一種海參多糖的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種海參多糖的提取方法，特點是包括以下步驟：原料海參浸泡清洗，用粉碎機進行粉碎處理后與4~8倍體積的去離子水混合均勻放入離心機，在8000~12000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30~40分鐘，去除上清液，沉淀物與3~6倍的去離子水混合均勻后放入生物酶解罐，調(diào)節(jié)溫度為45~65℃、pH值為6.5~8.0，加入添加量為原料重量的0.3~3%的復(fù)合酶進行酶解處理2~6小時，得到的酶解產(chǎn)物用截留分子量為6~10KD的超濾膜進行一次濃縮過濾后，濾液與1~2倍的去離子水混合后用6~10KD的超濾膜進行二次濃縮過濾，得到的濾渣冷凍干燥后即得海參多糖；優(yōu)點是提取過程水資源用量少，且海參多糖的提取率高。
【專利說明】一種海參多糖的提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多糖的提取方法，尤其是涉及一種海參多糖的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002]海參作為一種傳統(tǒng)海產(chǎn)珍品，營養(yǎng)價值高，生理活性物質(zhì)含量豐富。海參有刺參類和光參類兩大類，主要有海地瓜、白乳參、黑海參、仿刺參、花刺參、黑乳參、海棒槌等品種。海參體壁中含有海參多糖、海參皂苷及海參膠原蛋白等多種具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)功能的活性物質(zhì)。海參多糖是海參體壁的重要組成成分，海參多糖包括海參粗多糖、海參硫酸軟骨素(SC-CHS)及海參巖藻聚糖硫酸酯(SC — FUC)，其中海參粗多糖由海參硫酸軟骨素及海參巖藻聚糖硫酸酯2種組分構(gòu)成。海參硫酸軟骨素是一種帶巖藻糖支鏈的酸性粘多糖，主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖及巖藻糖組成，且摩爾比約為1:1:1。海參巖藻聚糖硫酸酯是由巖藻糖所構(gòu)成的直鏈多糖。二者的糖基組成不同，糖鏈上都有部分羥基發(fā)生硫酸酯化。海參硫酸軟骨素及海參巖藻聚糖硫酸酯具有不同的結(jié)構(gòu)及活性，現(xiàn)已被證實具有抗凝血、抗腫瘤、增強免疫力、降血脂等多種生物活性，在功能性食品及新藥開發(fā)方面具有良好的應(yīng)用前景。
[0003]現(xiàn)有的海參多糖的傳統(tǒng)提取工藝可分為五類，即酸法、堿法、酶法、鹽法以及熱水浸提法等，其基本原理都是根據(jù)海產(chǎn)品的特性，改變蛋白質(zhì)的外界環(huán)境，從而把多糖分離出來。酸法和堿法是將多糖在酸性和堿性環(huán)境下提取出來，鹽法是將原料在一定濃度的鹽溶液中提取出來，主要使用的鹽有氯化鈉、氯化鉀和乙酸鈉。以上三種方法雖然工藝簡單，但是由于提取過程中會使用大量的淡水和酸堿鹽，屬于高能耗產(chǎn)業(yè)，排放的酸堿鹽對周圍環(huán)境產(chǎn)生一定的生態(tài)影響，不符合綠色可持續(xù)性經(jīng)濟發(fā)展模式。此外，熱水浸提法也需要使用大量的淡水和能源，不符合國家及世界經(jīng)濟發(fā)展的主流。現(xiàn)有的酶法提取工藝主要利用酶反應(yīng)的溫和高效性在一定環(huán)境條件下將多糖從不同的原料中提取出來，然而酶法提取工藝雖然克服了上述其他提取工藝的缺陷，能夠減少淡水資源的消耗，然而提取率卻不高，一般僅有 1.65%~2.68%。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種結(jié)合生物酶解技術(shù)和膜技術(shù)來提取海參多糖的方法，既能有效減少原料及淡水的消耗量，又有利于提高海參多糖的提取率。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種海參多糖的提取方法，包括以下步驟:①將原料海參進行浸泡清洗；②使用粉碎機對浸泡清洗后的海參進行粉碎處理；③將粉碎處理后的海參與4~8倍體積的去離子水混合均勻后放入離心機，在8000~12000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下連續(xù)離心分離30~40分鐘離心分離結(jié)束后去除上清液，剩余的沉淀物與3~6倍體積的去離子水混合均勻后放入生物酶解罐，在溫度為45~65°C、pH值為6.5~8.0的條件下，加入復(fù)合酶進行酶解處理2~6小時，復(fù)合酶的添加量為原料海參重量的0.3~3% 將經(jīng)過生物酶解罐酶解處理的酶解產(chǎn)物用截留分子量為6~1KD的超濾膜進行第一次濃縮過濾；⑥將經(jīng)過第一次濃縮過濾得到的濾液與I~2倍的去離子水混合后再次通過截留分子量為6~1KD的超濾膜進行第二次濃縮過濾；?將經(jīng)過第二次濃縮過濾得到的濾渣冷凍干燥，即得到海參多糖。
[0006]步驟④中所述的復(fù)合酶是由胃蛋白酶、胰蛋白酶和膠原蛋白酶復(fù)配而成，所述的胃蛋白酶、所述的胰蛋白酶和所述的膠原蛋白酶的重量配比為I~3:1~3:2~5。胃蛋白酶是一種酸性蛋白酶，能分解蛋白質(zhì)中由芳香族氨基酸或酸性氨基酸所形成的肽鍵，胰蛋白酶只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵，兩者酶解效果好，酶解條件也溫和，然而由于原料為海參，海參中含有部分會對胰蛋白酶的作用造成抑制的物質(zhì)，膠原蛋白酶的添加則正好彌補了這一缺陷，因此，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和膠原蛋白酶按I~3:1~3:2~5的比例復(fù)配而成的復(fù)合酶進行酶解，能夠充分發(fā)揮酶解作用，有利于提高酶解效果。
[0007]步驟④中所述的復(fù)合酶是由胃蛋白酶、胰蛋白酶和膠原蛋白酶復(fù)配而成，所述的胃蛋白酶、所述的胰蛋白酶和所述的膠原蛋白酶的重量配比為2~3:1~2:3~4。
[0008]步驟⑤和步驟⑥中所述的超濾膜為中空纖維膜、管式膜或者平板膜。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:與傳統(tǒng)的酸法、堿法、酶法、鹽法以及熱水浸提法提取海參多糖相比，本發(fā)明中原料海參經(jīng)過粉碎、離心、酶解以及兩次超濾膜濃縮過濾等步驟，將生物酶解處理和超濾膜的濃縮過濾處理相結(jié)合用于提取海參多糖，最大限度地利用了原料海參和酶的價值，降低了原料消耗，且整個提取過程中反應(yīng)環(huán)境溫和，可保證海參多糖的活性和純度，提高海參多糖的提取率，其提取率可達8.32% ;此外，在整個提取過程中廢水、廢液排放量低，有利于降低能耗，符合綠色可持續(xù)經(jīng)濟發(fā)展的要求。

【具體實施方式】
[0010]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0011]實施例一:采用海地瓜作為原料海參，進行海參多糖的提取，提取方法包括以下步驟:①將海地瓜進行浸泡清洗使用粉碎機對浸泡清洗后的海地瓜進行粉碎處理，使得海地瓜呈流體漿物狀；③將粉碎處理后的海地瓜與8倍體積的去離子水混合均勻后放入離心機，在12000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下連續(xù)離心分離40分鐘，從而去除其中的非多糖的水溶性物質(zhì)離心分離結(jié)束后去除上清液，得到含多糖的沉淀物，將該含多糖的沉淀物與3倍體積的去離子水混合均勻后放入生物酶解罐，在溫度為45°C、pH值為8.0的條件下，加入復(fù)合酶進行酶解處理6小時，在此，復(fù)合酶由胃蛋白酶、胰蛋白酶和膠原蛋白酶的重量按比例1:1:2復(fù)配而成，添加量為原料海地瓜重量的0.3% 采用現(xiàn)有的超濾設(shè)備，將經(jīng)過生物酶解罐酶解處理的酶解產(chǎn)物用截留分子量為6KD的中空纖維膜進行第一次濃縮過濾，在此分子量大于截留分子量為6KD的分子被截留；⑥將經(jīng)過第一次濃縮過濾的濾液與2倍體積的去離子水混合后再次通過截留分子量為6KD的中空纖維膜進行第二次濃縮過濾；⑦將經(jīng)過第二次濃縮過濾得到的濾渣冷凍干燥，即得到海參多糖，經(jīng)測算得，海參多糖的提取率為
8.32%。
[0012]實施例二:采用白乳參作為原料海參，進行海參多糖的提取，提取方法包括以下步驟:①將白乳參進行浸泡清洗使用粉碎機對浸泡清洗后的白乳參進行粉碎處理，使得白乳參呈流體漿物狀；③將粉碎處理后的白乳參與4倍體積的去離子水混合均勻后放入離心機，在8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下連續(xù)離心分離30分鐘，從而去除其中的非多糖的水溶性物質(zhì)離心分離結(jié)束后去除上清液，得到含多糖的沉淀物，將該含多糖的沉淀物與6倍體積的去離子水混合均勻后放入生物酶解罐，在溫度為65°C、pH值為6.5的條件下，加入復(fù)合酶進行酶解處理2小時，復(fù)合酶由胃蛋白酶、胰蛋白酶和膠原蛋白酶的重量按比例1:3:5復(fù)配而成，添加量為原料白乳參重量的3% 采用現(xiàn)有的超濾設(shè)備，將經(jīng)過生物酶解罐酶解處理的酶解產(chǎn)物用截留分子量為1KD的中空纖維膜進行第一次濃縮過濾，在此分子量大于截留分子量為1KD的分子被截留；⑥將經(jīng)過第一次濃縮過濾的濾液與I倍體積的去離子水混合后再次通過截留分子量為1KD的中空纖維膜進行第二次濃縮過濾將經(jīng)過第二次濃縮過濾得到的濾渣冷凍干燥，即得到海參多糖，經(jīng)測算得，海參多糖的提取率為5.35%。
[0013]實施例三:采用黑海參作為原料海參，進行海參多糖的提取，提取方法包括以下步驟:①將黑海參進行浸泡清洗使用粉碎機對浸泡清洗后的黑海參進行粉碎處理，使得黑海參呈流體漿物狀；③將粉碎處理后的黑海參與6倍體積的去離子水混合均勻后放入離心機，在10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下連續(xù)離心分離35分鐘，從而去除其中的非多糖的水溶性物質(zhì)離心分離結(jié)束后去除上清液，得到含多糖的沉淀物，將該含多糖的沉淀物與5倍體積的去離子水混合均勻后放入生物酶解罐，在溫度為60°C、pH值為7.0的條件下，加入復(fù)合酶進行酶解處理4小時，復(fù)合酶由胃蛋白酶、胰蛋白酶和膠原蛋白酶的重量按比例3:1:5復(fù)配而成，添加量為原料黑海參重量的1.5% 采用現(xiàn)有的超濾設(shè)備，將經(jīng)過生物酶解罐酶解處理的酶解產(chǎn)物用截留分子量為8KD的中空纖維膜進行第一次濃縮過濾，在此分子量大于截留分子量為8KD的分子被截留；⑥將經(jīng)過第一次濃縮過濾的濾液與1.5倍體積的去離子水混合后再次通過截留分子量為8KD的中空纖維膜進行第二次濃縮過濾；⑦將經(jīng)過第二次濃縮過濾得到的濾渣冷凍干燥，即得到海參多糖，經(jīng)測算得，海參多糖的提取率為
5.72%。
[0014]除上述實施例一至三之外，在其他實際海參多糖的提取過程中，用于第一次濃縮過濾和第二次濃縮過濾的超濾膜還可以采用管式膜或者平板膜。
[0015]分別從實施例一、二、三中取1.0g提取得到的海參多糖，再將這三組海參多糖分別溶于 30mL 的 2SmmoI /I,的 NaH2PO4-Na2HPO4 的緩沖液中，以 Q-Sepharose Fast Flow (QFF)陰離子交換柱(2.6cmX40cm)分離純化,其中分離采用O~3mol/L的氯化鈉溶液進行梯度洗脫，流速為5mL/min，收集餾分得到海參硫酸軟骨素(SC — CHS)和海參巖藻聚糖硫酸酯(SC — FUC)。再分別測定各實施例中得到的海參多糖中的海參硫酸軟骨素(SC — CHS)和海參巖藻聚糖硫酸酯(SC — FUC)的相對分子質(zhì)量、蛋白質(zhì)含量及硫酸根含量，結(jié)果如表1。
[0016]其中，蛋白質(zhì)含量采用Folin-酚法測定，以牛血清白蛋白為標準品。相對分子質(zhì)量通過高效凝膠排阻色譜法測定，根據(jù)GPC軟件繪制標準曲線，計算對應(yīng)的相對分子質(zhì)量色譜條件如下，色譜柱:TSK-gelG4000PWxl(30.0cmX7.8mm);檢測器:示差檢測器(RID);流動相:0.2mol/L NaCl ;流速:0.5mL/min ;柱溫:40°C。硫酸根含量通過離子色譜法測定，色譜條件如下，色譜柱:1npac ASll-HC(4mmX 250mm);保護柱:D1nex 1npacAGl1-HC(4mmX 50mm);淋洗液:20mmol KOH ；流速:1.2mL/min ;柱溫:30 °C ;進樣體積:25 μ L ;抑制器=ASRS ULTRA II陰離子抑制器；抑制電流:90mA。
[0017]表1 實施例一至三中各海參多糖中各組分的蛋白質(zhì)含量、相對分子質(zhì)量及硫酸根含量
[0018]

【權(quán)利要求】
1.一種海參多糖的提取方法，其特征在于包括以下步驟:①將原料海參進行浸泡清洗；②使用粉碎機對浸泡清洗后的海參進行粉碎處理；③將粉碎處理后的海參與41倍體積的去離子水混合均勻后放入離心機，在800(Tl2000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下連續(xù)離心分離30-40分鐘；@離心分離結(jié)束后去除上清液，剩余的沉淀物與3飛倍體積的去離子水混合均勻后放入生物酶解罐，在溫度為45-65°C、pH值為6.5^8.0的條件下，加入復(fù)合酶進行酶解處理2飛小時，復(fù)合酶的添加量為原料海參重量的0.3^3% 將經(jīng)過生物酶解罐酶解處理的酶解產(chǎn)物用截留分子量為6~10KD的超濾膜進行第一次濃縮過濾；⑥將經(jīng)過第一次濃縮過濾得到的濾液與廣2倍體積的去離子水混合后再次通過截留分子量為6~10KD的超濾膜進行第二次濃縮過濾；⑦將經(jīng)過第二次濃縮過濾得到的濾渣冷凍干燥，即得到海參多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海參多糖的提取方法，其特征在于步驟④中所述的的復(fù)合酶是由胃蛋白酶、胰蛋白酶和膠原蛋白酶復(fù)配而成，所述的胃蛋白酶、所述的胰蛋白酶和所述的膠原蛋白酶的重量配比為1-3:1-3:2-5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海參多糖的提取方法，其特征在于步驟④中所述的的復(fù)合酶是由胃蛋白酶、胰蛋白酶和膠原蛋白酶復(fù)配而成，所述的胃蛋白酶、所述的胰蛋白酶和所述的膠原蛋白酶的重量配比為2~3:1-2:3~4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種海參多糖的提取方法，其特征在于步驟⑤和步驟⑥中所述的超濾膜為中空纖維膜、管式膜或者平板膜。
【文檔編號】C08B37/00GK104130334SQ201410345281
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】馮群力 申請人:馮群力