一種長(zhǎng)循環(huán)和靶向協(xié)同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種長(zhǎng)循環(huán)和靶向協(xié)同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體，由粒徑為30-200nm且均勻分布的復(fù)合膠束組成，所述復(fù)合膠束由兩種雙親性嵌段共聚物組成，包括一種親水端帶有靶向基團(tuán)修飾的pH響應(yīng)性的雙親性嵌段共聚物和一種為親水端為PEG的雙親性嵌段共聚物，該復(fù)合膠束在pH7.4下為核-殼結(jié)構(gòu)，核層由雙親性嵌段共聚物的疏水端組成，殼層為PEG和靶向基團(tuán)修飾的pH響應(yīng)性的親水端混合組成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：該藥物載體表面結(jié)構(gòu)可通過(guò)改變不同嵌段共聚物比例靈活調(diào)控，靶向基團(tuán)針對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性靶向作用，藥物載體具有響應(yīng)性釋放能力，生物相容性較好，并具有生物可降解性；制備工藝簡(jiǎn)單、易于操作。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種長(zhǎng)循環(huán)和祀向協(xié)同的多功能抗腫瘤祀向納米藥物載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥和納米醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種長(zhǎng)循環(huán)和靶向協(xié)同的多功 能抗腫瘤祀向納米藥物載體。

【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是一種影響人類(lèi)健康的惡性疾病，近三十年來(lái)，世界癌癥發(fā)病率以每年3-5% 的速度增加，嚴(yán)重危害著人們的身心健康。目前腫瘤的治療策略是以化療、手術(shù)切除、放療 和生物治療等手段的綜合治療。其中藥物化療是治療腫瘤的主要手段之一，所用的抗腫瘤 化療藥物仍以小分子細(xì)胞毒性藥物為主，給藥后這些藥物在體內(nèi)分布廣泛。同時(shí)，絕大多數(shù) 抗腫瘤藥物是疏水的，靜脈給藥后能夠到達(dá)的腫瘤組織的很少，很多在肝、脾等健康器官和 組織中分布，導(dǎo)致在治療腫瘤的同時(shí)對(duì)機(jī)體正常組織也產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。如何提高化 療藥物對(duì)腫瘤組織的選擇性，減少其在正常組織的分布，降低其毒副作用，提高藥物生物利 用度是提高抗腫瘤化療藥物療效的關(guān)鍵。
[0003] 納米藥物載體在輸送藥物過(guò)程中面臨諸多的障礙，靶向腫瘤的藥物輸送是一個(gè)體 內(nèi)5步串聯(lián)的過(guò)程：1)在血液循環(huán)系統(tǒng)中保留較長(zhǎng)時(shí)間（血液屏障），以實(shí)現(xiàn)2)腫瘤組織 中的高效富集（EPR效應(yīng)），3)在腫瘤組織滲透到各個(gè)部分以到達(dá)所有腫瘤細(xì)胞，4)能夠快 速進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并5)在胞內(nèi)將藥物快速釋放。然而，對(duì)于多功能的納米藥物載體，每一新 的功能勢(shì)必增加了體系的復(fù)雜性并帶來(lái)新的問(wèn)題，并且不同特定功能之間往往會(huì)產(chǎn)生一定 的矛盾。例如，一些藥物載體表面修飾親水性較好的聚合物以避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的快速清 除，獲得較好的長(zhǎng)循環(huán)性能并提高腫瘤部位的富集量。但是，研究表明，這些載體不易被腫 瘤細(xì)胞內(nèi)吞，降低腫瘤治療效果。與此同時(shí)，一些具有良好應(yīng)用前景的靶向藥物載體具有良 好的腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞能力，然而長(zhǎng)循環(huán)及腫瘤部位的高效富集難以實(shí)現(xiàn)，此外，對(duì)于一些表面 修飾了靶向基團(tuán)如c(RGDfK)的納米粒子，c(RGDfK)直接暴露在納米粒子表面，易于血液中 的調(diào)理素相互作用，使得納米粒子在調(diào)理素作用下，促使其被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)快速清除，并可 能會(huì)引起免疫反應(yīng)，大大降低了抗腫瘤療效。
[0004] 目前解決長(zhǎng)循環(huán)和細(xì)胞內(nèi)吞的研究主要集中表面聚乙二醇（PEG)可脫離的納米 載體。這種納米藥物載體在血液循環(huán)過(guò)程中，在PEG的屏蔽作用下，載體材料可以在一定程 度上避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的快速清除，提高了血液循環(huán)時(shí)間。同時(shí)，在EPR效應(yīng)發(fā)揮作用 后，載體材料進(jìn)入腫瘤組織，在腫瘤組織微環(huán)境如弱酸性、過(guò)度表達(dá)的酶類(lèi)等響應(yīng)性刺激 下，PEG響應(yīng)性脫除，從而發(fā)生電荷轉(zhuǎn)變或暴露出的靶向于腫瘤細(xì)胞的靶向基團(tuán)，提高細(xì)胞 內(nèi)吞能力。盡管如此，目前大部分的PEG脫殼研究仍然處于細(xì)胞水平，體內(nèi)的驗(yàn)證還沒(méi)有實(shí) 現(xiàn)。同時(shí)，脫殼過(guò)程及脫殼機(jī)理較為復(fù)雜，適用范圍較窄。因此，為解決長(zhǎng)循環(huán)和細(xì)胞內(nèi)吞 的矛盾，需要發(fā)展新型具有協(xié)同作用的納米藥物載體系統(tǒng)，提高抗腫瘤治療效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在不足，提供一種長(zhǎng)循環(huán)和靶向協(xié)同的多功能 抗腫瘤靶向納米藥物載體，該藥物載體保留了表面PEG修飾及表面結(jié)構(gòu)所帶來(lái)的長(zhǎng)循環(huán)性 能，同時(shí)可有效提1?腫瘤細(xì)胞攝取能力，有效提1?抗腫瘤治療效果。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0007] -種長(zhǎng)循環(huán)和祀向協(xié)同的多功能抗腫瘤祀向納米藥物載體，由粒徑為30_200nm 且均勻分布的復(fù)合膠束組成，所述復(fù)合膠束由兩種雙親性嵌段共聚物通過(guò)在水溶液中自 組裝形成，其中一種雙親性嵌段共聚物為聚乙二醇-b_聚環(huán)己內(nèi)酯（PEG-b-PCL)，其親水 端為聚乙二醇（PEG)、疏水端為聚環(huán)己內(nèi)酯（PCL)，另一種雙親性嵌段共聚物為聚環(huán)己內(nèi) 酯-b-聚 β 氨酯-c (RGDfK) [ (PCL-b-PAE-c (RGDfK)]，式中 c (RGDfK)為短鏈環(huán)肽[其氨基 酸序列為cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)]，其親水端為帶有祀向基團(tuán)修飾且具有pH響應(yīng) 的端基為c(RGDfK)的聚β氨酯[PAE-c(RGDfK)]、疏水端亦為聚環(huán)己內(nèi)酯（PCL)，上述兩 種雙親性嵌段共聚物的疏水端的分子量為2-10kDa(千道爾頓）且相差< 5kDa ;所述復(fù)合 膠束在PH7. 4水溶液中為核-殼結(jié)構(gòu)，其中核為疏水端聚環(huán)己內(nèi)酯（PCL)，殼層為聚乙二醇 (PEG)和PAE-c(RGDfK)的復(fù)合殼層。
[0008] -種所述長(zhǎng)循環(huán)和靶向協(xié)同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體的制備方法，包括 如下步驟：
[0009] 1)聚乙二醇-b-聚環(huán)己內(nèi)酯（PEG2k-b-PCL)的合成
[0010] 以端羥基聚乙二醇（CH3〇-PEG45-〇H)為引發(fā)劑，以辛酸亞錫[Sn(0ct) 2]為催化劑， 以ε -己內(nèi)酯（ε -CL)為單體，開(kāi)環(huán)聚合制備，具體方法是：將干燥處理過(guò)的端羥基聚乙二 醇和減蒸處理過(guò)的ε -CL溶于重蒸過(guò)的無(wú)水甲苯中，加入Sn (Oct)2，依次進(jìn)行液氮冷凍、抽 真空、通氮?dú)?、解凍，重?fù)三次，ll〇°C油浴中反應(yīng)12h，反應(yīng)后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷 溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽濾洗滌后，將固體產(chǎn)物置于真空烘箱中干燥，即可得到 白色固體聚乙二醇-b_聚環(huán)己內(nèi)酯（PEG 2k-b-PCL);
[0011] 2)聚環(huán)己內(nèi)酯-b-聚 β 氨酯-C (RGDfK) [PCL-b-PAE-c (RGDfK)]的合成
[0012] 利用開(kāi)環(huán)聚合和邁克爾加成反應(yīng)通過(guò)連續(xù)反應(yīng)制備，具體方法是：將叔丁氧羰 基氨基乙醇（B0C-NH-C 2H40H)和減蒸過(guò)的ε -己內(nèi)酯（ε -CL)混合，加入重蒸過(guò)的甲苯溶 解，加入辛酸亞錫[Sn (Oct) 2]，依次進(jìn)行液氮冷凍、抽真空、通氮?dú)?、解凍，重?fù)三次，然后在 110°C油浴中反應(yīng)12h，反應(yīng)后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉 淀，抽濾洗滌后，將固體產(chǎn)物置于真空烘箱中干燥，得到PCL的均聚物PCL-0H ;
[0013] 將上述PCL-0H、三乙胺（TEA)和重蒸后的二氯甲烷混合均勻得到混合液a，然后 將丙烯酰氯溶解于重蒸后的二氯甲烷中，混合均勻得到混合液b，將混合液b在氬氣氛圍 下逐滴緩慢滴入到混合液a中，滴加完畢后封閉反應(yīng)體系，緩慢升至室溫，在氬氣氛圍下反 應(yīng)12h后，萃取反應(yīng)液，用飽和碳酸鈉溶液、0. lmol/L的鹽酸溶液和純水分別洗滌至少三 次，取有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鎂干燥8-10h，抽濾，旋蒸濃縮后在冰乙醚中沉淀，靜置8-10h后 抽濾，用無(wú)水乙醚洗滌后，將固體置于真空烘箱中干燥，即可制得端基碳碳雙鍵功能化的 PCL-A ；
[0014] 將上述PCL-A、己烷-1，6-二醇-二丙烯酸酯（HDD)和4, f -三亞甲基-二哌啶 (TDP)混合后，加入氯仿溶解，55°C油浴中反應(yīng)，72h后，在反應(yīng)液中加入N-丙烯酰氧琥珀酰 亞胺（NAS)，繼續(xù)反應(yīng)12h，封端并終止反應(yīng)，即可得到黃色固體PCL-b-PAE-NAS ;
[0015] 將上述PCL-b-PAE-NAS和短鏈環(huán)肽[c (RGDfK)]混合后，加入DMF和氯仿的混合 溶劑，然后加入三乙胺（TEA)，30°C下攪拌反應(yīng)8-10h，反應(yīng)液旋蒸除去氯仿，在超純水中透 析，透析袋截留分子量為12_14k Da，每天換水四次，透析三天后，冷凍干燥，即可制得聚環(huán) 己內(nèi)酯-b_ 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [PCL-b-PAE-c (RGDfK)];
[0016] 3)室溫下分別將步驟1)和2)中所得到的兩種嵌段共聚物PCL-b-PAE-c (RGDfK) 和PEG-b-PCL分別溶解在有機(jī)溶劑氯仿中，得到兩種聚合物溶液，這兩種溶液的濃度均為 2mg/mL ;另外將阿霉素鹽酸鹽加入到氯仿中，再加入三乙胺中和阿霉素鹽酸鹽中的鹽酸，制 得濃度為2mg/mL的阿霉素溶液；
[0017] 4)將步驟3)中制備得到的兩種聚合物溶液和阿霉素溶液按照體積比為1 :1 :1均 勻混合，得到混合溶液；
[0018] 5)將上述混合溶液在超聲攪拌下逐滴加入到pH為4. 0、濃度為l(T4m〇l/L的鹽酸 中，滴加完全后，在35°C下劇烈攪拌揮發(fā)至有機(jī)溶劑基本揮發(fā)完全，然后在室溫下旋蒸至完 全除去未揮發(fā)干凈的有機(jī)溶劑，加入濃度為0. lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 4,在超 純水中透析，所用透析袋截留分子量為12-14kDa，透析兩天后，經(jīng)超濾離心濃縮，即可制得 所需濃度的負(fù)載阿霉素的納米藥物載體（載藥膠束RMSM-D0X)。
[0019] 所述步驟1)中端羥基聚乙二醇、ε -己內(nèi)酯、甲苯、辛酸亞錫、二氯甲烷和冰乙醚 的用量比為 2. 0g :5. 0g :20mL :50 μ L :20mL :200mL。
[0020] 所述步驟2)中B0C-NH-C2H40H、ε -己內(nèi)酯、甲苯、辛酸亞錫、二氯甲烷和冰乙醚的 用量比為0. lg :3. 5g :10mL :50μ L :5mL :50mL ;所述混合液a中PCL-0H、三乙胺與二氯甲烷 的用量比為2. 5g :0. 25g :5mL ;混合液b中丙烯酰氯與二氯甲烷的用量比為0. 18g :10mL ; 混合液a與混合液b的質(zhì)量比7:10 ;所述PCL-A、己烷-1，6-二醇-二丙烯酸酯（HDD)、 4，f -三亞甲基-二哌啶（TDP)、氯仿和4，f -三亞甲基-二哌啶（TDP)的用量比為 0. 5g :0. 68g :0. 69g :10mL :0. 305g ;所述DMF與氯仿混合溶劑中DMF-氯仿的體積比3:2 ; PCL-b-PAE-NAS、c (RGDfK)、DMF-氯仿混和溶劑和 TEA 的用量比為 80mg :16mg :5mL :200 μ L。
[0021] 本發(fā)明的合成路線如下所示：
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種長(zhǎng)循環(huán)和靶向協(xié)同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體，其特征在于：由粒徑為 30-200 nm且均勻分布的復(fù)合膠束組成，所述復(fù)合膠束由兩種雙親性嵌段共聚物通過(guò)在水 溶液中自組裝形成，其中一種雙親性嵌段共聚物為聚乙二醇聚環(huán)己內(nèi)酯（PEG4-PCL)， 其親水端為聚乙二醇（PEG)、疏水端為聚環(huán)己內(nèi)酯（PCL)，另一種雙親性嵌段共聚物為聚環(huán) 己內(nèi)酯 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [(PCL-6-PAE-c (RGDfK)]，式中 c (RGDfK)為短鏈環(huán)肽[其 氨基酸序列為cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)]，其親水端為帶有祀向基團(tuán)修飾且具有pH 響應(yīng)的端基為c(RGDfK)的聚β氨酯[PAE-c(RGDfK)]、疏水端亦為聚環(huán)己內(nèi)酯（PCL)，上述 兩種雙親性嵌段共聚物的疏水端的分子量為2-10 kDa (千道爾頓)且相差< 5 kDa ;所述復(fù) 合膠束在pH 7. 4水溶液中為核-殼結(jié)構(gòu)，其中核為疏水端聚環(huán)己內(nèi)酯（PCL)，殼層為聚乙二 醇（PEG)和PAE-c (RGDfK)的復(fù)合殼層。
2. -種如權(quán)利要求1所述長(zhǎng)循環(huán)和靶向協(xié)同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體的制 備方法，其特征在于包括如下步驟： 1) 聚乙二醇聚環(huán)己內(nèi)酯（PEG2k4-PCL)的合成 以端羥基聚乙二醇（CH3〇-PEG45-〇H)為引發(fā)劑，以辛酸亞錫[Sn(0ct) 2]為催化劑，以 f -己內(nèi)酯U -CL)為單體，開(kāi)環(huán)聚合制備，具體方法是：將干燥處理過(guò)的端羥基聚乙二醇 和減蒸處理過(guò)的f -CL溶于重蒸過(guò)的無(wú)水甲苯中，加入Sn (Oct) 2，依次進(jìn)行液氮冷凍、抽真 空、通氮?dú)?、解凍，重?fù)三次，110 ° C油浴中反應(yīng)12 h，反應(yīng)后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲 烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽濾洗滌后，將固體產(chǎn)物置于真空烘箱中干燥，即可得 到白色固體聚乙二醇聚環(huán)己內(nèi)酯（PEG 2k4-PCL); 2) 聚環(huán)己內(nèi)酯 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [ PCL-6-PAE-c (RGDfK)]的合成 利用開(kāi)環(huán)聚合和邁克爾加成反應(yīng)通過(guò)連續(xù)反應(yīng)制備，具體方法是：將叔丁氧羰基氨基 乙醇（B0C-NH-C2H40H)和減蒸過(guò)的f -己內(nèi)酯U -CL)混合，加入重蒸過(guò)的甲苯溶解，加入 辛酸亞錫[Sn(0ct)2]，依次進(jìn)行液氮冷凍、抽真空、通氮?dú)狻⒔鈨?，重?fù)三次，然后在110 ° C 油浴中反應(yīng)12 h，反應(yīng)后旋蒸除去甲苯，加入二氯甲烷溶解粘稠物后，在冰乙醚中沉淀，抽 濾洗滌后，將固體產(chǎn)物置于真空烘箱中干燥，得到PCL的均聚物PCL-0H ; 將上述PCL-0H、三乙胺（TEA)和重蒸后的二氯甲烷混合均勻得到混合液a，然后將丙 烯酰氯溶解于重蒸后的二氯甲烷中，混合均勻得到混合液b，將混合液b在氬氣氛圍下逐滴 緩慢滴入到混合液a中，滴加完畢后封閉反應(yīng)體系，緩慢升至室溫，在氬氣氛圍下反應(yīng)12 h 后，萃取反應(yīng)液，用飽和碳酸鈉溶液、〇. 1 mol/L的鹽酸溶液和純水分別洗漆至少三次，取有 機(jī)相，用無(wú)水硫酸鎂干燥8-10 h，抽濾，旋蒸濃縮后在冰乙醚中沉淀，靜置8-10 h后抽濾，用 無(wú)水乙醚洗滌后，將固體置于真空烘箱中干燥，即可制得端基碳碳雙鍵功能化的PCL-A ; 將上述PCL-A、己烷-1,6-二醇-二丙烯酸酯（HDD)和4，f -三亞甲基-二哌啶（TDP) 混合后，加入氯仿溶解，55 ° C油浴中反應(yīng)，72 h后，在反應(yīng)液中加入N-丙烯酰氧琥珀酰亞 胺（NAS)，繼續(xù)反應(yīng)12 h，封端并終止反應(yīng)，即可得到黃色固體PCL4-PAE-NAS ; 將上述PCL4-PAE-NAS和短鏈環(huán)肽[c (RGDfK)]混合后，加入DMF和氯仿的混合溶劑， 然后加入三乙胺（TEA)，30 ° C下攪拌反應(yīng)8-10h，反應(yīng)液旋蒸除去氯仿，在超純水中透析， 透析袋截留分子量為12_14k Da，每天換水四次，透析三天后，冷凍干燥，即可制得聚環(huán)己內(nèi) 酯 聚 β 氨酯-c (RGDfK) [ PCL-6-PAE-c (RGDfK)]; 3) 室溫下分別將步驟1)和2)中所得到的兩種嵌段共聚物PCLi-PAE-c (RGDfK)和 PEG4-PCL分別溶解在有機(jī)溶劑氯仿中，得到兩種聚合物溶液，這兩種溶液的濃度均為2 mg/mL ;另外將阿霉素鹽酸鹽加入到氯仿中，再加入三乙胺中和阿霉素鹽酸鹽中的鹽酸，制 得濃度為2 mg/mL的阿霉素溶液； 4) 將步驟3)中制備得到的兩種聚合物溶液和阿霉素溶液按照體積比為1 :1 :1均勻混 合，得到混合溶液； 5) 將上述混合溶液在超聲攪拌下逐滴加入到pH為4. 0、濃度為ΚΓ4 mol/L的鹽酸中， 滴加完全后，在35 ° C下劇烈攪拌揮發(fā)至有機(jī)溶劑基本揮發(fā)完全，然后在室溫下旋蒸至完 全除去未揮發(fā)干凈的有機(jī)溶劑，加入濃度為0. 1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 4,在超 純水中透析，所用透析袋截留分子量為12-14 kDa，透析兩天后，經(jīng)超濾離心濃縮，即可制得 所需濃度的負(fù)載阿霉素的納米藥物載體(載藥膠束RMSM-D0X)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述長(zhǎng)循環(huán)和靶向協(xié)同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體的制備 方法，其特征在于：所述步驟1)中端羥基聚乙二醇、f -己內(nèi)酯、甲苯、辛酸亞錫、二氯甲烷 和冰乙醚的用量比為 2.0 g:5.0 g :20 mL:50 yL:20 mL:200 mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述長(zhǎng)循環(huán)和靶向協(xié)同的多功能抗腫瘤靶向納米藥物載體的制備 方法，其特征在于：所述步驟2)中B0C-NH-C 2H40H、f -己內(nèi)酯、甲苯、辛酸亞錫、二氯甲烷和 冰乙醚的用量比為0. 1 g :3. 5 g :10 mL :50 μ L :5 mL :50 mL ;所述混合液a中PCL-0H、三 乙胺與二氯甲烷的用量比為2.5 g :0.25 g:5 mL;混合液b中丙烯酰氯與二氯甲烷的用量 比為0. 18 g : 10 mL ;混合液a與混合液b的質(zhì)量比7:10 ;所述PCL-A、己烷-1，6-二醇-二 丙烯酸酯（HDD)、4,4，-三亞甲基-二哌啶（TDP)、氯仿和4,4'-三亞甲基-二哌啶（TDP) 的用量比為0.5 g :0.68 g :0.69 g:10 mL :0.305 g;所述DMF與氯仿混合溶劑中DMF-氯仿 的體積比3:2 ; PCL4-PAE-NAS、c(RGDfK)、DMF-氯仿混和溶劑和TEA的用量比為80 mg : 16 mg :5 mL :200 μ L〇
【文檔編號(hào)】C08G63/664GK104055751SQ201410241636
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】史林啟, 高紅軍, 程堂劍, 馬如江, 安英麗 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)