全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，屬于中藥提取技術(shù)，旨在提供一種方法簡單，多糖含量高的提取純化方法；該方法包括稱取各組分，除熟地外的其余藥材干燥粉碎；將熟地切段，用超聲提取法提取，離心分離取上清液；將上清液濃縮，調(diào)至藥液乙醇含量為75-85％，靜置離心分離，取下層沉淀干燥得粗多糖A；取粗多糖A加水溶解，搖勻，酸調(diào)節(jié)pH至5-6，加入木瓜蛋白酶,酶解，滅活離心除去沉淀，取下層液得粗多糖酶解液A；向粗多糖酶解液A中加入氯仿-正丁醇溶液，震蕩，靜置過夜，收集上層水相溶液，得到多糖溶液A；加水配制成溶液，調(diào)節(jié)多糖溶液的pH至4.5-5.5，加入大孔樹脂吸附，過濾得粗多糖，將溶液超濾；即可得到精制多糖。
【專利說明】全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多糖的提取純化方法，尤其涉及一種綠全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法；屬于中藥提取【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]全真一氣湯為明清醫(yī)學大家馮兆張《馮氏錦囊秘錄》中的著名方劑。由熟地黃、白術(shù)、人參、麥冬、五味子、附子、牛膝組成。臨床廣泛用于治療各種老年虛損性疾病，如胃腸疾病，慢性阻塞性肺病、肺癌、等辯證屬氣血陰陽俱虛免疫功能低下者，療效顯著?，F(xiàn)代研究表明，多糖具有調(diào)節(jié)免疫，降血脂，抗腫瘤，抗炎，抗衰老等生理功能。
[0003]目前有關(guān)全真一氣湯多糖的提取研究報道很少，本課題組近年對全真一氣湯多糖進行了一定程度的探討，發(fā)現(xiàn)其主要的藥理作用為增強免疫力，對正常小鼠及環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能有不同程度的增強作用，可提高環(huán)磷酰胺抑制的體液免疫功能，具有腸道粘膜免疫調(diào)節(jié)作用，其主要機理為升高免疫抑制小鼠血清IL-6和TNF- α水平，刺激免疫抑制小鼠機體的細胞因子分泌，從而達到調(diào)節(jié)免疫功能的作用。
[0004]陳虹在碩士論文中雖然提供了《全真一氣湯總多糖的提取與質(zhì)量控制初步研究》，但是所得的多糖含量不高，提取率也比較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述不足，發(fā)明目的在于提供一種提取純化方法簡單，多糖含量高的全真一氣湯多糖的提取純化方法。
[0006]為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的:該全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，依次包括下述步驟:
[0007]I)按全真一氣湯配方比例稱取熟地黃、白術(shù)、人參、麥冬、五味子、附子、牛膝，除熟地外，其余藥材干燥，粉碎；
[0008]2)將熟地切段，與步驟I)粉碎后的藥材混合，用超聲提取法提取藥材1-3次，每次7-9倍水提取25-35min后粗濾,靜置過夜后離心分離,取上清液；
[0009]3)將步驟2)中的上清液濃縮至相對密度為1.15-1.2，用乙醇調(diào)至藥液乙醇含量為75-85%，靜置離心分離，取下層沉淀用乙醇洗滌后于55-65°C真空干燥得粗多糖A ;
[0010]4)取步驟3)粗多糖A加水溶解,搖勻，酸調(diào)節(jié)pH至5-6,加入木瓜蛋白酶，在45-55°C,酶解4-6h，滅活，離心除去沉淀，取下層液得粗多糖酶解液B ;
[0011]5)向步驟4)粗多糖酶解液B中加入其體積1/4-1/6的氯仿-正丁醇溶液，震蕩，靜置過夜，收集上層水相溶液，得到多糖溶液B ；
[0012]6)取步驟5)多糖溶液A，加水配制成濃度為3_5mg/ml的溶液，調(diào)節(jié)多糖溶液的pH至4.5-5.5，加入大孔樹脂在45-55°C水浴下攪拌l_3h，過濾的粗多糖B ；
[0013]7)取步驟6)粗多糖B加水制成濃度為0.15-0.25mg/mL的溶液，進行超濾，收集截留液，濃縮后在55-65°C真空干燥，得到精多糖。[0014]進一步的，上述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，步驟I)所述的干燥溫度均為60°C。
[0015]進一步的，上述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，步驟2)所述的超聲條件為在室溫下超2s停2s，功率800w。
[0016]上述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，步驟2)、步驟3)和步驟4)所述的離心條件均為5000rpmX lOmin。
[0017]進一步的，上述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，步驟3)所述的上清液濃縮是在60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至藥液相對密度為1.15-1.2。
[0018]進一步的，上述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，步驟4)所述的酸為冰醋酸。
[0019]進一步的，上述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，取步驟2)粗多糖A:水:木瓜蛋白酶的質(zhì)量比是1:50:1.5。
[0020]進一步的，上述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，步驟4)所述的滅活是在沸水浴滅活5min。
[0021]進一步的，上述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，步驟7)所述的超濾進料流速為10-14mL/min，壓力為0.08_012MPa，使得透過量與截留量的體積比為1:1，當溶液全部進入超濾柱時，記為超濾一次，將截留液中加200mL蒸餾水，繼續(xù)超濾，循環(huán)25次后，收集截留液。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案:操作簡單，多糖含量高，純度高，并且易于工業(yè)化生產(chǎn)，通過脫蛋白，超濾處理后，多糖含量均上升較高。雖然脫蛋白處理本身并沒有提高粗多糖中的多糖含量，但是這個步驟對于整個多糖的精制過程是必不可少的。
[0023]全真一氣湯具有較顯著的臨床療效，對其進行深入的作用機理研究，闡明其科學內(nèi)涵，具有重要的臨床意義。特別是對于其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，有必要進行深入研究。全真一氣湯中多種藥材含有多糖類成分，而現(xiàn)代研究亦證明，多糖類成分具有多種生理活性，如提高免疫力、抗病毒等。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改仍在本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍之內(nèi)。
[0025]實施例1
[0026]本發(fā)明提供的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，依次包括下述步驟:
[0027]I)提取
[0028]按全真一氣湯配方比例稱取藥材飲片，共6劑，除熟地外，其余藥材60°C干燥，粉碎為粗顆粒。熟地切成小段。采用超聲提取法提取藥材2次，每次8倍水提取30min (超聲條件:超2s停2s，功率800w，室溫)。合并提取液，用尼龍網(wǎng)(200目)粗濾，靜置過夜后離心處理(5000rpmX10min)，得上清液，60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至藥液的相對密度為1.15-1.2，用乙醇調(diào)至藥液乙醇含量為80%，靜置24h，5000rpm離心10min，沉淀用80%的乙醇洗滌一次后于60°C真空干燥得粗多糖A。
[0029]2)脫蛋白[0030]3)取步驟I)粗多糖A2.0g于三角瓶中，加水10mL溶解，搖勻，冰醋酸調(diào)節(jié)pH至
5.5,加入木瓜蛋白酶3g, 50°C,酶解5h,沸水浴滅活5min, 5000rpmX 1min離心除去沉淀。得粗多糖酶解液。采用Sevag法，在上述酶解液中加入其體積1/5的氯仿-正丁醇溶液，震蕩30min，靜置過夜，收集上層水相溶液，重復三次，得到脫蛋白粗多糖B。
[0031]3)除色素
[0032]4)取步驟2)脫蛋白粗多糖B，加水配制成濃度約為4mg/ml的溶液，用冰醋酸調(diào)節(jié)多糖溶液的PH至5.0，加入2g大孔樹脂AB-8(重量百分比為5% )，在50°C水浴下攪拌2h，過濾，脫蛋白除色素粗多糖B。
[0033]4)超濾
[0034]取步驟3)脫蛋白除色素粗多糖B80mg，加水制成濃度約為0.2mg/mL的溶液，進行超濾，進料流速為12mL/min，調(diào)節(jié)壓力為0.1MPa，使得透過量與截留量的體積比為1:1，當溶液全部進入超濾柱時，記為超濾一次，將截留液中加200mL蒸餾水，繼續(xù)超濾，循環(huán)25次后，收集截留液，60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量，于60°C真空干燥后，測多糖含量。
[0035]為了更高的說明本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點所在，下面給出本發(fā)明的研究方法:
[0036]I儀器與試劑
[0037]超聲循環(huán)提 取機(TGCX2-2B，弘祥隆)，紫外-可見分光光度計(TU-U901，北京普析通用儀器有限責任公司)，恒溫水浴鍋(HWS-24，上海一恒科學儀器有限公司)，電子天平(XS10OTU，梅特勒-托利多)，真空干燥箱(DZF-6050，上海一恒科學儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-3，BUCHI)。
[0038]熟地黃、白術(shù)、黨參、麥冬、五味子、附子、牛膝(廣東省藥材公司中藥飲片廠)，大孔樹脂(AB-8，天津瑞歐生物科技有限公司)，葡萄糖(sigama)，苯酚，濃硫酸，過氧化氫，活性炭等均為國產(chǎn)分析純。牛血清白蛋白(純度> 96%, sigama),考馬斯亮藍,氯仿,正丁醇等均為國產(chǎn)分析純。
[0039]2.方法與結(jié)果
[0040]2.1多糖含量測定
[0041]采用苯酚-硫酸法。
[0042]2.1.1對照品貯備液的配制
[0043]精密稱取葡萄糖對照品20.92mg至10mL量瓶中，加水溶解，搖勻，并定容至刻度，即得濃度為0.2092mg/mL的葡萄糖貯備液。
[0044]2.1.2標準曲線的繪制
[0045]分別精密量取對照品貯備液0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mL于1mL具塞試管中，補加水至2.0mL,搖勻。加入5%苯酹溶液ImL,搖勻,迅速加入濃硫酸5mL,置沸水浴中保溫15min，取出置冰浴中冷卻至室溫。另取蒸餾水2.0mL置具塞試管中，加入相應(yīng)的試劑用上述方法處理，制備空白溶液，在490nm處測定吸光度，用吸光度對葡萄糖質(zhì)量進行線性回歸，得回歸方程:Y = 7.404Χ+0.022 (r = 0.9997)
[0046]2.1.3樣品的含量測定
[0047]取供試品約10mg，精密稱定于50mL量瓶中，加水溶解，搖勻，并定容至刻度。精密量取0.4mL于1mL具塞試管中，補加水至2.0mL，按2.2.2項下方法處理，并測定。[0048]2.2蛋白含量的測定
[0049]采用考馬斯亮藍法。
[0050]2.2.1考馬斯亮藍G-250溶液的配制
[0051]稱取考馬斯亮藍G-25025mg于250mL量瓶中，加12.5mL95%乙醇溶解，搖勻，加入25mL85% H3PO4,搖勻后，加入稀釋至刻度，5000rpmX 1min離心取上清液備用。
[0052]2.2.2對照品貯備液的配制
[0053]精密稱取牛血清白蛋白10.51mg至50mL量瓶中，加水溶解，搖勻，并定容至刻度，即得濃度為0.2102mg/mL的牛血清白蛋白貯備液。
[0054]2.2.3標準曲線的繪制
[0055]分別精密量取對照品貯備液0.0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mL于25mL具塞試管中，補加水至2.0mL,搖勻。加入考馬斯亮藍G-250溶液10mL，搖勻，室溫放置30min，以蒸餾水為空白，在595nm波長處測定吸光度，用吸光度對牛血清白蛋白的質(zhì)量進行線性回歸，得回歸方程:Y = 2.298Χ+1.403 (r = 0.993)
[0056]2.2.4供試品的制備及含量的測定
[0057]取粗多糖約10mg，精密稱定于50mL量瓶中，加水溶解，搖勻，并定容至刻度。精密量取2mL于1mL具塞試管中，按2.2.3項下方法處理，測定并計算蛋白含量。
[0058]2.3 提取
[0059]按全真一氣湯配方比例稱取藥材飲片，共6劑，除熟地外，其余藥材60°C干燥，粉碎為粗顆粒。熟地切成小段。采用超聲提取法提取藥材2次，每次8倍水提取30min (超聲條件:超2s停2s，功率800w，室溫)。合并提取液，用尼龍網(wǎng)(200目)粗濾，靜置過夜后離心處理(5000rpmX10min)，得上清液，60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至藥液的相對密度為1.15-1.2，用乙醇調(diào)至藥液乙醇含量為80%，靜置24h，5000rpm離心10min，沉淀用80%的乙醇洗滌一次后于60°C真空干燥得粗多糖A。分別按2.1，2.2項下方法測多糖、蛋白含量。結(jié)果見表1
[0060]2.4脫蛋白
[0061 ] 取粗多糖A2.0g于三角瓶中，加水10mL溶解，搖勻，冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.5，加入木瓜蛋白酶3g,5(TC,酶解5h,沸水浴滅活5min, 5000rpmX 1min離心除去沉淀。得粗多糖酶解液。采用Sevag法，在上述酶解液中加入其體積1/5的氯仿-正丁醇溶液，震蕩30min，靜置過夜，收集上層水相溶液，重復三次，分別照2.1，2.2項下方法測多糖及蛋白含量。結(jié)果見表1。
[0062]由表1可知，對全真一氣湯粗多糖進行脫蛋白處理后，蛋白含量由9.83±0.23%下降到4.61 ±0.09%，但同時多糖的含量由44.18±1.02%下降到37.00±0.74%，結(jié)果表明，脫蛋白過程，多糖會有損失。
[0063]表1脫蛋白對粗多糖的多糖含量及蛋白含量的影響(η = 3)
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一種全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，其特征在于，依次包括下述步驟: 1)按全真一氣湯配方比例稱取熟地黃、白術(shù)、人參、麥冬、五味子、附子、牛膝，除熟地外，其余藥材干燥，粉碎； 2)將熟地切段，與步驟I)粉碎后的藥材混合，用超聲提取法提取藥材1-3次，每次7-9倍水提取25-35min后粗濾,靜置過夜后離心分離,取上清液； 3)將步驟2)中的上清液濃縮至相對密度為1.15-1.2，用乙醇調(diào)至藥液乙醇含量為75-85%，靜置離心分離，取下層沉淀用乙醇洗滌后于55-65°C真空干燥得粗多糖A ; 4)取步驟3)粗多糖A加水溶解，搖勻，酸調(diào)節(jié)pH至5-6，加入木瓜蛋白酶，在45-55°C，酶解4-6h，滅活，離心除去沉淀，取下層液得粗多糖酶解液B ； 5)向步驟4)粗多糖酶解液B中加入其體積1/4-1/6的氯仿-正丁醇溶液，震蕩，靜置過夜，收集上層水相溶液，得到多糖溶液B ； 6)取步驟5)多糖溶液A，加水配制成濃度為3-5mg/ml的溶液，調(diào)節(jié)多糖溶液的pH至4.5-5.5，加入大孔樹脂在45-55°C水浴下攪拌l_3h，過濾的粗多糖B ； 7)取步驟6)粗多糖B加水制成濃度為0.15-0.25mg/mL的溶液，進行超濾，收集截留液，濃縮后在55-65°C真空干燥，得到精多糖。
2.據(jù)權(quán)利要求 1所述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，其特征在于，步驟I)所述的干燥溫度均為60°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，其特征在于，步驟2)所述的超聲條件為在室溫下超2s停2s，功率800w。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，其特征在于，步驟2)、步驟3)和步驟4)所述的離心條件均為5000rpmX 1min0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，其特征在于，步驟3)所述的上清液濃縮是在60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至藥液相對密度為1.15-1.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，其特征在于，步驟4)所述的酸為冰醋酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，其特征在于，取步驟2)粗多糖A:水:木瓜蛋白酶的質(zhì)量比是1:50:1.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，其特征在于，步驟4)所述的滅活是在沸水浴滅活5min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的全真一氣湯多糖的工業(yè)化提取純化的方法，其特征在于，步驟7)所述的超濾進料流速為10-14mL/min，壓力為0.08_012MPa，使得透過量與截留量的體積比為1:1，當溶液全部進入超濾柱時，記為超濾一次，將截留液中加200mL蒸餾水，繼續(xù)超濾，循環(huán)25次后，收集截留液。
【文檔編號】C08B37/00GK104031155SQ201410188735
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】張大鵬, 張志敏, 武志娟, 趙雅, 任培華, 梁金羽, 朱敬杰, 韓福國, 劉清飛 申請人:廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院