的研究，不同的學(xué)者、不同的品種、不同的提取分離純化方法，結(jié)果不同，但目前關(guān)于猴頭菌多糖的研究主要集中在分子量1-1OKDa部分，對(duì)其中大分子量部分研究較少，且分離純化方法普遍采用水提醇沉、離子交換、樹(shù)脂脫色、凝膠柱純化等方法，得到的多糖純度雖高，但操作過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，且得率非常低，不利于規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明首先提供了一種猴頭菌大分子量多糖，其是通過(guò)如下方法制備得到的:
[0005]①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量達(dá)到50-70%，4°C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀；
[0006]②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~_70°C冷凍，得到冷凍液；
[0007]③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70-100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀；即為猴頭菌大分子量多糖。
[0008]優(yōu)選的，本發(fā)明的猴頭菌大分子量多糖可通過(guò)如下方法制備得到:
[0009]①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量達(dá)到50-70%，4°C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀；
[0010]②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~-70°c冷凍，得到冷凍液；
[0011]③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70_100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀；
[0012]④將步驟③得到的沉淀用水稀釋后，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比濃度達(dá)到20-30%,離心收集沉淀，再用質(zhì)量百分比濃度為20-30%的乙醇溶液洗滌沉淀2-5次，收集沉淀；將沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得到猴頭菌大分子量多糖。
[0013]具體的說(shuō)，本發(fā)明的高純度猴頭菌大分子量多糖，是用如下方法制備得到的:
[0014]①水提醇沉:將新鮮猴頭菌的沸水提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix，冷卻至室溫后，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量為50-70%，4°C靜置過(guò)夜，10000g，離心15min收集沉淀；
[0015]②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，離心去除雜質(zhì)，上清液置于-20~_70°C冷凍過(guò)夜，得到冷凍液；[0016]③溶解:將步驟②中得到的冷凍液置于70-100°C水浴加熱解凍，離心，收集沉淀，即為猴頭菌大分子量多糖。
[0017]進(jìn)一步優(yōu)選的，本發(fā)明的猴頭菌大分子量多糖是通過(guò)如下方法制備得到的:
[0018]①水提醇沉:將新鮮猴頭菌的沸水提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix，冷卻至室溫后，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量為50-70%，4°C靜置過(guò)夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀；
[0019]②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，離心去除雜質(zhì)，上清液置于-20~-70°C冷凍過(guò)夜，得到冷凍液；
[0020]③溶解:將步驟②中得到的冷凍液置于70_100°C水浴加熱解凍，離心，收集沉淀；
[0021]④將步驟③得到的沉淀用水稀釋溶解至可溶性固形物含量為1.0° Brix后，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比濃度達(dá)到20-30%，4°C靜置過(guò)夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀，沉淀用重量百分比濃度為20-30%的乙醇溶液洗滌3-5次，收集沉淀；沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得到猴頭菌大分子量多糖。
[0022]本發(fā)明還提供了制備上述猴頭菌大分子量多糖的方法，該方法為:
[0023]①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量達(dá)到50-70%，4°C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀；
[0024]②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~_70°C冷凍，得到冷凍液；
[0025]③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70-100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀，即為猴頭菌大分子量多糖。
`[0026]本發(fā)明制備的猴頭菌大分子量多糖分子量大，且色素少，多糖含量大大提高，超過(guò)80%。且本發(fā)明提供的制備方法簡(jiǎn)便、快速、高效、成本低、綠色環(huán)保，適用于規(guī)?；a(chǎn)的應(yīng)用。并且本發(fā)明制備的猴頭菇大分子量多糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞株釋放NO有明顯地促進(jìn)作用，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤能力。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明使用的猴頭菌由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌所(上海國(guó)森生物科技有限公司栽培，菌株編號(hào):H0605)提供；
[0028]本發(fā)明使用的無(wú)水乙醇購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
[0029]實(shí)施例1
[0030]1.水提醇沉:以猴頭菌成熟期新鮮子實(shí)體為原料，切成約2cm碎塊，稱取2kg原料沸水提取后，提取液用200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，4000rpm，30min離心收集上清，減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix (其中的可溶性固形物采用手持式數(shù)顯糖度計(jì)測(cè)定。)，冷卻至室溫后添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量為70%，4°C靜置過(guò)夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀。
[0031]2.冷凍:將上述沉淀加水溶解后，lOOOOg，離心15min去除雜質(zhì)，上清置于-20°C冷凍。3.溶解:將上述冷凍液置于80°C水浴加熱解凍，lOOOOg，離心20min收集沉淀；
[0032]4.乙醇沉淀及洗滌:將上述沉淀用水溶解稀釋至可溶性固形物含量為1.0° Brix后，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比濃度達(dá)到20%，4°C靜置過(guò)夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀，沉淀用20%乙醇洗滌3次，收集沉淀。[0033]5.冷凍干燥:上述沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即獲得猴頭菌大分子
量多糖。
[0034]多糖含量檢測(cè):采用苯酚-硫酸法。
[0035]分子量測(cè)定:采用HPLC法。
[0036]經(jīng)測(cè)定制備的猴頭菌多糖的多糖含量為79.6%，分子量325KDa。
[0037]實(shí)施例2
[0038]1.水提醇沉:以猴頭菌成熟期新鮮子實(shí)體為原料，切成約2cm碎塊，稱取Ikg原料沸水提取后，提取液用200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，4000rpm，30min離心收集上清，減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix，冷卻至室溫后添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比濃度為60%，4°C靜置過(guò)夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀。
[0039]2.冷凍:將上述沉淀加水溶解后，lOOOOg，離心15min去除雜質(zhì)，上清置于_20°C冷凍。
[0040]3.溶解:將上述冷凍液置于100°C水浴加熱解凍，1000Og,離心20min收集沉淀；
[0041]4.乙醇沉淀及洗滌:將上述沉淀用水溶解稀釋至可溶性固形物含量為1.0° Brix后，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比濃度為20%，4°C靜置過(guò)夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀，沉淀用20%乙醇洗滌5次。
[0042]5.冷凍干 燥:沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即獲得猴頭菌大分子量多糖。
[0043]多糖含量檢測(cè):采用苯酚-硫酸法。
[0044]分子量測(cè)定:采用HPLC法。
[0045]經(jīng)測(cè)定制備的猴頭菌多糖的多糖含量為81.1%，分子量312KDa。
[0046]實(shí)施例3
[0047]體外刺激巨噬細(xì)胞釋放NO活性測(cè)定
[0048]本實(shí)施例中RAW264.7骨髓巨噬細(xì)胞株，購(gòu)自美國(guó)國(guó)家菌種保藏中心(ATCC numberTIB-71?)；
[0049]本實(shí)施例中DMEM、RPMI1640購(gòu)于GIBCO公司。
[0050]供試樣品的配制
[0051]精確稱取實(shí)例1、2制備的猴頭菌多糖樣品于滅菌的印pendorf管中，用PBS緩沖液配置成濃度5mg/mL。充分溶解后以12000rpm/min離心30min,無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌印pendorf管中，將樣品稀釋成終濃度50、200、500 μ g/mL待用。陰性對(duì)照為PBS緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照為10 μ g/mL LPS溶液。
[0052]小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的制備
[0053]用DMEM培養(yǎng)基在37 °C、5%C02條件下傳代培養(yǎng)后，用0.25%胰蛋白酶消化，混懸液300 X g離心3min后收集細(xì)胞，用無(wú)色RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到一定濃度備用。
[0054]巨噬細(xì)胞釋放NO活性的測(cè)定
[0055]由于NO極不穩(wěn)定，在體內(nèi)很快生成亞硝酸基(N02—)和硝酸基(N03—)，故采用Griess法測(cè)定樣品中的N027N03—作為衡量NO水平的指標(biāo)。
[0056]( I)用亞硝酸鈉制標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0057]配成不同濃度的亞硝酸鈉溶液，濃度梯度為0、5、10、15、20、25、30、35、40μΜ共9個(gè)濃度梯度；取IOOyL于96孔板，加入50μ L Griess試劑，測(cè)定543nm吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0058](2) NO產(chǎn)量測(cè)定
[0059]巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液消化完畢后用無(wú)色RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%抗生素液體)將細(xì)胞稀釋至5 X 105/ml，每孔180 μ L加入96孔板，然后再加入20 μ L各濃度待測(cè)樣品和陰性(PBS)、陽(yáng)性(LPS，10 μ g/mL)對(duì)照，于37°C、含5%的C02條件下培養(yǎng)48h后，取100 μ L培養(yǎng)上清于96孔板，加入50 μ L Griess試劑，顯色I(xiàn)Omin后，于波長(zhǎng)543nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的NO量。
[0060]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0061]實(shí)施例1、2制備的猴頭菌多糖在濃度50 μ g/mL時(shí)，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的量(單位:μ moL/5.0X 105cells)分別為:56.61、58.32 ;在濃度 200 μ g/mL 時(shí)，產(chǎn)生 NO 量分別為74.65、75.72 ;在濃度500 μ g/mL時(shí)，產(chǎn)生NO量分別為80.89、81.22，陰性對(duì)照為8.84，陽(yáng)性對(duì)照為(終濃度I μ g/mL) 70.18，本發(fā)明制備的猴頭菌多糖顯著高于陰性對(duì)照組活性，多糖在200 μ g/mL時(shí)活性高于陽(yáng)性對(duì)照LPS，表現(xiàn)出良好的促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞株釋放NO活性，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤能力。`
【權(quán)利要求】
1.一種猴頭菌大分子量多糖，其特征在于其是通過(guò)如下方法制備得到的: ①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量達(dá)到50-70%，4°C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀； ②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~_70°C冷凍，得到冷凍液； ③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70-100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀，即為猴頭菌大分子量多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的猴頭菌大分子量多糖，其特征在于其是通過(guò)如下方法制備得到的: ①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量達(dá)到50-70%，4°C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀； ②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~_70°C冷凍，得到冷凍液； ③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70-100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀； ④將步驟③得到的沉淀用水稀釋后，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比濃度達(dá)到20-30%,離心收集沉淀，再用質(zhì)量百分比濃度為20-30%的乙醇溶液洗滌沉淀2-5次，收集沉淀；將沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得到猴頭菌大分子量多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的猴頭菌大分子量多糖，其特征在于其是通過(guò)如下方法制備得到的: ①水提醇沉:將新鮮猴頭菌的沸水提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix，冷卻至室溫后，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量為50-70%，4°C靜置過(guò)夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀；` ②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，離心去除雜質(zhì)，上清液置于-20~-70°C冷凍過(guò)夜，得到冷凍液； ③溶解:將步驟②中得到的冷凍液置于70-100°C水浴加熱解凍，離心，收集沉淀，即為猴頭菌大分子量多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的猴頭菌大分子量多糖，其特征在于其是通過(guò)如下方法制備得到的: ①水提醇沉:將新鮮猴頭菌的沸水提取液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至可溶性固形物含量為18° Brix，冷卻至室溫后，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量為50-70%，4°C靜置過(guò)夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀； ②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，離心去除雜質(zhì)，上清液置于-20~-70°C冷凍過(guò)夜，得到冷凍液； ③溶解:將步驟②中得到的冷凍液置于70-100°C水浴加熱解凍，離心，收集沉淀； ④將步驟③得到的沉淀用水稀釋溶解至可溶性固形物含量為1.0°Brix后，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比濃度達(dá)到20-30%，4°C靜置過(guò)夜，lOOOOg，離心15min收集沉淀，沉淀用重量百分比濃度為20-30%的乙醇溶液洗滌3-5次，收集沉淀；沉淀加水溶解后揮去殘留乙醇，冷凍干燥即得到猴頭菌大分子量多糖。
5.一種制備權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述猴頭菌大分子量多糖的方法,其特征在于該方法包括如下步驟: ①水提醇沉:將猴頭菌的沸水提取液，濃縮，添加無(wú)水乙醇至乙醇質(zhì)量百分比含量達(dá)到50-70%，4°C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀； ②冷凍:將上述沉淀加水溶解后，溶液置于-20~_70°C冷凍，得到冷凍液； ③溶解:將步驟②得到的冷凍液于70-100°C水浴加熱解凍，離心收集沉淀，即為猴頭菌大分子量 多糖。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK103819576SQ201410103882
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】吳迪, 楊焱, 唐川, 劉艷芳, 張勁松, 汪雯翰, 顏夢(mèng)秋, 唐慶九, 唐傳紅, 馮娜, 周帥, 賈薇, 張忠, 馮杰 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院