恰瑪古多糖提取物及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及恰瑪古提取【技術(shù)領域】，是一種恰瑪古多糖提取物及制備方法；該恰瑪古多糖提取物，按下述制備方法得到：第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉。本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量較現(xiàn)有恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量有很大提高，且本發(fā)明中使用加熱純凈水回流提取，說明本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的得率高，能耗低，從而降低了生產(chǎn)成本，提高了提取效率，更能滿足現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
【專利說明】恰瑪古多糖提取物及制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及恰瑪古提取【技術(shù)領域】，是一種恰瑪古多糖提取物及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]從植物中提取的多糖類化合物，具有多種生物學活性，來源廣泛，且毒副作用小、質(zhì)量容易控制等優(yōu)點，現(xiàn)廣泛被作為人體免疫調(diào)節(jié)劑，如蟲草多糖、枸杞多糖、螺旋藻多糖、女貞子多糖等的作用已得到臨床廣泛驗證，植物多糖已成為當今藥物和功能性食品功效成分研究發(fā)展的新方向。
[0003]新疆地處歐亞大陸腹地，其特殊的地理環(huán)境和氣候條件孕育了許多獨特的植物資源，其中許多珍稀的藥用植物資源在國內(nèi)僅分布于新疆，許多地方藥材品種在成分和功效上也與內(nèi)地品種不同。恰瑪古，學名為蕪菁(Ara1S1Sica L.),為十字花科蕓薹屬植物，維吾爾語稱為“恰瑪古”，在全疆各地均有栽培，以肉質(zhì)根為食用和藥用的主要部分，是一種“藥食兩用”植物。
[0004]《中國中草藥大全》、《本草綱目》、《維吾爾藥志》、《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準-維吾爾藥分冊》等藥典對恰瑪古的植物來源、藥材性狀(包括塊根、葉、花和子)、化學成分、藥理作用、功能主治、配方加工等都有詳細記載。其中《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準-維吾爾藥分冊》中稱:“恰瑪古子，益腎助陽，健胃消食，散氣利尿，用于性欲減退，咳喘氣短，腰酸肢軟，小便不利，面色無華”。明代醫(yī)藥學家李時珍在《本草綱目》中記載:“恰瑪古，苦、溫、無毒，主治 腫毒、乳癰寒熱、急性黃疸，腹結(jié)不通等癥”。現(xiàn)代的《中國醫(yī)學大辭典》稱:“恰瑪古，無毒、治癆虛、通中、益氣、利五臟、治熱毒風腫、解酒毒”。由此可見，恰瑪古具有多種的治療和保健功能。
[0005]現(xiàn)有常用恰瑪古的多糖類化合物提取分離方法見(拜年等.新疆醫(yī)科大學學報，2010,33 (11)，1310-1311，)《苯酚-硫酸法測定恰麻古兒中多糖的含量》中使用石油醚脫月旨、乙醇及沸水回流提取恰瑪古中的多糖類化合物，但這種方法存在能耗高、得率低，不能滿足現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種恰瑪古多糖提取物及制備方法，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決現(xiàn)有從恰瑪古中提取多糖類化合物能耗高、得率低，不能滿足現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)要求的問題。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過以下措施來實現(xiàn)的:一種恰瑪古多糖提取物，按下述方法得到:第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升至30毫升的純凈水計，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次至5次，每次回流提取的溫度為80°C至100°C、每次回流提取的時間為0.5h至2.5h，每次回流提取后過濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml至0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍至18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%至90%，在溫度為1°C至8°C下醇沉4h至20h，然后在離心機中離心10分鐘至15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml至5mg/ml的多糖儲備液，在多糖儲備液中加入1/4倍至I倍多糖儲備液體積的sevag試劑，在搖床中振搖I次至4次，每次振搖2分鐘至8分鐘，振搖后靜置10分鐘至20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。
[0009]下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之一的進一步優(yōu)化或/和改進:
上述恰瑪古干片中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0% ;或/和，干燥粉末中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0%。
[0010]上述第二步和第四步中的水浴溫度為60°C至100°C ;或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥溫度為40°C至60°C，真空干燥的壓力為-0.09Mpa至-0.06Mpa。
[0011]上述sevag試劑為三氯甲烷和正丁醇按體積比為1:1至4:1混勻后得到；或/和，離心機的轉(zhuǎn)速為3000r/min至5000r/min ;或/和，恰瑪古干粉的粒徑為100目至10目；或/和，搖床的振搖頻率是IOOrpm至400rpm。
[0012]上述原料恰瑪古為完整無病蟲害的恰瑪古，在原料恰瑪古切片前先進行清洗；恰瑪古薄片的厚度為0.3厘米至0.8厘米。
[0013]本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過以下措施來實現(xiàn)的:一種恰瑪古多糖提取物的制備方法，第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升至30毫升的純凈水計，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次至5次，每次回流提取的溫度為80°C至100°C、每次回流提取的時間為0.5h至2.5h，每次回流提取后過濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml至0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍至18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%至90%，在溫度為1°C至8°C下醇沉4h至20h，然后在離心機中離心10分鐘至15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml至5mg/ml的多糖儲備液，在多糖儲備液中加入1/4倍至I倍多糖儲備液體積的sevag試劑,在搖床中振搖I次至4次,每次振搖2分鐘至8分鐘,振搖后靜置10分鐘至20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。
[0014]下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進一步優(yōu)化或/和改進:
上述恰瑪古干片中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0% ;或/和，干燥粉末中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0%。
[0015]上述第二步和第四步中的水浴溫度為60°C至100°C ;或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥溫度為40°C至60°C，真空干燥的壓力為-0.09Mpa至-0.06Mpa。
[0016]上述sevag試劑為三氯甲烷和正丁醇按體積比為1:1至4:1混勻后得到；或/和，離心機的轉(zhuǎn)速為3000r/min至5000r/min ;或/和，恰瑪古干粉的粒徑為100目至10目；或/和，搖床的振搖頻率是IOOrpm至400rpm。[0017]上述原料恰瑪古為完整無病蟲害的恰瑪古，在原料恰瑪古切片前先進行清洗；恰瑪古薄片的厚度為0.3厘米至0.8厘米。
[0018]本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量較現(xiàn)有恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量有很大提高，且本發(fā)明中使用加熱純凈水回流提取，說明本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的得率高，能耗低，從而降低了生產(chǎn)成本，提高了提取效率，更能滿足現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]附圖1為本發(fā)明中液料比對多糖含量的影響曲線圖。
[0020]附圖2為本發(fā)明中提取時間對多糖含量的影響曲線圖。
[0021]附圖3為本發(fā)明中提取次數(shù)對多糖含量的影響曲線圖。
[0022]附圖4為本發(fā)明中醇沉中乙醇水溶液的濃度對綜合評分的影響曲線圖。
[0023]附圖5為本發(fā)明中醇沉時間對綜合評分的的影響曲線圖。
[0024]附圖6為本發(fā)明中濃縮液濃度對綜合評分的影響曲線圖。
[0025]附圖7為本發(fā)明中多糖儲備液與試劑體積比對除蛋白影響曲線圖。
[0026]附圖8為本發(fā)明中三氯甲烷與正丁醇體積比對除蛋白影響曲線圖。 [0027]附圖9為本發(fā)明中振搖時間對除蛋白影響曲線圖。
[0028]附圖10為本發(fā)明中除蛋白次數(shù)對除蛋白影響曲線圖。
【具體實施方式】
[0029]本發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實際情況來確定具體的實施方式。下面提到的乙醇水溶液的濃度都為體積百分比濃度；純凈水用量按I克恰瑪古干粉中加入的純凈水量，純凈水量的單位為毫升。
[0030]實施例1，該恰瑪古多糖提取物，按下述制備方法得到:第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升至30毫升的純凈水計，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次至5次，每次回流提取的溫度為80°C至100°C、每次回流提取的時間為0.5h至2.5h，每次回流提取后過濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml至0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍至18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%至90%，在溫度為1°C至8°C下醇沉4h至20h，然后在離心機中離心10分鐘至15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml至5mg/ml的多糖儲備液,在多糖儲備液中加入1/4倍至I倍多糖儲備液體積的sevag試劑，在搖床中振搖I次至4次，每次振搖2分鐘至8分鐘，振搖后靜置10分鐘至20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。
[0031]實施例2，該恰瑪古多糖提取物，按下述制備方法得到:第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升或30毫升的純凈水計，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次或5次，每次回流提取的溫度為80°C或100°C、每次回流提取的時間為0.5h或2.5h，每次回流提取后過濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml或0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍或18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%或90%，在溫度為1°C或8°C下醇沉4h或20h，然后在離心機中離心10分鐘或15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml或5mg/ml的多糖儲備液,在多糖儲備液中加入1/4倍或I倍多糖儲備液體積的sevag試劑，在搖床中振搖I次或4次，每次振搖2分鐘或8分鐘，振搖后靜置10分鐘或20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h或4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。在第二步中，每次回流提取后過濾得到藥渣和濾液，然后在藥渣中按I克恰瑪古干粉中加入10毫升或30毫升的純凈水計向藥渣中加入純凈水進行下次回流提取。
[0032]實施例3，作為上述實施例的優(yōu)化，實施例3中恰瑪古干片中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0% ;或/和，干燥粉末中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0%。
[0033]實施例4，作為上述實施例的優(yōu)化，實施例4的第二步和第四步中的水浴溫度為60°C至100°C ;或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥溫度為40°C至60°C，真空干燥的壓力為-0.09Mpa至-0.06Mpa。
[0034]實施例5，作為上述實施例的優(yōu)化，實施例5中sevag試劑為三氯甲烷和正丁醇按體積比為1:1至4:1混勻后得至Ij ;或/和，離心機的轉(zhuǎn)速為3000r/min至5000r/min ;或/和，恰瑪古干粉的粒徑為100目至10目；或/和,搖床的振搖頻率是IOOrpm至400rpm。
[0035]實施例6，作為上述實施例的優(yōu)化，實施例6中原料恰瑪古為完整無病蟲害的恰瑪古，在原料恰瑪古切片前先進行清洗；恰瑪古薄片的厚度為0.3厘米至0.8厘米。
[0036]本發(fā)明上述實施例中各工藝參數(shù)的優(yōu)選按如下步驟確定:
一、多糖提取(多糖提取中多糖吸光度的測定根據(jù)苯酚-硫酸法進行測定)
1.液料比考察
表1為液料比(純凈水和恰瑪古干粉之比，即純凈水用量(毫升/克)的平均單因素考察表，按表1中的水平因素進行多糖的提取，然后測定多糖吸光度。
[0037]液料比考察平均單因素試驗結(jié)果:從圖1可看出，不同的液料比對本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖的含量有一定的影響，從10:1到20:1這一段來看隨著提取純凈水用量的增加，多糖含量增加，但當液料比大于20:1時，多糖含量隨著提取純凈水用量的增加而減小，故最佳提取的液料比為20:1。
[0038]2.提取時間考察
表2為提取時間的平均單因素考察表，按表2中的水平因素進行多糖的提取，然后測定多糖吸光度。
[0039]提取時間考察平均單因素試驗結(jié)果:多糖溶解于提取介質(zhì)中需要一定的時間，時間過短，多糖溶解不充分，多糖含量不高。從圖2中可看出，提取時間在小于1.5h時，本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量隨時間的延長而增加；提取時間在超過1.5h后，本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量隨時間的延長而減??；綜合考慮提取時間對多糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響；實際提取時間控制在1.5h較為合適。
[0040]3.提取次數(shù)考察表3為提取次數(shù)的平均單因素考察表，按表3中的水平因素進行多糖的提取，然后測定多糖吸光度。
[0041]提取次數(shù)考察平均單因素試驗結(jié)果:原料恰瑪古中多糖含量較高，一次性提取不可能將所有水溶性多糖均提取出來，提取次數(shù)過少，會造成多糖損失，原料浪費，進而增加成本，而提取次數(shù)過多會導致提取液體積過大，增加濃縮步驟的負擔，因此選擇合適的提取次數(shù)，對合理利用恰瑪古資源尤為重要。
[0042]從圖3中可看出，當提取次數(shù)低于3次時，本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量隨著提取次數(shù)的增加上升較快，但3次以后，本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量上升緩慢，故提取次數(shù)控制在3次為宜。
[0043]4.正交試驗
在單因素試驗的基礎上，選取液料比、提取時間和提取次數(shù)3項作為考察因素，每個因素各取3個水平，進行正交試驗設計L9(34)(表4)。以多糖含量為指標，確定最優(yōu)提取工藝條件，并對最優(yōu)條件進行驗證試驗。
[0044]正交試驗結(jié)果:經(jīng)過正交試驗及方差分析得出，3個因素對本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量的影響大小依次為C>B>A，即提取次數(shù)〉提取時間〉液料t匕，最佳提取工藝為A3B3C3，即液料比(V/W)為25: 1、提取時間為2h、提取次數(shù)為3次。結(jié)果見表5和表6。
[0045]5.優(yōu)化工藝的驗證
正交試驗和單因素試驗最 佳提取工藝不一樣，因此進行優(yōu)化試驗，表7為正交驗證試驗結(jié)果、表8單因素驗證試驗結(jié)果，根據(jù)單因素試驗分析得出的提取工藝進行3次重復試驗，多糖含量平均為44.15%，依據(jù)正交試驗分析所得出的提取工藝，進行了 3次重復試驗，多糖含量平均為50.09%，其結(jié)果高于前面試驗提取得到的多糖含量，表明此優(yōu)化工藝可行。
[0046]6.討論與結(jié)論
正交試驗表明，在加熱回流提取本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物的工藝中，提取次數(shù)是影響多糖提取率的最關鍵因素，然后依次是提取時間和液料比。試驗得出，本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物的最佳工藝條件為液料比(V/W)為25: 1、提取時間為2h、提取次數(shù)為3次。在最佳條件下，本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量平均為50.09%,表明該提取方法穩(wěn)定可行。
[0047]二、多糖醇沉(多糖醇沉中多糖吸光度的測定根據(jù)苯酚-硫酸法進行測定)
1.單因素試驗
精密吸取濃縮液10ml，共四份，分別選取對多糖醇沉有重要影響的因素:乙醇體積百分比濃度:60%、70%、80%、90% ;醇沉時間:4h、8h、14h、20h ;濃縮液濃度:0.4g/ml、0.3g/ml、
0.2g/ml、0.lg/ml進行試驗,5000r/min離心15min,將沉淀置于恒重過(連續(xù)兩次稱重差異不超過5mg)的蒸發(fā)皿中蒸干，恒重(連續(xù)兩次稱重差異不超過5mg)，精密稱重。研磨成粉末并取0.1g加純凈水至100mL容量瓶中定容，然后測定其多糖吸光度得到多糖含量，算其綜合評分。
[0048]按照綜合評分=(標志性成分/最大標志含量)*30+ (浸出物量/最大浸出物量)*70,進行篩選。
[0049]1.1醇沉中乙醇水溶液的濃度對多糖醇沉的影響濃縮液濃度為0.4g/ml，醇沉時間為8h，考察醇沉中乙醇水溶液的濃度對多糖醇沉的影響。測定多糖吸光度，算其綜合評分。
[0050]醇沉中乙醇水溶液的濃度考察單因素試驗結(jié)果:從圖4中可以看出隨著醇沉中乙醇水溶液的濃度的增加，所得干燥粉末綜合評分增加，故采取最佳醇沉的乙醇水溶液的體積百分比濃度為90%。
[0051]1.2醇沉時間對多糖醇沉的影響
濃縮液濃度為0.4g/ml，醇沉的乙醇水溶液的體積百分比濃度為80%，考察醇沉時間對多糖醇沉的影響；然后測定多糖吸光度，算其綜合評分。
[0052]醇沉時間考察單因素試驗結(jié)果:從圖5中可以看出隨著醇沉時間的增加多糖綜合評分增加的并不明顯，在8h綜合評分最高，故采取最佳的醇沉時間為8h。
[0053]1.3濃縮液濃度對多糖醇沉的影響
醇沉的乙醇水溶液的體積百分比濃度為80%，醇沉時間為8h，考察濃縮液濃度對多糖醇沉的影響。測定多糖吸光度，算其綜合評分。
[0054]濃縮液濃度考察單因素試驗結(jié)果:從圖6中可以看出濃縮液濃度越大，綜合評分也高，因此最佳提取濃縮液濃度為0.4g/ml。
[0055]2.多糖醇沉正交試驗
參考單因素實驗結(jié)果，選取醇沉的乙醇水溶液濃度、濃縮液濃度、醇沉時間3項作為考察因素，每個因素各取3個水平，進行正交試驗設計L9(34)(表9)。以綜合評分為指標，確定本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物的最優(yōu)醇沉工藝條件，并對最優(yōu)條件進行驗證試驗。
[0056]多糖醇沉正交試驗結(jié)果:經(jīng)過正交試驗及方差分析得出，3個因素對恰瑪古多糖含量的影響大小依次為B>A>C，即醇沉中乙醇水溶液的濃度 > 濃縮液濃度 > 醇沉時間，最佳提取工藝為A1B3C2,即濃縮液濃度為0.4g/ml、醇沉中乙醇水溶液的濃度為90%、醇沉時間8h。結(jié)果見表10正交試驗表和表11方差分析表。
[0057]由表10和表11可知最佳實驗方案為A1B3C2即濃縮液濃度為0.4g/ml,乙醇水溶液的濃度為90%，醇沉時間為8小時。根據(jù)直觀分析及方差分析可知，三個因素中只有濃縮液濃度和醇沉中乙醇水溶液的濃度對綜合評分影響顯著，而醇沉時間因素則可以在三水平中選擇更節(jié)能、更節(jié)省時間的水平，所以醇沉時間也可以選擇4h。
[0058]3.醇沉驗證試驗
由正交試驗表分析出最優(yōu)條件為A1B3C2,正交表中沒有此條件，需做驗證試驗(表12)，依據(jù)正交試驗分析所得出的提取工藝綜合評分的平均值為98.1795，其結(jié)果高于前面試驗提取得到的綜合評分，表明此工藝可行。
[0059]4.結(jié)論
在多糖的醇沉過程中，濃縮液濃度和乙醇水溶液濃度是影響多糖醇沉的2個關鍵因素。提取液中由于多糖起始濃度較低，沉淀多糖前一般都需要進行濃縮處理。隨著濃縮過程的進行，濃縮比的增大，溶液黏度變大，使得后續(xù)的醇沉分離難度加大，導致多糖得率降低，因此濃縮比不宜過大。
[0060]三.多糖除蛋白(多糖除蛋白中蛋白質(zhì)吸光度的測定根據(jù)中華人民共和國藥典2010版二部附錄VII蛋白質(zhì)含量測定方法第五法考馬斯亮藍法進行測定；多糖除蛋白中多糖吸光度的測定根據(jù)苯酚-硫酸法進行測定)
1.除蛋白單因素試驗
精密稱取干燥粉末0.5g，加入純凈水配制成250ml多糖儲備液，低溫保存，待用。每次精密移取多糖儲備液20ml，加入不同體積的sevag試劑、不同的振搖時間及除蛋白次數(shù)，取上清液，測多糖吸光度以及蛋白質(zhì)吸光度。
[0061]蛋白去除率(％) =(脫蛋白前蛋白含量一脫蛋白后蛋白含量)/脫蛋白前蛋白含量 XlOO
多糖損失率(％)=(脫蛋白前多糖含量一脫蛋白后多糖含量)/脫蛋白前多糖含量 XlOO
根據(jù)以上2個指標考察單因素最佳條件。
[0062]1.1多糖儲備液與試劑體積比對除蛋白的影響
三氯甲烷:正丁醇(V/V)=4:l、振蕩時間6min、除蛋白次數(shù)I次，考察多糖儲備液與sevag試劑體積比。測定多糖吸光度以及蛋白質(zhì)吸光度。
[0063]多糖儲備液與sevag試劑體積比考察單因素試驗結(jié)果:由圖7可知，當多糖儲備液與sevag試劑體積比為2:1時，多糖吸光度為0.5855，蛋白的吸光度為0.2697，低于其他體積比的蛋白吸光度，蛋白去除率最高，綜合考慮，選取多糖儲備液與sevag試劑體積比為2:1。
[0064]1.2三氯甲烷與正丁醇體積比對除蛋白的影響
多糖儲備液與sevag試劑(V/V)2:l、振蕩時間6min、除蛋白次數(shù)I次,考察三氯甲燒與正丁醇體積比。然后測定多糖吸光度以及蛋白質(zhì)吸光度。
[0065]三氯甲烷與正丁醇體積比考察單因素試驗結(jié)果:由圖8可知，當三氯甲烷與正丁醇體積比為3:1時，多糖的吸光度為0.5806，相對較低，但蛋白吸光度為0.2765，低于其他體積比的蛋白吸光度，即蛋白去除率最聞。綜合考慮，二氣甲燒與正丁醇的最優(yōu)體積比為3:1。
[0066]1.3振搖時間對除蛋白的影響
多糖儲備液=Sevag試劑(V/V)2:l、三氯甲烷:正丁醇(V/V)3:l、除蛋白次數(shù)I次，考察振蕩時間；然后測定多糖吸光度以及蛋白質(zhì)吸光度。
[0067]振搖時間考察單因素試驗結(jié)果:由圖9知，當振蕩時間為4 min時，多糖的吸光度為0.5848，蛋白吸光度為0.3035，低于其他振蕩時間的蛋白吸光度，即蛋白去除率最高，綜合考慮，選取振蕩時間為4min。
[0068]I.4除蛋白次數(shù)對除蛋白的影響
多糖儲備液:sevag試劑(V/V)2:l、三氯甲烷:正丁醇(V/V)3:l、振蕩時間4min，考察除蛋白次數(shù)；然后測定多糖吸光度以及蛋白質(zhì)吸光度。
[0069]除蛋白次數(shù)考察單因素試驗結(jié)果:由圖10可知，當除蛋白次數(shù)為4次時，多糖的平均吸光度為0.4638，蛋白的平均吸光度為0.2369，蛋白的吸光度最低，即蛋白去除率最高，但是考慮到試劑用量大且有毒性，所以選取3次為最佳試驗條件。
[0070]2.除蛋白正交試驗
參考單因素實驗結(jié)果，選取多糖儲備液與試劑體積比、三氯甲烷與正丁醇體積比、振搖時間和除蛋白次數(shù)4項作為考察因素，每個因素各取3個水平，進行正交試驗設計L9(34)(表13)。以蛋白去除率為指標，確定本發(fā)明上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物的最優(yōu)除蛋白工藝條件，并對最優(yōu)條件進行驗證試驗。
[0071]正交試驗結(jié)果:經(jīng)過正交試驗及方差分析得出，4個因素對蛋白質(zhì)含量的影響大小依次為A>D>C>B，即多糖儲備液與試劑體積比 > 除蛋白次數(shù)〉振搖時間〉三氯甲烷與正丁醇體積比，最佳提取工藝為A1B1C3 D3,即多糖儲備液與試劑體積比為1: 1、三氯甲烷與正丁醇體積為2: 1、振搖時間為6min、除蛋白次數(shù)為3次。試驗中，隨著除蛋白次數(shù)的增加，蛋白的去除率在增加，但多糖的損失也在增加。結(jié)果見表14和表15。
[0072]3.除蛋白驗證試驗
由上圖可知最優(yōu)條件為A1B1C3D3，正交表中沒有此條件，需做驗證試驗(表16)。依據(jù)正交試驗分析所得出的醇沉工藝，蛋白去除率為74.6886%，其結(jié)果高于正交試驗中的蛋白去除率，表明此工藝可行。
[0073]4.結(jié)論
sevag法使蛋白質(zhì)乳化,能夠達到除蛋白純化多糖的目的，而且sevag法除蛋白對多糖的損失小，該試驗的結(jié)論對大批量多糖除蛋白有一定的指導意義，可作為多糖除蛋白質(zhì)的參考依據(jù)。
[0074]根據(jù)上述實施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量為10.36%至12.67%，且使用加熱純凈水回流提取；而現(xiàn)有從恰瑪古中提取多糖的方法中，都是用石油醚脫脂、乙醇及沸水回流進行提取，提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量為10.18%，經(jīng)對比:本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量較現(xiàn)有恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量有很 大提高，而現(xiàn)有從恰瑪古中提取多糖的方法中使用石油醚脫脂、乙醇及沸水回流進行提取的成本較本發(fā)明中采用加熱純凈水回流提取的成本高，因此說明本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的得率高，能耗低，從而降低了生產(chǎn)成本，提高了提取效率，更能滿足現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0075]以上技術(shù)特征構(gòu)成了本發(fā)明的實施例，其具有較強的適應性和實施效果，可根據(jù)實際需要增減非必要的技術(shù)特征，來滿足不同情況的需求。
【權(quán)利要求】
1.一種恰瑪古多糖提取物，其特征在于按下述方法得到:第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升至30毫升的純凈水計，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次至5次，每次回流提取的溫度為80°C至100°C、每次回流提取的時間為0.5h至2.5h，每次回流提取后過濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml至0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍至18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%至90%，在溫度為1°C至8°C下醇沉4h至20h，然后在離心機中離心10分鐘至15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml至5mg/ml的多糖儲備液,在多糖儲備液中加入1/4倍至I倍多糖儲備液體積的sevag試劑，在搖床中振搖I次至4次，每次振搖2分鐘至8分鐘，振搖后靜置10分鐘至20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恰瑪古多糖提取物，其特征在于恰瑪古干片中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0% ;或/和，干燥粉末中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的恰瑪古多糖提取物，其特征在于第二步和第四步中的水浴溫度為60°C至100°C;或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥溫度為400C至60°C，真空干燥的壓力為-0.09Mpa至-0.06Mpa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的恰瑪古多糖提取物，其特征在于sevag試劑為三氯甲烷和正丁醇按體積比為1:1至4:1混勻后得到；或/和，離心機的轉(zhuǎn)速為3000r/min至5000r/min ;或/和，恰瑪 古干粉的粒徑為100目至10目；或/和，搖床的振搖頻率是IOOrpm至 400rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的恰瑪古多糖提取物，其特征在于原料恰瑪古為完整無病蟲害的恰瑪古，在原料恰瑪古切片前先進行清洗；恰瑪古薄片的厚度為0.3厘米至0.8厘米。
6.一種恰瑪古多糖提取物的制備方法，其特征在于按下述方法進行:第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升至30毫升的純凈水計，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次至5次，每次回流提取的溫度為80°C至100°C、每次回流提取的時間為0.5h至2.5h，每次回流提取后過濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml至0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍至18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%至90%，在溫度為1°C至8°C下醇沉4h至20h，然后在離心機中離心10分鐘至15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml至5mg/ml的多糖儲備液,在多糖儲備液中加入1/4倍至I倍多糖儲備液體積的sevag試劑，在搖床中振搖I次至4次，每次振搖2分鐘至8分鐘，振搖后靜置10分鐘至20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的恰瑪古多糖提取物的制備方法，其特征在于恰瑪古干片中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0% ;或/和，干燥粉末中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的恰瑪古多糖提取物的制備方法，其特征在于第二步和第四步中的水浴溫度為60°C至100°C ;或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥溫度為40°C至60°C，真空干燥的壓力為-0.09Mpa至-0.06Mpa。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述的恰瑪古多糖提取物的制備方法，其特征在于sevag試劑為三氯甲烷和正丁醇按體積比為1:1至4:1混勻后得到；或/和，離心機的轉(zhuǎn)速為3000r/min至5000r/min ;或/和，恰瑪古干粉的粒徑為100目至10目；或/和，搖床的振搖頻率是IOOrpm 至 400rpm。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8或9所述的恰瑪古多糖提取物的制備方法，其特征在于原料恰瑪古為完整無 病蟲害的恰瑪古，在原料恰瑪古切片前先進行清洗；恰瑪古薄片的厚度為0.3厘米至0.8厘米。
【文檔編號】C08B37/00GK104017100SQ201410266707
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】安熙強, 張濤, 趙婷婷, 向陽, 向小東, 程江南, 胡旭, 張娟 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所, 柯坪縣圣泉實業(yè)有限公司