合成真菌毒素吸附劑以及制備和使用所述合成真菌毒素吸附劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明總體涉及合成真菌毒素吸附劑以及制備和使用所述合成真菌毒素吸附劑的方法，以及分子印跡聚合物(MIP)。特別地，本發(fā)明涉及能相對(duì)大量制備的可再用、生態(tài)友好的MIP，制備所述MIP的方法以及使用所述MIP的方法(例如，螯合和/或吸附靶化合物(例如，真菌毒素))。本發(fā)明的組合物和方法用于多種應(yīng)用，其包括飲食治療、預(yù)防劑、食品和飲料加工和制造以及研究、質(zhì)量控制和溯源應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】合成真菌毒素吸附劑以及制備和使用所述合成真菌毒素吸附劑的方法
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年8月27日的中國(guó)專利申請(qǐng)201080043818.1“合成真菌毒素吸附劑以及制備和使用所述合成真菌毒素吸附劑的方法”的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)的引用
[0003]本申請(qǐng)要求2009年8月27日提交的第61/237，549號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其整體內(nèi)容通過(guò)弓I用并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明一般涉及分子印跡聚合物(MIP)。特別地，本發(fā)明涉及可再用、生態(tài)友好的MIP，制備所述MIP的方法以及使用所述MIP的方法(例如，螯合和/或吸附靶標(biāo)(例如，真菌毒素))。本發(fā)明的組合物和方法用于多種應(yīng)用，其包括飲食、治療、預(yù)防劑、食品和飲料加工和制造以及研究和質(zhì)量控制應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0005]真菌毒素是由多種真菌分泌的次生代謝物，通常在收割之前、期間和之后在谷粒以及飼料中產(chǎn)生。飼料和谷物與真菌孢子自然接觸。植物的真菌污染和毒素的生物合成取決于收割前植物的健康狀況、氣象條件、收割技術(shù)、在保存穩(wěn)定之前的延遲和熱液條件以及飼料加工。依賴于真菌，真菌生長(zhǎng)由包括游離水量(aw)、溫度、氧氣的存在、底物性質(zhì)和pH條件在內(nèi)的多種物理化學(xué)參數(shù)控制。真菌毒素在收割前以及收割后的儲(chǔ)存中增殖。
[0006]一些真菌僅在特定水平的水分、溫度或氧氣下產(chǎn)生毒素。真菌毒素影響的嚴(yán)重程度顯著不同。一些真菌毒素為致命的，一些導(dǎo)致可識(shí)別的疾病或健康問(wèn)題，一些使免疫系統(tǒng)變?nèi)醵划a(chǎn)生對(duì)所述真菌毒素特異的癥狀，一些充當(dāng)過(guò)敏原或刺激物而一些對(duì)動(dòng)物或人不具有已知影響。在二戰(zhàn)期間，俄國(guó)士兵在食用由鐮刀菌(Fusarium)污染的發(fā)霉谷物后遭受嚴(yán)重的皮膚壞死、出血和骨質(zhì)破壞。然而，直到二十世紀(jì)六十年代，當(dāng)大于100,000只的英國(guó)火雞由致命的肝病(火雞X病)殺滅時(shí)，科學(xué)界才認(rèn)識(shí)到與真菌毒素有關(guān)的負(fù)面影響(參見(jiàn)，例如，TrenholmH.L., Charmley L.L.和 Prelusky D.B., 1996.Mycotoxinbinding agents:An update on what we know (真菌毒素結(jié)合劑:獲知的最新報(bào)道).1n:B1technology in the Feed Industry (Lyons T.P 和 Jacques K.A 編輯)NottinghamUniversity Press, Loughborough, Leics, UK, pp.327-349)。根據(jù)最近的聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織(FAO)報(bào)道，約25%的世界谷物供應(yīng)受真菌毒素污染。真菌毒素污染對(duì)食品和飼料生產(chǎn)者，特別是谷物和家禽生產(chǎn)者具有負(fù)面經(jīng)濟(jì)影響。
[0007]由于植物產(chǎn)品(例如，飼料、谷物、植物蛋白、加工的谷物副產(chǎn)品、粗飼料和糖蜜產(chǎn)品)的真菌感染而使真菌毒素能在食物鏈中出現(xiàn)，并能由人類直接食用或通過(guò)污染的谷物、牲畜或其它動(dòng)物飼料而引入。真菌毒素在消化過(guò)程中顯著耐分解，因此它們以可食用產(chǎn)品(例如，肉、魚、蛋和乳制品)的形式或以吸收的母體毒素的代謝物形式而殘留在食物鏈中。諸如蒸煮和冷凍的溫度處理不是減少真菌毒素流行的適當(dāng)方法。因此，亟需用于減少有害影響和/或消除飼料和/或食物鏈中真菌毒素出現(xiàn)的組合物和/或方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及分子印跡聚合物(MIP)。特別地，本發(fā)明涉及可再用、生態(tài)友好的MIP，制備所述MIP的方法以及使用所述MIP的方法(例如，螯合和/或吸附靶標(biāo)(例如，真菌毒素))。本發(fā)明的組合物和方法用于多種應(yīng)用，其包括飲食、治療、預(yù)防劑、食品和飲料加工和制造以及研究和質(zhì)量控制應(yīng)用。
[0009]因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含使用真菌毒素模板合成的分子印跡聚合物的組合物。本發(fā)明不限于用于產(chǎn)生分子印跡聚合物的真菌毒素模板。實(shí)際上，可使用多種真菌毒素模板，其包括但不限于乙酰氧基薦草鐮刀菌烯二醇(acetoxyscirpened1l)，乙?；撗跹└牭毒┐?，乙?；└牭毒┐?，乙酰基新茄病鐮刀菌烯醇，乙?；鵗-2毒素，黃曲霉毒素，黃曲霉毒素B1、B2、Gl和G2,黃曲霉震_毒素,細(xì)交鏈孢酸,格鏈孢酹，焦曲二醇，焦曲酰胺(austamide),焦曲斯汀(austocystin),燕麥鐮孢菌素+1,白僵菌素+2, bentenolide, brevianamide, 丁烯酸內(nèi)酯,麗赤殼菌素,毛殼球菌素,毛殼素,毛殼菌素，橘霉素，黃綠青霉素，可皆霉素，細(xì)胞松弛素，環(huán)匹阿尼酸，脫乙酰麗赤殼菌素，脫乙酰新茄病鐮刀菌烯醇，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇二醋酸酯，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇一醋酸酯，二乙酰氧基薦草鐮刀烯醇，腐敗菌素B，翹孢菌素，恩鐮孢菌素，麥角生物堿毒素和諸如麥堿、麥角柯寧堿、麥角柯堿、麥角環(huán)肽、麥角新堿、麥角寧堿、麥角生堿、麥角胺、麥角纈氨酸、麥角醇、麥角酸的內(nèi)生菌以及相關(guān)的差向異構(gòu)體，產(chǎn)果鐮孢菌素+1，煙曲霉素，伏馬菌素，伏馬菌素Al、A2、BI和B2及B3，鐮刀菌烯酮-X，鐮孢紅素酮，鐮孢菌酸，鐮菌素，膠霉毒素，HT-2毒素，透明菌素，甘薯寧，島青霉毒素,酪青霉毒素(isofumigaclavine) A和B,側(cè)生赤霉素+1,線葉金雞菊甙，番茄菌肽+1，畸形素，麥芽米曲霉素，串珠鐮刀菌素，單乙酰氧基薦草鐮刀烯醇，麥考酚酸，新茄病鐮刀菌烯醇，雪腐鐮刀菌烯醇，NT-1毒素，NT-2毒素，赭曲霉素，卵孢霉素，草酸，雀裨麥角生物堿A和B，棒曲霉素，青霉酸，青霉震顫素，擬莖點(diǎn)霉毒素，PR-毒素，桿孢菌素E，異煙棒曲霉素A和B，紅色青霉毒素，瑰天精，黃梅精(rutoosulphin)，細(xì)皺青霉素，sambucynin+1，葡萄穗霉毒素，F(xiàn)、G、H雪腐鐮刀菌醇，西洛菌素，流涎素，葚孢菌素，丙曲霉素，苦馬豆素，T-1毒素，T-2毒素，細(xì)交鏈孢菌酮酸，三乙酰氧基薦草鐮刀菌烯二醇，單端孢霉烯族毒素，木霉素，單端孢菌素，trichoverrins, trichoverrols,色氨酸震顫素，粘液霉素，疣孢青霉原，輪枝孢菌素，紫紅紫素，紫黃素，綠垂毒素，渥曼青霉素，黃青霉素，yavanicin+Ι,玉米赤霉烯醇,玉米赤霉酮,玉米烯酮α、β ,玉米赤霉酮α、β ,赤霉醇以及它們的亞科和/或衍生物和/或軛合物。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，真菌毒素模板為0ΤΑ。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，真菌毒素模板為葚孢菌素或麥角生物堿。在一些實(shí)施方案中，赭曲霉素模板為N- (2-羥基-3，5- 二氯苯甲?；?-L-苯丙氨酸。在一些實(shí)施方案中，葚孢菌素模板為5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅。然而，本發(fā)明不限于這些赭曲霉素或葚孢菌素模板。實(shí)際上，可使用多種不同的模板，包括N-叔丁氧基羰基-2，3-二甲氧基苯胺、2，3_二甲氧基苯胺、3-羥基-6，7- 二甲氧基-2-吲哚酮-3-甲酸乙酯、6，7- 二甲氧基靛紅或6，7- 二甲氧基_1_甲基親紅。
[0010]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備分子印跡聚合物的方法，其包括:提供真菌毒素模板以及一種或多種單體和一種或多種交聯(lián)劑；以及在存在真菌毒素模板時(shí)允許一種或多種單體和一種或多種交聯(lián)劑聚合的條件下，使真菌毒素模板與一種或多種單體和一種或多種交聯(lián)劑接觸。在一些實(shí)施方案中，真菌毒素模板為N- (2-羥基-3，5- 二氯苯甲?；?-L-苯丙氨酸。在一些實(shí)施方案中，真菌毒素模板為5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅。本發(fā)明不限于所使用的真菌毒素模板。實(shí)際上，多種合成的分子能用作真菌毒素模板，其中所述合成的分子模擬天然真菌毒素的結(jié)構(gòu)、形狀和/或其它化學(xué)性質(zhì)中的一種或多種。類似地，本發(fā)明不限于所使用的單體類型。例如，多種單體對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員而言是已知的，并且包括但不限于2-乙烯基吡啶、2-羥基乙基甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸。類似地，本發(fā)明不限于所使用的交聯(lián)劑類型。例如，多種交聯(lián)劑對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員而言是已知的，并且包括但不限于乙二醇二甲基丙烯酸酯。在一些實(shí)施方案中，盡管可以使用較低(例如，50攝氏度、45攝氏度、40攝氏度、35攝氏度、30攝氏度或更低)和較高(例如，115攝氏度、120攝氏度、125攝氏度、130攝氏度或更高)的溫度，但在55攝氏度至110攝氏度的溫度下通過(guò)在有機(jī)溶劑中形成自由基而引發(fā)聚合。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)偶氮異丁腈(AIBN)的熱引發(fā)分解而形成自由基。本發(fā)明不受所使用的有機(jī)溶劑類型限制。在一些實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑為甲苯、環(huán)己烷、乙腈、聚乙烯醇(PVA)/水溶液以及甲苯、環(huán)己烷、乙腈和PVA/水溶液的兩種或更多種的混合物。在一些實(shí)施方案中，溫度為55攝氏度至75攝氏度。在一些實(shí)施方案中，在聚合一種或多種單體和一種或多種交聯(lián)劑之后，從分子印跡聚合物中去除真菌毒素模板。在一些實(shí)施方案中，將由溶液進(jìn)行的一次或多次洗滌用于從分子印跡聚合物中去除真菌毒素模板。本發(fā)明不受洗滌所使用的溶液類型的限制。在一些實(shí)施方案中，溶液為有機(jī)溶劑、緩沖液、水或其組合。本發(fā)明不受所使用的有機(jī)溶劑類型的限制。在一些實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑為乙醇、甲醇、乙腈、甲苯和/或其混合物。在一些實(shí)施方案中，緩沖液為通過(guò)使氫氧化鈉、檸檬酸、琥珀酸和醋酸反應(yīng)而制備的緩沖液。在一些實(shí)施方案中，水為去離子水。在一些實(shí)施方案中，在一次或多次洗滌之后，干燥分子印跡聚合物。在一些實(shí)施方案中，將分子印跡聚合物暴露于20攝氏度至90攝氏度(例如，60攝氏度至80攝氏度、75攝氏度至80攝氏度)以用于干燥分子印跡聚合物，盡管可使用更低或更高的溫度。
[0011]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從材料中螯合真菌毒素的方法，其包括提供包含真菌毒素的材料；以及在真菌毒素模板存在下通過(guò)聚合一種或多種單體和一種或多種交聯(lián)劑而生成分子印跡聚合物；以及在允許分子印跡聚合物結(jié)合真菌毒素的條件下使分子印跡聚合物與包含真菌毒素的材料接觸。本發(fā)明不受從材料中螯合的真菌毒素(例如，靶向分離)類型限制。實(shí)際上，多種真菌毒素可被螯合，其包括但不限于乙酰氧基薦草鐮刀菌烯二醇、乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、乙酰基雪腐鐮刀菌烯醇、乙酰基新茄病鐮刀菌烯醇，乙?；鵗-2毒素，黃曲霉毒素，黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2，黃曲霉震顫毒素，細(xì)交鏈孢酸，格鏈孢酚，焦曲二醇，焦曲酰胺，焦曲斯汀，燕麥鐮孢菌素+1，白僵菌素+2，bentenolide,brevianamide, 丁烯酸內(nèi)酯,麗赤殼菌素,毛殼球菌素,毛殼素,毛殼菌素,橘霉素,黃綠青霉素，可皆霉素，細(xì)胞松弛素，環(huán)匹阿尼酸，脫乙酰麗赤殼菌素，脫乙酰新茄病鐮刀菌烯醇，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇二醋酸酯，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇一醋酸酯，二乙酰氧基薦草鐮刀烯醇，腐敗菌素B，翹孢菌素,恩鐮孢菌素,麥角生物堿毒素和諸如麥堿、麥角柯寧堿、麥角柯堿、麥角環(huán)肽、麥角新堿、麥角寧堿、麥角生堿、麥角胺、麥角纈氨酸、麥角醇、麥角酸的內(nèi)生菌以及相關(guān)的差向異構(gòu)體，產(chǎn)果鐮孢菌素+1，煙曲霉素，伏馬菌素，伏馬菌素Al、A2、BI和B2及B3,鐮刀菌烯酮-X，鐮孢紅素酮，鐮孢菌酸，鐮菌素，膠霉毒素，HT-2毒素，透明菌素，甘薯寧，島青霉毒素，酪青霉毒素A和B，側(cè)生赤霉素+1，線葉金雞菊甙，番茄菌肽+1，畸形素，麥芽米曲霉素，串珠鐮刀菌素，單乙酰氧基薦草鐮刀烯醇，麥考酚酸，新茄病鐮刀菌烯醇，雪腐鐮刀菌烯醇，NT-1毒素，NT-2毒素，赭曲霉素，卵孢霉素，草酸，雀裨麥角生物堿A和B，棒曲霉素，青霉酸，青霉震顫素，擬莖點(diǎn)霉毒素，PR-毒素，桿孢菌素E,異煙棒曲霉素A和B,紅色青霉毒素，瑰天精，黃梅精，細(xì)皺青霉素，sambucynin+1，葡萄穗霉毒素F、G、H，雪腐鐮刀菌醇，西洛菌素，流涎素，葚孢菌素，丙曲霉素，苦馬豆素，T-1毒素，T-2毒素，細(xì)交鏈孢菌酮酸，三乙酰氧基薦草鐮刀菌烯二醇,單端孢霉烯族毒素，木霉素，單端孢菌素，trichoverrins,trichoverrols,色氨酸震顫素,粘液霉素，撫孢青霉原，輪枝孢菌素，紫紅紫素，紫黃素，綠垂毒素，渥曼青霉素，黃青霉素，yavanicin+Ι,玉米赤霉烯醇,玉米赤霉酮,玉米烯酮α、β，玉米赤霉酮α、β，赤霉醇以及它們的亞科和/或衍生物。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，從材料中分離的真菌毒素為赭曲霉素Α。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，真菌毒素為葚孢菌素。在一些實(shí)施方案中，包含真菌毒素的材料為飲料、食品、動(dòng)物飼料、藥物組合物、營(yíng)養(yǎng)品組合物、化妝品組合物、維持生命必需的物質(zhì)或其它材料。在一些實(shí)施方案中，維持生命必需的物質(zhì)為用于水產(chǎn)業(yè)的培養(yǎng)基和包含氧氣的氣體樣品。在一些實(shí)施方案中，不從包含真菌毒素的材料中分離與真菌毒素結(jié)合的分子印跡聚合物。在一些實(shí)施方案中，從材料中螯合真菌毒素的方法還包括從包含真菌毒素的材料中分離與真菌毒素結(jié)合的分子印跡聚合物。在一些實(shí)施方案中，分離包括從包含真菌毒素的材料中提取、濃縮和隔離與真菌毒素結(jié)合的分子印跡聚合物。在一些實(shí)施方案中，分離發(fā)生在色譜或分離柱或筒中。在一些實(shí)施方案中，在分離之后，通過(guò)洗滌從分子印跡聚合物中去除與分子印跡聚合物結(jié)合的真菌毒素。在一些實(shí)施方案中，在從分子印跡聚合物中去除后，定性和定量分析真菌毒素。在一些實(shí)施方案中，定量和定性分析用于溯源(例如，通過(guò)記載已記錄的標(biāo)識(shí)來(lái)辨認(rèn)和/或相互關(guān)聯(lián)項(xiàng)目的年表、位置和/或應(yīng)用(例如，所發(fā)現(xiàn)真菌毒素的位置、類型和量))。在一些實(shí)施方案中，將已經(jīng)去除真菌毒素的分子印跡聚合物再使用以從包含真菌毒素的材料中螯合真菌毒素。在一些實(shí)施方案中，分子印跡聚合物吸附比其重量大I至10倍(例如，大I至5倍，大I至2倍)的水。在一些實(shí)施方案中，使兩種或更多種不同的分子印跡聚合物與包含真菌毒素的材料接觸以從材料中螯合兩種或更多種特定的真菌毒素。
[0012]本發(fā)明還提供了用于合成N- (2-羥基-3，5- 二氯苯甲?；?-L-苯丙氨酸的方法，其包括將3-5 二氯水楊酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰氧基乙酰氧基_3，5- 二氯苯甲酸；將2-乙酰氧基乙酰氧基_3，5- 二氯苯甲酸轉(zhuǎn)化為2-乙酰氧基乙酰氧基_3，5- 二氯苯甲酰氯；使2-乙酰氧基乙酰氧基-3，5-二氯苯甲酰氯與L-苯丙氨酸乙酯反應(yīng)以形成Ν-(2-乙酰氧基-3，5-二氯苯甲酰基)-L-苯丙氨酸；以及將N- (2-乙酰氧基-3，5- 二氯苯甲?；?-L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為N-(2-羥基-3，5- 二氯苯甲酰基)-L-苯丙氨酸。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化包括水解N-(2-乙酰氧基-3，5- 二氯苯甲酰基)-L-苯丙氨酸中的酯官能。
[0013]本發(fā)明還提供了用于合成5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅的方法，其包括將2，
3-二甲氧基苯甲酸轉(zhuǎn)化為2, 3- 二甲氧基-N-叔丁氧基擬基苯胺；將2, 3- 二甲氧基-N-叔丁氧基羰基苯胺轉(zhuǎn)化為2，3-二甲氧基苯胺；使2，3-二甲氧基苯胺與酮基丙二酸二乙酯反應(yīng)以形成6，7_ 二甲氧基-3-羥基-3-(2-吲哚酮)-甲酸乙酯；將6，7_ 二甲氧基-3-羥基-3-(2-吲哚酮)-甲酸乙酯轉(zhuǎn)化為6，7-二甲氧基靛紅；將6，7-二甲氧基靛紅轉(zhuǎn)化為6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅；以及將6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅轉(zhuǎn)化為5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基親紅。
[0014]本發(fā)明還提供了合成對(duì)真菌毒素有特異性的分子印跡聚合物的方法，其包括生成能夠促進(jìn)MIP與真菌毒素結(jié)合的模板化合物；在包含非極性、非質(zhì)子溶劑的溶劑體系中，在包含MIP單體和交聯(lián)劑的反應(yīng)中結(jié)合模板化合物；以及通過(guò)選自將反應(yīng)物容器暴露于高溫或?qū)⒎磻?yīng)物容器暴露于UV照射的行為來(lái)促進(jìn)聚合。在一些實(shí)施方案中，真菌毒素包含赭曲霉素A，然而，本發(fā)明不受這樣的限制。實(shí)際上，根據(jù)本文的描述，能合成多種對(duì)真菌毒素有特異性的分子印跡聚合物，包括但不限于對(duì)下述有特異性的MIP:乙酰氧基薦草鐮刀菌烯二醇，乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，乙?；└牭毒┐?，乙酰基新茄病鐮刀菌烯醇，乙?；鵗-2毒素，黃曲霉毒素，黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2，黃曲霉震顫毒素，細(xì)交鏈孢酸，格鏈孢酚，焦曲二醇，焦曲酰胺，焦曲斯汀，燕麥鐮孢菌素+1，白僵菌素+2，bentenolide,brevianamide, 丁烯酸內(nèi)酯,麗赤殼菌素,毛殼球菌素,毛殼素,毛殼菌素,橘霉素,黃綠青霉素，可皆霉素，細(xì)胞松弛素，環(huán)匹阿尼酸，脫乙酰麗赤殼菌素，脫乙酰新茄病鐮刀菌烯醇，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇二醋酸酯，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇一醋酸酯，二乙酰氧基薦草鐮刀烯醇，腐敗菌素B，翹孢菌素,恩鐮孢菌素,麥角生物堿毒素和諸如麥堿、麥角柯寧堿、麥角柯堿、麥角環(huán)肽、麥角新堿、麥角寧堿、麥角生堿、麥角胺、麥角纈氨酸、麥角醇、麥角酸的內(nèi)生菌和相關(guān)的差向異構(gòu)體，產(chǎn)果鐮孢菌素+1、煙曲霉素、伏馬菌素、伏馬菌素Al、A2、BI和B2及B3,鐮刀菌烯酮-X，鐮孢紅素酮，鐮孢菌酸，鐮菌素，膠霉毒素，HT-2毒素，透明菌素，甘薯寧，島青霉毒素，酪青霉毒素A和B，側(cè)生赤霉素+1，線葉金雞菊甙，番茄菌肽+1，畸形素，麥芽米曲霉素，串珠鐮刀菌素，單乙酰氧基薦草鐮刀烯醇，麥考酚酸，新茄病鐮刀菌烯醇，雪腐鐮刀菌烯醇，NT-1毒素，NT-2毒素，赭曲霉素，卵孢霉素，草酸，雀裨麥角生物堿A和B，棒曲霉素，青霉酸，青霉震顫素，擬莖點(diǎn)霉毒素，PR-毒素，桿孢菌素E,異煙棒曲霉素A和B,紅色青霉毒素，瑰天精，黃梅精，細(xì)皺青霉素，sambucynin+Ι，葡萄穗霉毒素F、G、H，雪腐鐮刀菌醇，西洛菌素，流涎素，葚孢菌素，丙曲霉素，苦馬豆素，T-1毒素，T-2毒素，細(xì)交鏈孢菌酮酸，三乙酰氧基薦草鐮刀菌烯二醇,單端孢霉烯族毒素，木霉素，單端孢菌素，trichoverrins,trichoverrols,色氨酸震顫素,粘液霉素，撫孢青霉原，輪枝孢菌素，紫紅紫素，紫黃素，綠垂毒素，渥曼青霉素，黃青霉素，yavanicin+Ι,玉米赤霉烯醇,玉米赤霉酮,玉米烯酮α、β，玉米赤霉酮α、β，赤霉醇以及它們的亞科和/或衍生物。在一些實(shí)施方案中，模板包含N-(2-羥基-3，5- 二氯苯甲?；?-L-苯丙氨酸。在一些實(shí)施方案中，模板包含5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅。本發(fā)明不限于任何特殊的單體或交聯(lián)劑。實(shí)際上，可使用包括本文描述的那些的多種單體和交聯(lián)劑。在一些實(shí)施方案中，方法還包含洗滌所述分子印跡聚合物以去除模板。在一些實(shí)施方案中，洗滌包括使用溶液(例如，稀釋的堿溶液、稀釋的酸溶液或水)洗滌I次、2次、3次、4次或更多次以去除模板。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1不出赫曲霉素A和N-(3, 5_ 二氯_2_輕基苯甲酸基)-L-苯丙氨酸(0ΤΑ模板)。
[0016]圖2示出N-(3，5-二氯-2-羥基苯甲?；?-L-苯丙氨酸(0ΤΑ模板)合成途徑。
[0017]圖3示出在幾種比例的夾雜下OTA的MIP-OTA螯合功效。
[0018]圖4示出在X 15，000的放大率和3.0keV下在日立S-4300掃描電子顯微鏡上觀察到的MIP-OTA。
[0019]圖5示出對(duì)3種不同濃度的OTA的5種不同水平的夾雜的MIP (在甲苯-環(huán)己烷混合物中所合成的)螯合親合力。
[0020]圖6示出由苯乙烯和2-乙烯基吡啶作為功能單體制成并隨熱引發(fā)或低溫以及UV引發(fā)而聚合的MIP對(duì)OTA的螯合活性。報(bào)道了在檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.0)洗滌后和在100%甲醇洗滌后初始吸附和剩余吸附的數(shù)值。
[0021]圖1示出由苯乙烯和2-乙烯基吡啶為功能單體制成并隨低溫和UV引發(fā)而聚合的MIP對(duì)多酚和3-吲哚醋酸的螯合活性。報(bào)道了初始吸附值。
[0022]圖2示出涂覆有MIP-OTA的玻璃纖維網(wǎng)的照片，以及其在50mL離心管使用以在酒中用于OTA螯合。
[0023]圖9示出使用四種不同的聚合條件，涂覆在玻璃纖維網(wǎng)上并使用包含加入濃度為50ppb、10ppb、200ppb的OTA的白酒而測(cè)試的三種水平的MIP-OTA的螯合試驗(yàn)結(jié)果。
[0024]圖10出使用三種三元聚合條件，涂覆在玻璃纖維網(wǎng)上并在加入濃度為50ppb、100ppb、200ppb的OTA的白酒中進(jìn)行測(cè)試的三種水平的NIP的螯合試驗(yàn)結(jié)果。
[0025]圖11示出使用熒光檢測(cè)器記錄的OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖和用于最優(yōu)化真菌毒素保留時(shí)間的梯度選擇。
[0026]圖12示出葚孢菌素和葚孢菌素模板(5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅)的分子結(jié)構(gòu)。
[0027]圖13示出葚孢菌素模板合成途徑。
[0028]圖14示出在幾種比例的夾雜下，通過(guò)MIP-葚孢菌素和NIP對(duì)5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅模板的螯合功效。
[0029]圖15示出MIP和NIP的膠霉毒素的螯合活性以及在使用增加水平的甲醇進(jìn)行六次連續(xù)洗滌之后的相互作用的穩(wěn)定性/特異性，所述MIP和NIP使用熱引發(fā)或低溫/UV引發(fā)的聚合而合成。
[0030]圖16示出MIP和NIP的5_氯_6，7_ 二甲氧基_1_甲基靛紅模板的螯合活性以及在使用增加水平的甲醇進(jìn)行六次連續(xù)洗滌之后的相互作用的穩(wěn)定性/特異性，所述MIP和NIP使用熱引發(fā)或低溫/UV引發(fā)的聚合而合成。
[0031]定義
[0032]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分子印跡聚合物”或“MIP”是指選擇性結(jié)合特定化合物的合成聚合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在還稱為模板化合物的靶化合物存在下合成分子印跡聚合物，生成對(duì)特定靶化合物(例如，真菌毒素)具有高度親合力的MIP。通常，使用模擬天然靶標(biāo)(例如，天然真菌毒素)的結(jié)構(gòu)、形狀和/或其它化學(xué)性質(zhì)的模板(例如，合成構(gòu)造的分子/配體/模板(例如，合成的真菌毒素模板))和諸如單體和/或交聯(lián)劑的其它組分來(lái)構(gòu)造聚合物。例如，將模板化合物混入預(yù)聚混合物并使其與單體形成締合物。然后，使混合物適當(dāng)?shù)嘏c模板化合物聚合。一旦形成聚合物，就將模板化合物去除，留下對(duì)模板(或與模板類似的其它組合物(例如，天然真菌毒素))具有親合力的互補(bǔ)腔。將這樣的區(qū)域(例如，腔或其它區(qū)域)調(diào)整以結(jié)合待靶標(biāo)化合物，產(chǎn)生對(duì)這類化合物的高親合力。
[0033]值得注意的是，當(dāng)特定的靶標(biāo)化合物用于形成分子印跡聚合物時(shí)，聚合物可能對(duì)不同于但類似于靶標(biāo)化合物的一類化合物具有高親合力。例如，分子印跡聚合物可結(jié)合大量在形狀、電荷密度、幾何形狀或其它物理或化學(xué)性質(zhì)方面與模板化合物(例如，合成的真菌毒素模板)類似的化合物。
[0034]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“聚合物”是指由通常通過(guò)形成網(wǎng)絡(luò)的共價(jià)化學(xué)鍵連接的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元而形成的分子(大分子)。
[0035]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“模板化合物”或“靶化合物”是指通過(guò)隨后聚合的配體(例如，單體)而復(fù)合的化合物，其形成分子印跡聚合物。模板化合物包括有機(jī)化合物(例如，真菌毒素、多肽和蛋白質(zhì))以及無(wú)機(jī)化合物(例如，礦物和重金屬)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“真菌毒素模板”是指模擬天然真菌毒素(例如，赭曲霉毒素、葚孢菌素等)的結(jié)構(gòu)、形狀和/或其它化學(xué)特性的合成構(gòu)造的分子。本發(fā)明不受所使用的真菌毒素模板類型限制。實(shí)際上，可使用多種真菌毒素，包括但不限于黃曲霉毒素:黃曲霉毒素81、82、61、62、]?1、？1、01，丙曲霉素和亞科、黃曲霉毒醇；單端孢霉烯族毒素:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、二乙酰氧基薦草鐮刀烯醇、單乙酰氧基薦草鐮刀烯醇、薦草鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素、T-2四醇、鐮刀菌烯酮X、鐮菌素C、鐮孢菌酸、鐮孢紅素酮、黃色鐮刀菌素、層出鐮孢菌素、新茄病鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇以及代謝物和亞科；伏馬菌素:伏馬菌素Al、A2、B1、B2、B3和亞科；赭曲霉素:赭曲霉素Α、Β、α、β和代謝物；玉米烯酮、玉米赤霉烯醇α、β、玉米赤霉酮、赤霉醇α、β、赤霉醇和代謝物；棒曲霉素、膠霉毒素、麥考酚酸、串珠鐮刀菌素、環(huán)匹阿尼酸、橘霉素、白僵菌素、黃綠青霉素、細(xì)胞松弛素H ;青霉酸、PR-毒素、異煙棒曲霉素Α、B、紅色青霉毒素和亞科；麥角生物堿:麥角胺、棒麥角生物堿；酪青霉毒素Α、B ;雀裨麥角生物堿Α、B、黃曲霉震顫毒素、青霉震顫素和亞科；擬莖點(diǎn)霉毒素:擬莖點(diǎn)霉毒素A和亞科；粘液霉素Α、撫孢青霉原和亞科；葚孢菌素和亞科；流涎素、苦馬豆素、細(xì)交鏈孢菌酮酸、格鏈孢酚、渥曼青霉素及本文描述的其它真菌毒素。
[0036]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單體”是指可能變?yōu)榕c其它單體化學(xué)結(jié)合以形成聚合物的分子。
[0037]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“交聯(lián)”和“交聯(lián)劑”是指含有兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)能與兩個(gè)或多個(gè)單體連接以形成聚合物網(wǎng)絡(luò)的雙鍵的分子。
[0038]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)單元”是指聚合物鏈的構(gòu)建單元(building block)，并與重復(fù)單元相關(guān)。
[0039]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“陰離子的”或“陰離子”是指具有負(fù)電荷的離子。
[0040]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)離子的”或“陽(yáng)離子”是指具有正電荷的離子。該術(shù)語(yǔ)能指含有正電荷的聚合物，例如分子印跡聚合物。
[0041]如本文所用，本文使用的術(shù)語(yǔ)“酸”是指能供給質(zhì)子和/或接受電子的任何化合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“堿”是指能接受質(zhì)子和/或供給電子或氫氧根離子的任何化合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“鹽”是指可衍生自無(wú)機(jī)或有機(jī)酸和堿的化合物。
[0042]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“滲出”是指在MIP若干洗滌階段之后，仍與MIP締合并持續(xù)從MIP中解離以及干擾其吸附活性的模板剩余部分。
[0043]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“致孔的/致孔劑”是指用于改變聚合物上的腔(例如，MIP的腔)尺寸的物質(zhì)、分子、緩沖液、溶劑(例如，甲苯、二甲苯、乙苯)，而聚合物與致孔劑比直接與最終結(jié)構(gòu)的孔隙率的量有關(guān)。
[0044]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“孔隙率”是指能保持氣體或液體或允許其通過(guò)的材料中孔隙空間(例如，MIP腔)的量度。
[0045]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“聚合”是指使單體分子在化學(xué)反應(yīng)中一起反應(yīng)以形成三維網(wǎng)絡(luò)或聚合物鏈的過(guò)程。
[0046]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“沉淀”是指在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程期間在溶液中固體的形成。當(dāng)反應(yīng)發(fā)生時(shí)，將形成的固體稱為沉淀物，并將殘留在固體上的液體稱為上層清液。
[0047]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“離心”是指使用由旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子(其使物體圍繞固定軸旋轉(zhuǎn))產(chǎn)生的離心力、即施加垂直于軸的力來(lái)通過(guò)尺寸或密度而分離分子的過(guò)程。在將離心加速度用于將較大和較小密度的物質(zhì)均勻分配為不同密度層時(shí)，使用沉降原理運(yùn)行離心機(jī)。
[0048]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“濃度”是指每一確定空間的物質(zhì)量。通常，根據(jù)質(zhì)量每體積單位來(lái)表示濃度。為了稀釋溶液，必須加入更多的溶劑或減少溶質(zhì)的量(例如，通過(guò)選擇性分離、蒸發(fā)、噴霧干燥、冷凍干燥)。相比之下，為了濃縮溶液，必須減少溶劑的量。
[0049]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“層”是指通常在材料層次中排列有序的水平沉淀物，其形成在通過(guò)與材料密度性質(zhì)有關(guān)的離心或沉降分離之后而獲得的覆蓋(overlaying)部分或片段。
[0050]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“純化的”或“純化”是指從樣品中去除異質(zhì)組分。當(dāng)用于化學(xué)背景下時(shí)，“純化的”或“純化”是指從異質(zhì)、不期望或污染的物質(zhì)中物理分離目標(biāo)化學(xué)物質(zhì)。純化有機(jī)分子的常用方法包括但不限于下列:親和純化、機(jī)械過(guò)濾、離心、蒸發(fā)、雜質(zhì)提取、在其它組分不溶的溶劑中溶解、結(jié)晶、吸附、蒸餾、分餾、升華、熔化、精煉、電解和透析。
[0051]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“干燥”是指減少或消除物質(zhì)中的液體的任何種類的方法。
[0052]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“噴霧干燥”是指干燥包含液體的物質(zhì)的方法，其使用熱空氣以蒸發(fā)液體從而減少或消除物質(zhì)中的液體。換言之，通過(guò)噴霧或霧化進(jìn)入一股熱干燥空氣中而干燥物質(zhì)。
[0053]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“干燥自由流動(dòng)的粉末”是指自由流動(dòng)的干燥粉末。
[0054]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“研磨”是指通過(guò)壓縮、剪切或摩擦而減小粒徑。
[0055]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“洗滌”是指去除或清洗(例如，使用任何類型的溶質(zhì)(例如，蒸餾水、緩沖液或溶劑或混合物))雜質(zhì)或制劑的可溶性不期望組分(例如，可將MIP洗滌以從樣品中去除模板組分)。
[0056]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分析物”是指原子、分子、物質(zhì)或化學(xué)成分。通常，分析物本身不可檢測(cè)，而分析物的方面或性質(zhì)(物理、化學(xué)、生物學(xué)等)能使用諸如高效液相色譜(簡(jiǎn)寫為HPLC)的分析步驟進(jìn)行測(cè)定。例如，通常不檢測(cè)本身的“椅式構(gòu)象”(分析物組分)而檢測(cè)椅式構(gòu)象的高度、寬度等。類似地，通常不檢測(cè)真菌毒素而檢測(cè)真菌毒素的一種或多種性質(zhì)(例如，與其穩(wěn)定性、濃度或生物學(xué)活性相關(guān)的真菌毒素?zé)晒庑?。
[0057]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“樣品”用于包括來(lái)自任何來(lái)源的樣本(例如，合成的、生物學(xué)和環(huán)境樣品)的廣義。合成的樣品包括人工制備的任何材料(例如，MIP)。可從動(dòng)物(包括人類)獲得生物學(xué)樣品，并且其包含液體、固體、組織和氣體。生物學(xué)樣品包括血液產(chǎn)物，例如血漿、血清等。環(huán)境樣品包括諸如表面物質(zhì)、土壤、水、水晶和工業(yè)樣品的環(huán)境材料。
[0058]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“高效液相色譜”和術(shù)語(yǔ)“HPLC”是指分離化合物的液體色譜的一種形式。將化合物溶解在溶液中。通過(guò)將樣品混合物注射在柱上，溶劑或溶劑混合物通過(guò)所述柱流動(dòng)以從柱中洗脫混合物的組分來(lái)分離化合物。HPLC儀器包括流動(dòng)相儲(chǔ)存器、泵、注射器、分離柱和檢測(cè)器。通過(guò)定量檢測(cè)折射指數(shù)、在設(shè)置波長(zhǎng)處的UV-VIS吸收、在使用合適波長(zhǎng)激發(fā)后的熒光性或電化學(xué)響應(yīng)的變化來(lái)記錄柱流出物中分析物的存在。
[0059]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“信號(hào)”通常用于指示反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生(例如，抗體與抗原的結(jié)合)的任何可檢測(cè)方法。能定性以及定量評(píng)價(jià)信號(hào)?！靶盘?hào)”類型的實(shí)例包括但不限于輻射信號(hào)、熒光信號(hào)或比色產(chǎn)物/試劑信號(hào)。
[0060]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“掃描電子顯微鏡”和術(shù)語(yǔ)“SEM”是指一種類型的電子顯微鏡，其使用光柵掃描模式的高能電子束掃描樣品表面使其成像。電子與組成樣品的原子相互作用，產(chǎn)生包含與樣品表面分布狀況、組成和諸如導(dǎo)電性的其它性質(zhì)有關(guān)的信息的信號(hào)。
[0061]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“固定劑”是指能夠?qū)⒁环N物質(zhì)與另一種物質(zhì)固定以“固定”、穩(wěn)定或以其它方式保持物質(zhì)處于其目前形式從而防止物質(zhì)降解或發(fā)生其它形式的變化的化學(xué)物。通常，將固定劑用于掃描電子顯微鏡(SEM)以制備樣品。
[0062]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)”是指在活生物體內(nèi)進(jìn)行的研究和/或?qū)嶒?yàn)，其發(fā)生在生物有機(jī)體內(nèi)。
[0063]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“體外”是指活生物體外的人工環(huán)境并且是指通常在有機(jī)體內(nèi)發(fā)生但使其在人工環(huán)境中發(fā)生的生物過(guò)程或反應(yīng)。體外環(huán)境的實(shí)例包括試管和細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0064]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“原位”是指處于反應(yīng)混合物的狀態(tài)。
[0065]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“體外”是指在最小改變天然狀態(tài)的有機(jī)體外部的人工環(huán)境中，在活組織中或活組織上進(jìn)行的研究和/或?qū)嶒?yàn)和/或應(yīng)用。
[0066]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“吸收”是指材料“攝取”或“吸取”另一物質(zhì)所經(jīng)過(guò)的過(guò)程。例如，“吸收”可能是指通過(guò)擴(kuò)散或滲透來(lái)將物質(zhì)吸收或消化進(jìn)入細(xì)胞或穿過(guò)組織和器官的過(guò)程(例如，通過(guò)消化系統(tǒng)吸收營(yíng)養(yǎng)物或吸收藥物進(jìn)入血流中)。
[0067]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“吸附(adsorb) ”和“吸附(adsorbt1n) ”是指當(dāng)材料通過(guò)組合物(螯合劑和/或吸附劑)而螯合或累積(例如，在所述組合物的表面上)時(shí)發(fā)生的過(guò)程，或者是指組合物(例如，MIP)與樣品中的靶分子(例如，真菌毒素)結(jié)合的過(guò)程(例如，用于從樣品中去除靶分子)。
[0068]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“吸附作用”是指吸附和吸收二者。
[0069]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“螯合(sequester) ”和/或術(shù)語(yǔ)“螯合(sequestrat1n) ”是指兩種或更多種彼此接觸(例如，從而形成絡(luò)合物)的實(shí)體的物理締合(例如，通過(guò)鍵合(例如，氫鍵合、離子鍵合、共價(jià)鍵合或其它類型的鍵合)。締合的示例性形式包括但不限于氫鍵合、配位和離子對(duì)形成。螯合相互作用可包括依賴各個(gè)實(shí)體的立體化學(xué)和幾何形狀的大量化學(xué)相互作用(例如，化學(xué)鍵)(例如，進(jìn)一步定義螯合的特異性)。當(dāng)螯合兩種或更多種實(shí)體時(shí)，它們不但可通過(guò)化學(xué)鍵而螯合，還可通過(guò)電荷、偶極-偶極或其它類型的相互作用而鋪A
?φ π O
[0070]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“螯合劑(sequestrat1n agent)”和/或“螯合齊[J(sequestering agent) ”是指能夠與第二實(shí)體形成絡(luò)合物的實(shí)體。
[0071]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“絡(luò)合物”是指通過(guò)兩種或更多種單獨(dú)的實(shí)體間的締合而形成的實(shí)體(例如，其中實(shí)體為相同或不同(例如，相同或不同的化學(xué)類別)的兩種或更多種實(shí)體間的締合)。締合可以通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵(例如，通過(guò)范德華、靜電、電荷相互作用、疏水相互作用、偶極相互作用、和/或氫鍵結(jié)合力(例如，聚氨酯連接、酰胺連接、酯連接及其組合))。
[0072]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指足以實(shí)現(xiàn)有益或期望結(jié)果的組合物(例如，MIP)的量。有效量能被給予和/或與在一種或多種給藥、應(yīng)用或劑量中的另一材料混合，并且不旨在限于特定劑型或給藥途徑。
[0073]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”是指動(dòng)物界的那些。這包括但不限于家畜、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、家禽、寵物動(dòng)物、海洋和淡水動(dòng)物及野生動(dòng)物。
[0074]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“飼料”是指由個(gè)體(例如，人和/或動(dòng)物個(gè)體(例如，其向個(gè)體飲食貢獻(xiàn)能量和/或營(yíng)養(yǎng)物))消耗的材料。飼料的實(shí)例包括但不限于乳制品、果汁、谷物、水果、蔬菜、肉、全混合日糧(TMR)、飼料、顆粒飼料、濃縮物、預(yù)混合料、副產(chǎn)物、谷物、酒糟、糖漿、纖維、粗飼料、草、干草、麥粒、葉片、膳食、可溶物和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給物。
[0075]如本文所用，“消化系統(tǒng)”是指其中消化能夠發(fā)生或發(fā)生的系統(tǒng)(包括胃腸系統(tǒng))。
[0076]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“消化(digest)”或“消化(digest1n)”是指食物、飼料或其它有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為可吸收形式；是指通過(guò)熱和水分或化學(xué)作用軟化、分解或分解(breakdown)。
[0077]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物利用度”是指對(duì)有機(jī)體有效或?qū)崿F(xiàn)全身循環(huán)的分子或組分的部分。當(dāng)靜脈注射給予分子或組分時(shí)，其生物利用度為100%。然而，當(dāng)通過(guò)其它途徑(諸如口服)給予分子或組分時(shí)，其生物利用度降低(由于不完全吸收和首過(guò)代謝)。
[0078]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“給藥”和術(shù)語(yǔ)“給予”是指給予包括藥物、前藥或其它試劑的物質(zhì)的行為，或給予個(gè)體(例如，個(gè)體或體內(nèi)、體外、或體外細(xì)胞、組織和器官)治療處理的行為。給藥的示例性途徑能為通過(guò)眼睛(眼給藥)、嘴(口服給藥)、皮膚(局部給藥或經(jīng)皮給藥)、鼻子(鼻腔給藥)、肺(吸入給藥)、口腔黏膜(頰給藥)、耳、直腸、陰道、通過(guò)注射(例如，靜脈注射、皮下注射、瘤內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射等)等。
[0079]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“共同給藥”和術(shù)語(yǔ)“共同給予”是指對(duì)個(gè)體和/或材料(例如，飼料)給予至少兩種試劑或治療。兩種或更多種試劑或治療的共同給藥能同時(shí)發(fā)生，或能在第二試劑/治療之前給予第一試劑/治療。
[0080]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”是指改善和/或逆轉(zhuǎn)疾病的跡象或癥狀(例如，霉菌中毒)。術(shù)語(yǔ)“治療”是指療法治療和預(yù)防劑或預(yù)防性檢測(cè)。例如，可能從使用本發(fā)明的組合物和方法的治療中受益的個(gè)體包括已經(jīng)患有疾病和/或病癥(例如，霉菌中毒)以及其中疾病和/或病癥被預(yù)防(例如，使用本發(fā)明的預(yù)防劑治療)的那些。
[0081]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“真菌毒素”是指由各種真菌種制備的有毒和/或致癌化合物。
[0082]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“霉菌中毒”是指真菌毒素通過(guò)人或動(dòng)物體的阻擋屏障的疾病狀態(tài)。能將霉菌中毒視為感染或疾病并可能對(duì)受其折磨的那些具有有毒影響。
[0083]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“疾病”、“感染”和“病理學(xué)疾病狀態(tài)或反應(yīng)”是指與正常狀態(tài)的存活個(gè)體(例如，人和/或動(dòng)物)或任何其器官或組織的損傷(中斷或改變正常功能性能)有關(guān)的狀態(tài)、跡象和/或癥狀，并可對(duì)環(huán)境因素(例如包括霉菌中毒的營(yíng)養(yǎng)不良、工業(yè)危害或氣候)、特定的傳染試劑(例如蠕蟲、變形蟲、細(xì)菌、病毒、朊病毒等)進(jìn)行反應(yīng)或?qū)τ袡C(jī)體的固有缺陷(例如各種基因異常現(xiàn)象)進(jìn)行反應(yīng)或?qū)@些的組合及其它因素進(jìn)行反應(yīng)。
[0084]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“處于疾病的危險(xiǎn)”是指傾向于經(jīng)歷特殊疾病的個(gè)體。該傾向可為遺傳性的(例如，經(jīng)歷諸如可遺傳病癥的疾病的特殊遺傳傾向)或由其它因素(例如，年齡、體重、環(huán)境條件、暴露于有害化合物(例如，環(huán)境中存在的化合物，等))產(chǎn)生。
[0085]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“患有疾病”是指經(jīng)歷特殊疾病的個(gè)體(例如，動(dòng)物或人個(gè)體)并且不限于任何特殊的跡象或癥狀或疾病。
[0086]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有毒的”是指與在接觸或給藥毒素/有毒物之前的相同細(xì)胞或組織相比，對(duì)個(gè)體、細(xì)胞或組織的任何不利、有毒、有害或其它負(fù)面影響。
[0087]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”是指活性劑與惰性或活性載體的組合(例如，包含MIP的組合物)，所述載體使組合物尤其適于體外、體內(nèi)或間接體內(nèi)診斷或治療用途。
[0088]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的”和術(shù)語(yǔ)“藥理學(xué)可接受的”是指與已知有利反應(yīng)相比基本上不產(chǎn)生更多的已知不利反應(yīng)的組合物。
[0089]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“溯源”是指檢測(cè)結(jié)果或標(biāo)準(zhǔn)值的性質(zhì)，由此其能通過(guò)完整的比較鏈而與通常為國(guó)內(nèi)或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定參考相關(guān)聯(lián)，所有均具有規(guī)定的不確定性。其為化學(xué)檢測(cè)的一般計(jì)量學(xué)概念的實(shí)際應(yīng)用并還提供了術(shù)語(yǔ)、概念和策略以確保分析化學(xué)檢測(cè)是可比較的。其以可檢測(cè)的方式檢測(cè)唯一可識(shí)別的實(shí)體。在其它事物之中，通過(guò)記錄可記錄的標(biāo)識(shí)，追溯檢測(cè)可用于關(guān)聯(lián)項(xiàng)目的年表、位置和/或應(yīng)用。

【具體實(shí)施方式】
[0090]各種真菌群產(chǎn)生對(duì)動(dòng)物健康具有有毒影響的真菌毒素。在有利于其形成流行的條件時(shí)，主要通過(guò)曲霉菌(Aspergillus)、鐮刀菌(Fusarium)和青霉菌(Penicillium)的真菌屬產(chǎn)生這些毒素。世界上沒(méi)有區(qū)域逃脫真菌毒素及其對(duì)動(dòng)物和人健康的負(fù)面影響。真菌毒素污染對(duì)谷物供應(yīng)和動(dòng)物生產(chǎn)率的負(fù)面影響是巨大的，并且對(duì)人健康的危險(xiǎn)始終存在。溫暖氣候傾向于感染黃曲霉毒素和伏馬菌素，而具有較高濕度的寒冷地區(qū)遭受赭曲霉素、葚孢菌素、玉米烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素和二乙酰氧基薦草鐮刀烯醇。
[0091]真菌毒素為通過(guò)霉和真菌污染的谷物以及飼料、水果、飼料和食物產(chǎn)品以及環(huán)境(例如，通過(guò)氣霧劑獲得的霉菌中毒的土壤、水和空氣等)產(chǎn)生的次生代謝物。真菌毒素對(duì)人和動(dòng)物健康具有危險(xiǎn)的作用。由于真菌毒素在整個(gè)食物鏈存在，因此真菌毒素受到限制過(guò)度污染的飼料/食物材料的條例影響以及受到基于不同組毒素的毒理學(xué)性質(zhì)的環(huán)境影響(參見(jiàn)例如，Commiss1n Recommendat1n of 17 August 2006 on the presence ofdeoxynivalenol,zearalenone,ochratoxin A,T-2 and HT-2 and fumonisins in productsintended for animalfeeding(2006年8月17日對(duì)旨在用于動(dòng)物飼料的產(chǎn)品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米烯酮、赭曲霉素A、T-2和HT-2以及伏馬菌素的委員會(huì)建議)，歐盟官方公報(bào)(2006/576/EC))。在該方面，全球不同的安全機(jī)構(gòu)建立了污染水平的極限值和對(duì)其測(cè)試的控制步驟。這些條例在國(guó)家和/或大洲間還未達(dá)成一致并還傾向于所考慮的地理區(qū)域的政治和經(jīng)濟(jì)狀態(tài)。在可利用的情況下，條例以與由模板狀況上的真菌毒素結(jié)晶形式而產(chǎn)生的急性中毒情況相關(guān)的大量報(bào)道為基礎(chǔ)。作為真菌毒素進(jìn)化的一種理解，慢性暴露水平的影響、暴露的持續(xù)時(shí)間和不同真菌毒素自然污染的飼料/食物材料的共同出現(xiàn)以及能施加協(xié)同毒性作用的環(huán)境可能對(duì)動(dòng)物和人的健康狀態(tài)及其對(duì)各種其它感染的敏感性以及因此的免疫狀態(tài)發(fā)揮重要作用。從這個(gè)角度而言，需要考慮的解決方案為處理進(jìn)入食物鏈并在環(huán)境中存在的非調(diào)節(jié)水平的有毒化合物。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用于制備去除真菌毒素用的高親合力、合成吸附劑的經(jīng)濟(jì)、大規(guī)模方法(例如，所述真菌毒素包括但不限于大類或小類真菌毒素分子的整個(gè)族，其包括黃曲霉毒素:黃曲霉毒素B1、B2、GU G2、Ml、PU Q1、丙曲霉素和亞科、黃曲霉毒醇；單端孢霉烯族毒素:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、二乙酰氧基薦草鐮刀烯醇、單乙酰氧基薦草鐮刀烯醇、薦草鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素、T-2四醇、鐮刀菌烯酮X、鐮菌素C、鐮孢菌酸、鐮孢紅素酮、黃色鐮刀菌素、層出鐮孢菌素、新茄病鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇以及代謝物和亞科；伏馬菌素:伏馬菌素々132、81、82、83和亞科；赭曲霉素:赭曲霉素Α、Β、α、β和代謝物；玉米烯酮、玉米赤霉烯醇α、β、玉米赤霉酮、赤霉醇α、β、赤霉醇和代謝物；棒曲霉素、膠霉毒素、麥考酚酸、串珠鐮刀菌素、環(huán)匹阿尼酸、橘霉素、白僵菌素、黃綠青霉素、細(xì)胞松弛素H ;青霉酸、PR-毒素、異煙棒曲霉素Α、B、紅色青霉毒素和亞科；麥角生物堿:麥角胺、棒麥角生物堿；酪青霉毒素Α、Β ;雀裨麥角生物堿Α、B、黃曲霉震顫毒素、青霉震顫素和亞科；擬莖點(diǎn)霉毒素:擬莖點(diǎn)霉毒素A和亞科；粘液霉素Α、疣孢青霉原和亞科；葚孢菌素和亞科；流涎素、苦馬豆素、細(xì)交鏈孢菌酮酸、格鏈孢酚和渥曼青霉素)。
[0092]赫曲霉素A (簡(jiǎn)與為0ΤΑ)為王要通過(guò)在其它霉囷物種之中的赫曲霉(Aspergillusochraceus)和青霉菌(Penicillium verrucosum)制備的真菌毒素代謝物，所述霉菌能生長(zhǎng)于不適當(dāng)儲(chǔ)存的食物產(chǎn)品(參見(jiàn)例如，Pfohl-Leszkowicz A.和Manderville R.A.,2007.Molecular Nutrit1n and Food Research (分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)和食物研究)，51:61-99)、污染的谷物、咖啡豆(參見(jiàn)例如，O’BrienE.和 DietrichD.R.2005.Critical Reviews inToxicology (毒理學(xué)重要綜述)，35:33-60)、葡萄酒(參見(jiàn)例如,Blesa J., Soriano J.M.,Molto J.C.,Matles J-，2006.Critical Review in Food Science and Nutrit1n (食物科學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)的重要綜述)，46 =473-478)，并可能被轉(zhuǎn)移并污染人所消耗的液體和固體(例如，葡萄汁、酒、啤酒、咖啡、可可提取物以及食品和飼料，其使用了污染的谷物和肉及來(lái)自消耗污染的谷物或以其它方式暴露于真菌毒素的動(dòng)物的其它副產(chǎn)物(例如，牛奶、蛋等))，能對(duì)人有害的OTA是致癌(組2B ;參見(jiàn)例如，Clark H.A.和Snedeker S.M，2006.Journalof Toxicology and Environmental Health, Part B:Critical Reviews (毒理學(xué)和環(huán)境健康期刊，部分B:重要評(píng)述)，9:265-96)、對(duì)腎臟有害的化合物并能導(dǎo)致免疫抑制(參見(jiàn)例如，Al-Anati L.和 Petzinger E., 2006.Journal of Veterinary Pharmocology andTherapeutics (獸醫(yī)藥理學(xué)和治療期刊)，29:79-90 ;Pfohl_Leszkowicz 和 Manderville,2007，如前所引用；0’Brien和Dietrich, 2005，如前所引用)。OTA能誘導(dǎo)豬的腎功能變化，包括改變尿排出，并增加葡萄糖排泄物進(jìn)入尿，其已經(jīng)表征為豬的腎病。使用含有OTA的谷物飼養(yǎng)的雞、火雞和鴨子具有較差的飼料轉(zhuǎn)化并減少蛋生產(chǎn)率。在人類中，將OTA病理學(xué)臨床描述為巴爾干地方性腎病(參見(jiàn)例如，Vrabcheva T., Petkova-Bocharova T., GrossoF., Nikolov 1., Chernozemsky 1.N., Castegnaro M.和 Dragacci S.,2004.Journal ofAgricultural and Food Chemistry (農(nóng)業(yè)和食品化學(xué)期刊)，52:2404-2410)。動(dòng)物研究表明由于其與苯丙氨酸相似，因此在其在胃腸道水平下吸收之后，OTA能進(jìn)入肝腸循環(huán)并結(jié)合血液中的白蛋白部分，因此在動(dòng)物組織中存留延長(zhǎng)的時(shí)間(參見(jiàn)例如，Creppy E.E.，kaneA., Dirheimer G., Lafarge-Frayssinet C., Mousset S.和 Frayssinet C.,1985.Toxicology Letters (毒理學(xué)快報(bào))，28:29_35)。
[0093]另一類真菌毒素，即包括膠霉毒素、透明菌素、西洛菌素、毛殼菌素、毛殼素、輪枝孢菌素、線葉金雞菊甙、翹孢菌素和葚孢菌素的表聚硫代哌嗪二酮特別受關(guān)注。通常對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)率具有較高經(jīng)濟(jì)影響的后者在世界的特定區(qū)域中發(fā)現(xiàn)，最初在新西蘭田園農(nóng)業(yè)中發(fā)現(xiàn)(參見(jiàn)例如，Hohenboken ff.D.，Morris C.A.，Munday R., De Nicolo G., Amyes N.C.，Towers N.R.和 Phua S.H., 2004.New Zealand journal of Agricultural Research (農(nóng)業(yè)研究新西蘭期刊)，47:119-127)，但還在葡萄牙的亞速爾群島中報(bào)道過(guò)。葚孢菌素是由寄生于某些牧場(chǎng)的紙皮司霉(Pithomyces chartarum)合成的疏水分子。毒性由二硫化物橋的存在而誘導(dǎo)，其能通過(guò)與巰基的反應(yīng)使蛋白質(zhì)失活并產(chǎn)生活性氧氣物質(zhì)(過(guò)氧化物基團(tuán)、過(guò)氧化氫、羥基基團(tuán))。該病理學(xué)更被稱為面部濕疹、由膽管上皮細(xì)胞的破壞而產(chǎn)生的肝原光敏作用，其導(dǎo)致葉紅素(葉綠素代謝物)在循環(huán)的血液中累積并從陽(yáng)光中吸收能量，并特別影響羊、牛、馬和鹿。臨床癥狀包括牛奶產(chǎn)量降低、體重減輕、光敏化以及死亡(參見(jiàn)例如，Munday R.，1982.Chemico-B1logical Interact1ns (化學(xué)生物學(xué)相互作用),41:361-374)。除暴露于飼料、食物、牧場(chǎng)和液體中的真菌毒素之外，動(dòng)物和人與真菌毒素接觸并能以其它方式受真菌毒素影響。例如，動(dòng)物能在其草墊中與真菌毒素接觸，魚能在其水環(huán)境中與真菌毒素接觸，且其它有機(jī)材料能受真菌毒素影響。
[0094]真菌毒素污染是不可避免的，并且為降低真菌毒素的負(fù)面影響，歷史上將以吸附性能聞名的諸如粘土、膨潤(rùn)土和硅鋁酸鹽或活性炭的無(wú)機(jī)物質(zhì)用于農(nóng)業(yè)(例如，與動(dòng)物飼料和/或密封形式或過(guò)濾器設(shè)備形式的成分混合)。粘土用于大量螯合液體中(例如，動(dòng)物和/或人的胃腸道中)的某些真菌毒素并最小化其有毒影響(參見(jiàn)例如，Ramos A.J.和Hernandez E., 1997.Animal Feed Science and Technology (動(dòng)物飼料科學(xué)和技術(shù))，65:197-206 ；Grant P.G.和 Phillips T.D.,1998.Journal ofAgricultural and FoodChemistry (農(nóng)業(yè)和食物化學(xué)期刊)，46:599-605)。然而，粘土阻礙諸如維生素、礦物和氨基酸在內(nèi)的對(duì)動(dòng)物和人重要的多種有益營(yíng)養(yǎng)物的吸收，從而減少飲食的營(yíng)養(yǎng)物密度。此外，粘土是惰性物質(zhì)，其必須大量使用(例如，喂養(yǎng)動(dòng)物)以具有有益影響(例如，減少真菌毒素污染)。然而，當(dāng)粘土從動(dòng)物中排泄出時(shí)，以大量喂養(yǎng)動(dòng)物的粘土能對(duì)環(huán)境具有負(fù)面影響。也能使用對(duì)特定的真菌毒素缺乏特異性的其它廣譜真菌毒素吸附劑，包括在第6，045，834號(hào)美國(guó)專利中描述的發(fā)明。
[0095]通常，分子印跡聚合物(簡(jiǎn)寫為MIP)是在分子存在下形成的聚合物，即隨后提取的模板，因此留下互補(bǔ)腔。這些聚合物對(duì)原始分子表現(xiàn)出特定的化學(xué)親合力并能用于制造感應(yīng)器、催化或用于分離方法。最早的印跡材料為硅酸鈉類。在1949年，這些材料的第一次實(shí)驗(yàn)用途是用于分離染料(參見(jiàn)例如，Andersson H.S.和Nicholls LA.,2001.1n:Molecularly Imprinted Polymers:Man_made mimics of antibodies and theirapplicat1n in analytical chemistry (分子印跡聚合物:抗體的人造模擬及其在分析化學(xué)中的應(yīng)用)，(Sellergen B.編輯)，Techniques and Instrumentat1n in AnalyticalChemistry (分析化學(xué)中的技術(shù)和儀器)，Vol.23Elsevier, Amsterdam, Netherlands,pp.1-19)。
[0096]本發(fā)明一般涉及分子印跡聚合物(MIP)。特別地，本發(fā)明涉及可再用、生態(tài)友好的MIP,制備所述MIP的方法以及使用所述MIP的方法(例如，螯合和/或吸附靶化合物(例如，真菌毒素))，以及以不同方式應(yīng)用所述用途的方法(例如，為溯源目的的檢測(cè)真菌毒素的存在以及從污染源中去除真菌毒素)。本發(fā)明的組合物和方法用于多種應(yīng)用，其包括飲食，治療，預(yù)防劑、食品和飲料加工和制造、液體過(guò)濾以及研究和質(zhì)量控制應(yīng)用。
[0097]因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了影響MIP對(duì)靶標(biāo)化合物(例如，真菌毒素)的高吸附能力和選擇性的模板化合物(例如，在其上合成MIP)。模板化合物可從MIP合成后的MIP中去除(例如，由此“激活"MIP并使其與靶化合物(例如，真菌毒素)結(jié)合并吸附該靶化合物(例如，真菌毒素))。因此，本發(fā)明提供了允許大規(guī)模生產(chǎn)模板和MIP的方法(例如，合成方法)和材料，其不僅是經(jīng)濟(jì)的(例如，能夠?qū)崿F(xiàn)以經(jīng)濟(jì)上可行的方式大規(guī)模生產(chǎn))，而且使用比歷史上使用的MIP模板更容易獲得的試劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了生物中性(例如，不是環(huán)境有害的)的組合物(例如，模板化合物、單體、交聯(lián)劑以及MIP)。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的單體和交聯(lián)劑能夠形成與模板具有高親合力、可逆的絡(luò)合物(例如，與模板的官能團(tuán))，從而制備對(duì)靶化合物(例如，真菌毒素)具有高親合力并且對(duì)環(huán)境提供正面影響的MIP (例如，高的水吸附性質(zhì)，由此MIP吸附比其重量大高達(dá)10倍的水從而通過(guò)保留水來(lái)有益于土壤水合作用)。類似地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)可再用(例如，能從靶化合物中分離并再使用)靶化合物(例如，真菌毒素)具有高親合力的MIP。
[0098]1.用于合成分子印跡聚合物(MIP)的模板
[0099]用于MIP合成的一般方案包括在MIP網(wǎng)絡(luò)內(nèi)控制結(jié)合部位形成的模板分子的存在下，單體的聚合和交聯(lián)步驟。將幾何學(xué)特異性給予MIP結(jié)合部位，所用步驟類似于在美術(shù)學(xué)的脫蠟鑄造法過(guò)程中使用蠟塑復(fù)制品制備模具。在形成MIP網(wǎng)絡(luò)后，去除模板使得無(wú)模板的MIP可用于螯合靶化合物。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)一系列洗滌步驟(例如，使用在下面第IV部分描述的那些)實(shí)現(xiàn)模板的去除。
[0100]在一些實(shí)施方案中，將靶化合物用作模板。然而，這增加了模板滲出或逐漸浸出殘留模板進(jìn)入樣品中的潛在問(wèn)題。在分析應(yīng)用中，模板滲出導(dǎo)致不正常的高背景，而在非分析應(yīng)用(例如，螯合)中，模板滲出能通過(guò)實(shí)際上將靶分子引入樣品中而混淆螯合結(jié)果。此外，例如當(dāng)合成控制具有有毒和/或致癌性質(zhì)的靶標(biāo)(例如，真菌毒素)的MIP時(shí)，從人身安全以及最小化有害廢物的觀點(diǎn)出發(fā)，可能期望在MIP合成過(guò)程中使用危害較小的模板分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，模板分子為無(wú)害的和/或容易降解，因此并不代表健康或環(huán)境危險(xiǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)從MIP中釋放的模板為可再用的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與能被生產(chǎn)的真菌毒素相比，能以更大量和更安全的模式生產(chǎn)模板。
[0101]因此，在一些實(shí)施方案中，用于MIP合成的模板可為與期望的靶化合物相同的化合物。在一些實(shí)施方案中，用于MIP合成的模板可與期望的靶化合物不同。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，期望的靶化合物為真菌毒素。真菌毒素的實(shí)例包括但不限于黃曲霉毒素:黃曲霉毒素B1、B2、Gl、G2、Ml、Pl、Ql、丙曲霉素和亞科、黃曲霉毒醇；單％5抱霉紐族毒素:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、二乙酰氧基薦草鐮刀烯醇、單乙酰氧基薦草鐮刀烯醇、薦草鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素、T-2四醇、鐮刀菌烯酮X、鐮菌素C、鐮孢菌酸、鐮孢紅素酮、黃色鐮刀菌素、層出鐮孢菌素、新茄病鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇和代謝物和亞科以及軛合物；伏馬菌素:伏馬菌素A1、A2、B1、B2、B3和亞科以及軛合物；赭曲霉素:赭曲霉素Α、Β、α、β和代謝物；玉米烯酮、玉米赤霉烯醇、α和β -玉米赤霉酮、玉米赤霉烯醇(zearalanol)、α和赤霉醇和代謝物以及軛合物；棒曲霉素、麥考酚酸、串珠鐮刀菌素、環(huán)匹阿尼酸、橘霉素、白僵菌素、黃綠青霉素、細(xì)胞松弛素H ;膠霉毒素、葚孢菌素、透明菌素、西洛菌素、毛殼菌素、毛殼素、輪枝孢菌素、線葉金雞菊甙、翹孢菌素和亞科；青霉酸、PR-毒素、異煙棒曲霉素A、B、紅色青霉毒素和亞科；麥角生物堿:麥角胺、麥角環(huán)肽、麥角纈氨酸、麥角柯堿、麥角新堿、麥角生堿、麥角寧堿、麥角柯寧堿、麥堿、麥角醇、麥角酸和差向異構(gòu)體、棒麥角生物堿；酪青霉毒素A、B ;雀裨麥角生物堿A、B、黃曲霉震顫毒素、青霉震顫素和亞科；擬莖點(diǎn)霉毒素:擬莖點(diǎn)霉毒素A和亞科；粘液霉素A、撫孢青霉原和亞科；流涎素、苦馬豆素、細(xì)交鏈孢菌酮酸、格鏈孢酚和渥曼青霉素。在某些實(shí)施方案中，靶化合物為OTA、葚孢菌素、麥角生物堿。
[0102]在一些實(shí)施方案中，通過(guò)靶分子的仔細(xì)的結(jié)構(gòu)分析、結(jié)構(gòu)最小化以及測(cè)定對(duì)有效的MIP結(jié)合部位形成至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)特征和官能團(tuán)來(lái)進(jìn)行非靶模板化合物的設(shè)計(jì)和/或測(cè)定。結(jié)構(gòu)最小化的方法在本領(lǐng)域是已知的(參見(jiàn)例如，Baggiani C., Giraudi G.和VanniA.，2002.B1conjugat1n (生物偶聯(lián)技術(shù))，10:389-394 ;以其整體內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)。當(dāng)本發(fā)明不限于任何特殊機(jī)制并且機(jī)制的理解不必實(shí)踐于本發(fā)明時(shí)，在模板設(shè)計(jì)過(guò)程中考慮的結(jié)構(gòu)因素包括但不限于手性、平面性、消除對(duì)分子不期望性質(zhì)反應(yīng)的結(jié)構(gòu)(例如，消除毒性的分子決定因素)和/或存在合適的模板分子的溶劑可達(dá)表面、靜電勢(shì)表面和/或親脂性-親水性表面及其與單體和交聯(lián)劑潛在的相互作用以及模板合成的簡(jiǎn)單性。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)用超快形狀識(shí)別技術(shù)已能夠?qū)崿F(xiàn)與分子最緊密相似的化合物的常規(guī)篩選，這不僅根據(jù)較好的二維結(jié)構(gòu)識(shí)別而且優(yōu)選根據(jù)常用識(shí)別模式(即三維分子形狀)中的一種(參見(jiàn)例如，Balletser P.和 Richards ff.G., 2007.Proceedings of the RoyalSociety A !Mathematical,Physical and Engineering Sciences (皇家學(xué)會(huì)會(huì)手艮 A:數(shù)學(xué)、物理和工程科學(xué)),463:1307-1321。
[0103]在一個(gè)非限制性實(shí)例中，如圖1所示，用于赭曲霉素A的模板為N-(2_羥基-3，5- 二氯苯甲?；?-L-苯丙氨酸。
[0104]在N-(2-羥基-3，5- 二氯苯甲酰基)-L-苯丙氨酸的合成方法的一個(gè)非限制性實(shí)例中，合成從3，5- 二氯水楊酸與醋酸酐的反應(yīng)開始以獲得2-乙酰氧基-3，5- 二氯苯甲酸，其反過(guò)來(lái)通過(guò)草酰氯的作用轉(zhuǎn)化為酸性氯化物。然后，在三乙胺的存在下，2-乙酰氧基-3，5-二氯苯甲酰氯與苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽原位反應(yīng)以生成N-(2-乙酰氧基-3，5-二氯苯甲?；?-L-苯丙氨酸的乙酯。合成方法的最后步驟引入N-(2-乙酰氧基-3，5- 二氯苯甲酰基)-L-苯丙氨酸乙酯的兩個(gè)酯官能的新的且高度特異性水解以獲得OTA模板，N-(2-羥基-3，5-二氯苯甲?；?-L-苯丙氨酸(I)的產(chǎn)率為98%。該合成反應(yīng)在圖2中概述。
[0105]因此，本發(fā)明提供了用于以經(jīng)濟(jì)可實(shí)現(xiàn)的方式合成可擴(kuò)展至大質(zhì)量模板(例如，OTA模板)的方法和材料。
[0106]I1.用于聚合MIP的單體和交聯(lián)劑
[0107]用于合成MIP的單體的選擇考慮了模板分子的結(jié)構(gòu)特征以評(píng)價(jià)哪個(gè)單體或單體組合最可能形成與模板的相互作用(例如，共價(jià)、非共價(jià)、離子、氫鍵、疏水相互作用、范德華相互作用)。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，本文描述的OTA模板(I)(例如，N-(2_羥基-3，5-二氯苯甲?；?-L-苯丙氨酸)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征包括(i)兩個(gè)酸性官能團(tuán)(-0H和-CO2H)；(?) 一個(gè)強(qiáng)極性肽基團(tuán)(-NHC0-)以及模板結(jié)構(gòu)的若干低極性的烴片段(例如，其各自具有與單體和交聯(lián)劑分子形成絡(luò)合物的電勢(shì))。以其整體內(nèi)容通過(guò)引用并入本文的第10/181435號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)描述了 MIP功能單體和計(jì)算單體選擇的方法(參見(jiàn)例如，Baggiani等人，2002.如前所引用)。
[0108]單體和特定單體(例如，在本發(fā)明的MIP合成方法中使用的)的種類包括但不限于下列種類及其衍生物其:丙烯酸和衍生物(例如，2-溴丙烯酸、丙烯酰氯、N-丙烯?；野彼幔琋-丙烯?；量┩橥?、反式-2-(3-吡啶基)-丙烯酸)、丙烯酸酯(例如，烷基丙烯酸酯、烯丙基丙烯酸酯、羥丙基丙烯酸酯)、甲基丙烯酸和衍生物(例如，衣康酸、2_(三氟甲基)丙烯酸)、甲基丙烯酸酯(例如，甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥基乙酯、甲基丙烯酸2-羥基乙酯、甲基丙烯酸3-磺丙酯鈉鹽、單甲基丙烯酸乙二醇酯)、苯乙烯(例如，(2，3和4)-氨基苯乙烯、苯乙烯-4-磺酸、3-硝基苯乙烯、4-乙基苯乙烯)、乙烯基(例如，氯甲酸乙烯酯、4-乙烯基苯甲酸、4-乙烯基苯甲醛、乙烯基咪唑、4-乙烯基苯酚、4-乙烯基胺、丙烯醛)、乙烯基吡啶(例如，(2，3和/或4)-乙烯基吡唆、3-丁烷1，2_二醇)、硼酸(例如，4-乙烯基硼酸)、磺酸(例如，4-乙烯基磺酸、丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙烷-磺酸)、金屬螯合劑(例如，苯乙烯亞氨基二乙酸)、丙烯酰胺和衍生物(例如，N-甲基丙烯酰胺)、甲基丙烯酰胺和衍生物(例如，N, N- 二甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺)、烯烴(例如，4-戊烯酸、3-氯-1-苯基-1-丙烯)、(甲基)丙烯酸酐和衍生物(例如，甲基丙烯酸酐)、含硅的單體(例如，(3-甲基丙烯酰氧基丙基)三甲氧基硅烷、四甲基二硅氧烷)、多烯(例如，異戊二烯、3-羥基-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯)、疊氮化物(例如，
4-疊氮基-2，3，5，6-四氟苯甲酸)、硫醇(例如，烯丙基硫醇)。丙烯酸酯終端的或其它不飽和聚氨酯、碳酸酯和環(huán)氧樹脂也能用于本發(fā)明的實(shí)施方案，如同硅類單體也能用于本發(fā)明的實(shí)施方案。
[0109]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于合成對(duì)OTA的模板(即N-(2-羥基-3，5- 二氯苯甲酰基)-L-苯丙氨酸)進(jìn)行控制的MIP的單體和交聯(lián)劑包括2-乙烯基吡啶、2-羥基乙基甲基丙烯酸酯和/或乙二醇二甲基丙烯酸酯。當(dāng)本發(fā)明不局限于任何特殊機(jī)制并且機(jī)制的理解不必實(shí)踐于本發(fā)明時(shí)，2-乙烯基吡啶與模板的酸基團(tuán)形成離子鍵，并在緊密接近吡啶環(huán)的堿性氮原子中包含乙烯基鍵。模板和2-乙烯基吡啶之間的該相互作用促進(jìn)在非常接近模板分子的附近處形成聚合物，并且在MIP中實(shí)現(xiàn)MIP和OTA之間的緊密連接(例如，在去除模板化合物后并使MIP與靶OTA分子相互作用)。當(dāng)本發(fā)明不局限于任何特殊機(jī)制并且機(jī)制的理解不必實(shí)踐于本發(fā)明時(shí)，2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯單體的羥基與模板的高極性肽鍵形成另外的氫鍵。另外的試劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯。當(dāng)本發(fā)明不局限于任何特殊機(jī)制并且機(jī)制的理解不必實(shí)踐于本發(fā)明時(shí)，二甲基丙烯酸乙二醇酯在一些實(shí)施方案中用作交聯(lián)劑(參見(jiàn)下文)，作為與在OTA模板分子中存在的低極性基團(tuán)相互作用的不飽和二酯。在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)地或與其它類型的單體組合使用各個(gè)類型的單體。
[0110]若使用，則交聯(lián)劑或試劑優(yōu)選為一種或若干種聚合或低聚化合物，或在特定條件下提供裂解的化合物。向主體聚合物提供硬度的交聯(lián)劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，并且包括但不限于二、三、四和五官能丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、含乙烯基樹脂、含烯丙基樹脂和苯乙烯。交聯(lián)劑的特定實(shí)例包括但不限于對(duì)-二乙烯基苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯(簡(jiǎn)寫為EGDMA)、二甲基丙烯酸四亞甲基酯(簡(jiǎn)寫為TDMA)、N，N’_亞甲基雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)寫為MDAA)、N，N’ -1，3-亞苯基雙(2-甲基-2-丙烯酰胺)(TOBMP)、2，6-雙丙烯?；０坊拎?、1，4_ 二丙烯?；哙?簡(jiǎn)寫為DAP)、1，4_亞苯基二丙烯酰胺和N，O-雙丙烯?；?L-苯基氨基丙醇?？赡?、可裂解的交聯(lián)劑的實(shí)例包括但不限于N，N’ -雙-(丙烯?；?胱胺、N，N-二烯丙基酒石酸二酰胺、N，N-(l，2-二羥基亞乙基)二丙烯酰胺、N1-((E)-1-(4-乙烯基苯基)亞甲基)_4_乙烯基苯胺、烯丙基二硫化物和雙(2-甲基丙烯酰氧基乙基))二硫化物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將二甲基丙烯酸乙二醇酯用作交聯(lián)劑。盡管優(yōu)選的交聯(lián)單體為二甲基丙烯酸乙二醇酯，但本發(fā)明的實(shí)施方案不局限于該試劑，并且可使用其它交聯(lián)單體，例如二乙烯基苯和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(簡(jiǎn)寫為TRM)。
[0111]能使用可提供適當(dāng)完整性的MIP結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單單體與交聯(lián)劑的任何比例，例如，能用于最終的應(yīng)用背景(例如，在食品或飼料產(chǎn)品中，意圖用于水產(chǎn)業(yè)用途的水中、體內(nèi)等)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能選擇合適比例的單體以提供期望的結(jié)構(gòu)完整性，其與靶分子的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)以及所用模板的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。
[0112]在有待在體內(nèi)使用聚合或低聚化合物的情況下(例如，作為治療或診斷，或作為動(dòng)物飼料或人食品的可消耗的螯合組分)，選擇無(wú)毒并表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)穩(wěn)定性和溶解度的單體是至關(guān)重要的。優(yōu)選的實(shí)例包括但不限于丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯?；蛘?，可在聚合后處理聚合物以增強(qiáng)模板溶解度，例如通過(guò)與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)試劑反應(yīng)。
[0113]可使用包括游離自由基、陽(yáng)離子和陰離子聚合在內(nèi)的不同聚合方法。在本文選擇并提供聚合條件，其對(duì)化合物的活性構(gòu)象不產(chǎn)生不利地影響，對(duì)此可制備補(bǔ)充性聚合物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用游離基沉淀聚合方法(參見(jiàn)下文第III部分)。
[0114]此外，MIP的聚合通常通過(guò)加入引發(fā)劑而開始。引發(fā)劑包括但不限于偶氮雙異丁腈(簡(jiǎn)稱為AIBN)、偶氮雙二甲基戊腈(簡(jiǎn)寫為ABDV)、苯偶酰的二甲基乙縮醛、苯甲?；^(guò)氧化物(簡(jiǎn)寫為ΒΡ0)和4，4’_偶氮(4-氰基戊酸)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，引發(fā)劑為偶氮雙異丁腈。
[0115]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，單體、交聯(lián)劑和/或MIP具有諸如減少的毒性或無(wú)毒性以及高水吸附和滯留的有利安全性和/或環(huán)境性質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，MIP能可再用并能為經(jīng)濟(jì)上可實(shí)現(xiàn)/可生產(chǎn)的。
[0116]II1.用于合成MIP的溶劑
[0117]進(jìn)行聚合反應(yīng)的溶劑/溶劑混合物的選擇對(duì)MIP與其靶化合物的結(jié)合親合力的范圍、選擇性和特異性具有顯著影響。當(dāng)本發(fā)明不局限于任何特殊機(jī)制并且機(jī)制的理解不必實(shí)踐于本發(fā)明時(shí)，通過(guò)表現(xiàn)出下列性質(zhì)的致孔溶劑或溶劑混合物促進(jìn)或提供孔隙率:其溶解在單體混合物中，對(duì)聚合反應(yīng)呈惰性并且不溶解所產(chǎn)生的聚合物(MIP)。合適的致孔溶劑包括但不限于:諸如甲苯、二甲苯、乙苯和二乙苯的芳族烴類；諸如環(huán)己烷的非極性溶劑；諸如己烷、庚烷、辛烷和癸烷的飽和烴類；諸如異丙醇和異戊醇的醇類；諸如二氯甲烷、二氯乙烷和三氯乙烷的脂肪族鹵代烴類；諸如醋酸乙酯、醋酸丁酯、鄰苯二甲酸二甲酯的脂肪族或芳族酯類。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用芳族烴類溶劑。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，單獨(dú)使用甲苯。在一些實(shí)施方案中，使用甲苯與另一溶劑的混合物。在一些實(shí)施方案中，將甲苯與環(huán)己烷組合而使用。能單獨(dú)地或以兩種或更多種的組合使用致孔溶劑?；趩误w總量，加入的致孔溶劑的量能從約10%質(zhì)量比變化至500%質(zhì)量比。當(dāng)本發(fā)明不局限于任何特殊機(jī)制并且機(jī)制的理解不必實(shí)踐于本發(fā)明時(shí)，極性溶劑(例如，水、乙腈)破壞單體和模板間的緊密絡(luò)合，從而降低MIP對(duì)靶分子結(jié)合的特異性(例如，如在甲苯中，等)。
[0118]用作MIP合成用培養(yǎng)基的溶劑或溶劑混合物還對(duì)MIP的膨脹性質(zhì)以及三維MIP網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的孔徑具有影響。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)期望增加MIP膨脹和增加MIP孔徑時(shí)，將諸如乙腈的極性溶劑用作用于MIP聚合的溶劑或共溶劑；或者，當(dāng)不期望增加MIP膨脹和增加MIP孔徑時(shí)(例如，當(dāng)MIP旨在用于色譜柱時(shí)，其中膨脹可能妨礙流速并干擾分析物的洗脫以及HPLC儀器的運(yùn)行能力)，避免這類溶劑。
[0119]溶劑體系的合理選擇可直接影響MIP孔徑。在非限制性實(shí)例中，在針對(duì)OTA模板的MIP的合成過(guò)程中，在類似環(huán)己烷和/或甲苯的低極性溶劑中形成最小顆粒(1-20μπι)，而在類似乙腈或水的極性溶劑中形成更大和更小的尺寸均勻(10-170 μ m)的顆粒。此外，在高濃度的單體下，聚合反應(yīng)生成大的MIP簇，其容易通過(guò)研磨而分散，不產(chǎn)生在MIP塊的研磨過(guò)程中所出現(xiàn)的非常細(xì)的顆粒(參見(jiàn)在下面第IV部分中的詳細(xì)討論)。非常細(xì)的顆粒在一些應(yīng)用中可能為不期望的，例如在MIP旨在用作柱樹脂(其中細(xì)顆?？赡芊恋K流速)，或當(dāng)存在細(xì)顆粒時(shí)在離心或過(guò)濾過(guò)程中妨礙或使MIP的收集復(fù)雜化，或在過(guò)濾的情況下干擾MIP的適當(dāng)限制，因此如果過(guò)濾器應(yīng)維持所包含的MIP的量，則其受包含MIP的特定篩網(wǎng)過(guò)濾器孔徑的影響?？珊Y分已分散的MIP簇以提供所定義的均勻尺寸的產(chǎn)物。因此，可選擇聚合溶劑、單體濃度和物理處理方法的選擇以導(dǎo)致具有期望孔徑和粒度的MIP的最佳產(chǎn)率，同時(shí)避免細(xì)顆粒的形成。
[0120]溶劑體系的選擇表明在聚合過(guò)程中形成的MIP的物理形式。例如，如上所述，在稱為沉淀聚合的過(guò)程中，一些溶劑體系(包括但不限于諸如環(huán)己烷和/或甲苯的低極性溶齊U)產(chǎn)生固體MIP簇。其它溶劑體系(包括但不限于諸如聚乙烯醇水溶液的極性溶劑)促進(jìn)稱為乳液聚合的動(dòng)力學(xué)顯著過(guò)程(Vivaldo-Lima E.，Wood P.E.，Hamielec A.E.，1997.1ndustrial and Engineering Chemistry Research (工業(yè)和工程化學(xué)研究)，36:939-965)。通常，聚合的性質(zhì)影響MIP網(wǎng)絡(luò)的物理形式和其可被進(jìn)一步加工的難易度二者(例如，研磨的需要、粒度的均勻性、產(chǎn)率、緩沖液或溶劑交換的容易度、穩(wěn)定性)。在Yan
H.和 Ho Row K.,2006.1nternat1nal Journal of Molecular Science (分子科學(xué)的國(guó)際期刊)，7 =155-178中評(píng)論了聚合過(guò)程，其以其整體內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用沉淀聚合。在某些實(shí)施方案中，沉淀聚合導(dǎo)致以均勻粉末和易控粒度的形式而形成的MIP產(chǎn)品。相比之下，包括但不限于本體聚合的其它聚合方法可產(chǎn)生MIP的大塊，在進(jìn)一步加工或使用之前必須將其壓碎，并導(dǎo)致不規(guī)則的粒度，因此具有較差性能。
[0121]IV.在MIP合成和MIP的物理加工后從MIP中去除模板的方法
[0122]用于從新合成的MIP中分離模板的技術(shù)通常由模板-MIP相互作用的性質(zhì)而確定。例如，當(dāng)在模板和MIP網(wǎng)絡(luò)間形成共價(jià)鍵時(shí)，需要從MIP中化學(xué)裂解模板。相比之下，當(dāng)模板和MIP網(wǎng)絡(luò)間的相互作用為非共價(jià)時(shí)，溶劑提取可足以去除模板(參見(jiàn)例如，Yan H.和Ho Row K.，2006，如前所引用，并以其整體內(nèi)容通過(guò)引用并入本文；SellergrenB., 2001.The non-covalent approach to molecular imprinting (分子印跡的非共價(jià)方法).In:Molecularly Imprinted Polymers:Man-made mimics of antibodies and theirapplicat1n in analytical chemistry (分子印跡聚合物:抗體的人造模擬及其在分析化學(xué)中的應(yīng)用)，(Sellergen B.編輯)，Techniques and Instrumentat1n in AnalyticalChemistry (分析化學(xué)中的技術(shù)和儀器)，第 23 卷，Elsevier, Amsterdam, Netherlands,PP.113-184)。MIP的合成后加工還稱為MIP激活。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，MIP激活的第一步包括傾析，然后在稍微降低的壓力下從MIP材料中蒸發(fā)(循環(huán))溶劑(例如，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)系統(tǒng))。第二步包括研磨MIP顆粒以產(chǎn)生較小粒徑(例如，使用研缽和研棒或碾磨設(shè)備)。第三步包括多次洗滌MIP顆粒，例如，使用0.2w/v%的氫氧化鈉。在合成OTA MIP的實(shí)施方案中，可跟蹤整個(gè)洗滌過(guò)程直至使用FeCl3溶液獲得負(fù)測(cè)試以檢測(cè)模板(參見(jiàn)實(shí)施例2至實(shí)施例4)。在一些實(shí)施方案中,洗使用I %的醋酸滌一次并使用水洗滌一次,隨后干燥最終的MIP產(chǎn)物(例如，在80°C的干燥烘箱中6-8小時(shí))直至去除所有溶劑痕跡。最后，可篩選MIP顆粒以提供規(guī)定粒度的產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在使用之前，物理形式的MIP不需要大量研磨，例如，MIP不形成需要破碎或研磨而分散的整塊。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，大多數(shù)MIP形成經(jīng)干燥而形成粉末的球體。
[0123]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟足以從MIP網(wǎng)絡(luò)中去除至少95%的模板分子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟足以從MIP網(wǎng)絡(luò)中去除至少99%的模板分子。在大多數(shù)優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗滌步驟足以從MIP網(wǎng)絡(luò)中去除至少99.9%的模板分子。
[0124]V.MIP組合物的應(yīng)用
[0125]本發(fā)明的組合物和方法用于包括飲食、治療、預(yù)防劑、食品和飲料加工及制造以及研究和質(zhì)量控制應(yīng)用在內(nèi)的多種應(yīng)用。例如，在一些實(shí)施方案中，將合成的模板(例如，使用本文描述的方法而生成的)用于MIP合成。本發(fā)明不限于任何特定的合成模板和/或合成的MIP。實(shí)際上，能生成和使用多種合成模板，其包括但不限于OTA模板(例如，N-(3，
5-二氯-2-羥基苯甲?；?-L-苯丙氨酸，參見(jiàn)實(shí)施例1)、黃曲霉毒素模板、單端孢酶烯模板(例如，倍半萜烯醇模板(例如，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)模板))、玉米烯酮模板、葚孢菌素模板、丙曲霉素模板、伏馬菌素模板、棒曲霉素模板、橘霉素模板和/或與麥角菌相關(guān)的內(nèi)生菌模板。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物和方法以制備包含類似于真菌毒素的外部官能團(tuán)的合成模板(例如，用于MIP OTA合成)(例如，其中在本發(fā)明的方法中模板用于產(chǎn)生MIP并隨后從其中去除，MIP對(duì)于由外部官能團(tuán)而相似的真菌毒素顯示出高親合力)，其中所述真菌毒素選自乙酰氧基薦草鐮刀菌烯二醇，乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，乙?；└牭毒┐?，乙酰基新茄病鐮刀菌烯醇，乙?；鵗-2毒素，擴(kuò)展至所有黃曲霉毒素，黃曲霉毒素B1、B2、Gl和G2，黃曲霉震顫毒素，細(xì)交鏈孢酸，格鏈孢酚，焦曲二醇，焦曲酰胺，焦曲斯汀，燕麥鐮孢菌素+1，白僵菌素+2, bentenolide, brevianamide, 丁烯酸內(nèi)酯，麗赤殼菌素，毛殼球菌素，毛殼素，毛殼菌素，橘霉素，黃綠青霉素，可皆霉素，細(xì)胞松弛素，環(huán)匹阿尼酸，脫乙酰麗赤殼菌素，脫乙酰新茄病鐮刀菌烯醇，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇二醋酸酯，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇一醋酸酯，二乙酰氧基薦草鐮刀烯醇，腐敗菌素B，翹孢菌素，恩鐮孢菌素，擴(kuò)展至所有麥角生物堿毒素和諸如麥堿、麥角柯寧堿、麥角柯堿、麥角環(huán)肽、麥角新堿、麥角寧堿、麥角生堿、麥角胺、麥角纈氨酸、麥角醇、麥角酸的內(nèi)生菌以及相關(guān)的差向異構(gòu)體，產(chǎn)果鐮孢菌素+1，煙曲霉素，伏馬菌素，伏馬菌素Al，A2，BI和B2及B3，鐮刀菌烯酮-X，鐮孢紅素酮，鐮孢菌酸，鐮菌素，膠霉毒素，HT-2毒素，透明菌素，甘薯寧，島青霉毒素，酪青霉毒素A和B，側(cè)生赤霉素+1，線葉金雞菊甙，番茄菌肽+1，畸形素，麥芽米曲霉素，串珠鐮刀菌素，單乙酰氧基薦草鐮刀烯醇，麥考酚酸，新茄病鐮刀菌烯醇，雪腐鐮刀菌烯醇，NT-1毒素，NT-2毒素，延伸至所有赭曲霉素，卵孢霉素，草酸，雀裨麥角生物堿A和B，棒曲霉素，青霉酸，青霉震顫素，擬莖點(diǎn)霉毒素，PR-毒素，桿孢菌素E,異煙棒曲霉素A和B,紅色青霉毒素，瑰天精，黃梅精，細(xì)皺青霉素，sambucynin+1，葡萄穗霉毒素F、G、H，雪腐鐮刀菌醇，西洛菌素，流涎素，葚孢菌素，丙曲霉素，苦馬豆素，T-1毒素，T-2毒素，細(xì)交鏈孢菌酮酸，延伸至所有單端孢霉烯族毒素的三乙酰氧基薦草鐮刀菌烯二醇，木霉素，單端孢菌素，trichoverrins, trichoverrols,色氨酸震顫素,粘液霉素,撫孢青霉原,輪枝孢菌素,紫紅紫素，紫黃素，綠垂毒素，渥曼青霉素，黃青霉素，yavanicin+Ι，玉米赤霉烯醇，玉米赤霉酮，玉米烯酮α、β，玉米赤霉酮α、β，赤霉醇和亞科和/或其衍生物和/或軛合物。在某些實(shí)施方案中，靶化合物為ΟΤΑ、葚孢菌素或麥角生物堿。
[0126]類似地，能生成和使用多種ΜΙΡ，包括但不限于使用上述合成模板中的任一種或任何其它有機(jī)分子作為模板(例如，諸如維生素的營(yíng)養(yǎng)物、藥物、抗生素、污染物、荷爾蒙、酶、蛋白質(zhì)等)而生成的ΜΙΡ。
[0127]本文描述的MIP用于多種應(yīng)用。例如,在一些實(shí)施方案中,MIP用于純化液體。例如，在一些實(shí)施方案中，MIP用于從液體中選擇性去除靶化合物(例如，一種或多種真菌毒素)。本發(fā)明不受從液體中去除的靶化合物(例如，一種或多種真菌毒素)的限制。實(shí)際上，可去除包括但不限于本文描述的真菌毒素的多種靶化合物。類似地，本發(fā)明不受從中去除靶化合物的液體類型的限制。實(shí)際上，多種不同的液體溶液能具有一種或多種從其中去除的靶化合物(例如，真菌毒素)(例如，通過(guò)向溶液給予一種或多種不同類型的MIP)，其包括但不限于飲料(例如，人類所消耗的(例如，果汁、酒(例如，白酒、紅酒等)、水、啤酒、茶、咖啡等))、水(例如，在水產(chǎn)業(yè)、引用水等中所使用的)、用于食品(例如，人類、動(dòng)物的食品)生產(chǎn)的液體、生物流體(例如，血液、瘤胃液、胃液等)等。
[0128]例如，在一些實(shí)施方案中，本文描述的組合物和方法提供了從液體中選擇性去除靶化合物(例如，真菌毒素)的ΜΙΡ。液體能為飲料、水、生物樣品、引用水供給、血液、瘤胃液或包含靶化合物的其它類型的液體。此外，能從其它類型的液體中去除靶化合物。在一些實(shí)施方案中，使本文描述的MIP與液體接觸(例如，與液體混合)充足的時(shí)間，以使MIP與靶化合物(例如，真菌毒素)相互作用并與靶化合物(例如，真菌毒素)結(jié)合。盡管機(jī)制的理解不必實(shí)踐于本發(fā)明并且本發(fā)明不受任何特殊機(jī)制的限制，但在一些實(shí)施方案中，在使液體與MIP相互作用后，在MIP中包含的絡(luò)合/結(jié)合腔(例如，在從MIP中去除模板分子后殘留的腔)經(jīng)接觸而與靶化合物結(jié)合，從液體中有效去除靶化合物。然后，能將液體進(jìn)一步處理、包裝或準(zhǔn)備進(jìn)行消耗(例如，用于人類消耗、用于動(dòng)物消耗或用于動(dòng)物棲息地)。在一些實(shí)施方案中，本文生成和/或提供的MIP具有承受與去除/螯合過(guò)程相關(guān)的物理和化學(xué)力的堅(jiān)硬結(jié)構(gòu)。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本文提供的MIP選擇性結(jié)合靶化合物，從而從物質(zhì)(例如，液體、固體表面、生物流體(例如，血液、瘤胃液等)、維持生命的必要物(例如，空氣或水產(chǎn)業(yè)介質(zhì))等)中去除靶化合物，并當(dāng)從物質(zhì)中收集和/或去除MIP-靶化合物絡(luò)合物時(shí)維持與靶化合物的關(guān)系(例如，泵送液體通過(guò)過(guò)濾器、傾倒液體通過(guò)過(guò)濾器、將過(guò)濾器浸入液體、在容器表面上涂覆ΜΙΡ、離心、在過(guò)濾器表面上涂覆ΜΙΡ、動(dòng)物糞便排泄，等)。
[0129]在一個(gè)實(shí)施方案中，從液體中去除靶化合物的方法是高選擇性的。例如，液體可包含大量靶化合物，其中MIP僅選擇性去除一種特定的靶化合物(例如，真菌毒素)，其中“一種”是指靶化合物的類型而不是去除的靶化合物的數(shù)量。在一些實(shí)施方案中，將多個(gè)MIP(例如，多個(gè)不同群體的MIP (例如，其中一個(gè)群體的MIP對(duì)一種類型的真菌毒素(例如，赭曲霉素)有特異性而第二群體的MIP對(duì)第二類型的真菌毒素(例如，黃曲霉毒素)有特異性)給予液體并使其相互作用充足的時(shí)間以從液體中選擇性去除多個(gè)不同類型的靶化合物(例如，真菌毒素)。本發(fā)明不受不同類型的MIP的數(shù)量限制，將所述MIP給予至包含多個(gè)不同類型的靶化合物(例如，真菌毒素)的液體。在一些實(shí)施方案中，液體包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多種不同類型的靶化合物(例如，真菌毒素)，在使MIP與靶化合物接觸并螯合靶化合物的條件下，將包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多種不同類型的10?的組合物給予至液體，所述組合物對(duì)多個(gè)靶化合物中的一種具有特異性。在一些實(shí)施方案中，MIP對(duì)單一的靶分子/化合物表現(xiàn)出特定的親合力。在一些實(shí)施方案中，MIP對(duì)一組具有常見(jiàn)化學(xué)或物理性質(zhì)的分子表現(xiàn)出特定的親合力。在一些實(shí)施方案中，MIP具有多個(gè)用于不同靶化合物的不同絡(luò)合/結(jié)合腔，以便當(dāng)處理MIP時(shí)在使用多個(gè)靶分子/化合物之后，MIP能夠選擇性結(jié)合多個(gè)靶化合物。
[0130]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從包含多個(gè)不同類型的靶化合物(例如，真菌毒素或其它有機(jī)分子靶分子/化合物(例如，諸如維生素的營(yíng)養(yǎng)物、藥物、抗生素、污染物、荷爾蒙、酶、蛋白質(zhì)等))的液體中去除靶化合物的方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括設(shè)計(jì)為與不同靶化合物結(jié)合的一組不同類型的MIP。例如，在一些實(shí)施方案中，提供液體樣品，其中進(jìn)行檢驗(yàn)以識(shí)別液體樣品中一種或多種靶化合物的存在。能檢測(cè)特定真菌毒素的存在以確定存在哪種真菌毒素。經(jīng)識(shí)別液體樣品中存在的一種或多種類型的靶化合物(例如，其中液體樣品代表了從中采集樣品的液體的特性)，生成(例如，根據(jù)本文描述的方法)和/或結(jié)合一種或多種MIP，然后將一種或多種MIP給予至液體溶液以去除靶化合物。在一些實(shí)施方案中，一種或多種類型的靶化合物的識(shí)別包括使用包含一種或多種對(duì)靶化合物有特異性的MIP的柱和/或過(guò)濾器。在一些實(shí)施方案中，一旦MIP用于從樣品(例如,液體樣品)中去除靶化合物，則從MIP中去除靶化合物并將MIP再使用。在一些實(shí)施方案中，以適當(dāng)?shù)姆绞教幚鞰IP。例如，能通過(guò)使用合適的溶劑和/或溶液進(jìn)行洗滌來(lái)從MIP中去除靶標(biāo)化合物(例如，為使MIP可再用)，所述溶劑和/或溶液能從所述方法所用的溶劑中選擇以在合成反應(yīng)后從模板中分離MIP，并物理處理MIP (例如，包括但不限于乙腈、甲苯、甲醇、氫氧化鈉、醋酸等)等。然后將回收的MIP再度使用。
[0131]從液體中去除靶化合物的方法由于MIP的選擇性質(zhì)，因而能產(chǎn)生高的回收率。在一些實(shí)施方案中，去除方法回收約25%至約99%的在液體中存在的靶化合物。在一些實(shí)施方案中，去除方法回收約35%至約99%的在液體中存在的靶化合物。在一些實(shí)施方案中，去除方法回收約50%至約99%的在液體中存在的靶化合物。在一些實(shí)施方案中，去除方法回收約75%至約99%的在液體中存在的靶化合物。在其它實(shí)施方案中，去除方法將生成的液體的靶化合物濃度降低至十億分率(PPb)的水平(例如，降低至適用于人和/或動(dòng)物消耗的濃度)。如在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的現(xiàn)有和推薦的調(diào)節(jié)方案中所獲悉的，能調(diào)節(jié)去除方法以提供特定的濃度水平。在一些實(shí)施方案中，在具有特定pH水平的液體上使用去除方法。例如，能對(duì)具有約I至13的pH的液體使用本發(fā)明的組合物和方法。
[0132]在一些實(shí)施方案中，MIP用于從表面去除靶化合物。例如，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了用于減少表面上存在的靶化合物(例如，真菌毒素)的方法，其包括使表面與包含MIP的組合物接觸。在特定實(shí)施方案中，將接觸進(jìn)行足夠的時(shí)間以使MIP結(jié)合和/或螯合靶化合物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了凈化包含靶化合物的環(huán)境表面的方法。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，靶化合物與環(huán)境表面締合并且所述方法包括使環(huán)境表面與足以凈化表面的組合物(例如，包含MIP)接觸。當(dāng)期望這樣時(shí)，凈化不需要導(dǎo)致靶化合物的全部消除。在一些實(shí)施方案中，組合物(例如，包含MIP的組合物)和方法還包括染料、顏料以及其它標(biāo)記和識(shí)別化合物，從而確保處理的表面已被本發(fā)明的組合物充分處理。
[0133]在一些實(shí)施方案中，MIP用于防止靶化合物與表面或其它化合物(例如，土壤)接觸。例如，本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括制備組合物的方法，由此將MIP與其它材料(例如，塑料或淀粉型產(chǎn)物)結(jié)合并應(yīng)用于植物(例如，生長(zhǎng)的農(nóng)業(yè)植物)以在生長(zhǎng)過(guò)程中使植物免受表面化合物(例如，真菌毒素)，并且進(jìn)一步防止化合物污染其它化合物(例如，土壤)。
[0134]在某些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的組合物治療(例如，外部或內(nèi)部治療)個(gè)體(例如，人或動(dòng)物)的表面(例如，外表面或內(nèi)表面)。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)口服、鼻、頰、直腸、陰道或局部給藥進(jìn)行接觸。當(dāng)以藥物形式給予本組合物時(shí)，期望的是組合物還包含藥物可接受的輔劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑等。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了還包含另外的藥物可接受的生物活性分子(例如，抗體、抗生素、用于核酸轉(zhuǎn)柒的裝置、維生素、礦物、輔因子、能夠結(jié)合和/或螯合真菌毒素的因子(例如，酵母細(xì)胞壁提取物(例如，與粘土材料結(jié)合的酵母細(xì)胞壁提取物和/或包含粘土和/或粘土顆粒的酵母細(xì)胞壁提取物，所述粘土顆粒融入和/或交織進(jìn)入酵母細(xì)胞壁)等)的組合物。在一些實(shí)施方案中，給予個(gè)體本發(fā)明的組合物(例如，包含MIP的組合物)以臨床治療疾病或疾病狀態(tài)(例如，足癬)。在其它實(shí)施方案中，給予個(gè)體本發(fā)明的組合物(例如，包含MIP的組合物)以預(yù)防性治療(例如，預(yù)防跡象或癥狀的開始)疾病或疾病狀態(tài)(例如，足癬)。在一些實(shí)施方案中，將組合物(例如，包含MIP的組合物)和方法應(yīng)用于任何類型的區(qū)域或表面。例如，在一些實(shí)施方案中，區(qū)域包括固體表面(例如，醫(yī)療設(shè)備)、溶液、有機(jī)體表面(例如，人的外部或內(nèi)部)或食物女口廣叩ο
[0135]本發(fā)明不受一種或多種給予至(例如，進(jìn)行混合)液體或固體(例如，用于去除靶化合物)的MIP的量的限制。在一些實(shí)施方案中，每升液體或固體給予約0.10mg、0.50mg、1.0mg、2.0mg、5.0mg、10.0mg、20.0mg、50.0mg、100.0mg、500.0mg 或更多的 MIP。
[0136]在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的MIP用于諸如血液灌流的毒素消除方法。血液灌流是一種治療技術(shù)，其中大量的個(gè)體血液通過(guò)吸附物質(zhì)(例如，MIP)以從血液中去除有毒物質(zhì)。
[0137]通常，最常用于血液灌流的吸附劑為樹脂和各種形式的活性碳或活性炭。然而，這些物質(zhì)的結(jié)合特異性相對(duì)較差并且有時(shí)它們吸附重要的血液因子以及靶分子。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明MIP作為對(duì)靶分子具有更好特異性和高親合力的吸附劑的用途。
[0138]血液灌流通過(guò)將經(jīng)動(dòng)脈導(dǎo)管抽出的血液泵送進(jìn)入包含吸附劑材料的柱或筒而運(yùn)作(例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所使用的吸附劑物質(zhì)是本文描述的MIP)。當(dāng)血液通過(guò)柱中的碳或樹脂顆粒時(shí)，有毒分子或顆粒被吸引至吸附劑顆粒表面并在柱內(nèi)被捕獲。血液流出柱的另一端并通過(guò)與靜脈導(dǎo)管連接的管子返回至個(gè)體。與血液透析或其它過(guò)濾方法相比，血液灌流能夠從大量血液中清除毒素，例如，其每分鐘能處理超過(guò)300mL的血液。
[0139]本發(fā)明的MIP可用于血液灌流。在一些實(shí)施方案中，使用血液灌流，本發(fā)明的MIP用于從個(gè)體的血液中去除一種或多種真菌毒素。
[0140]可調(diào)節(jié)給藥方案以提供最佳的期望反應(yīng)(例如，治療或預(yù)防反應(yīng))。例如，可向動(dòng)物給予含MIP的單一丸劑，也可隨時(shí)間給予若干分次劑量，或可根據(jù)治療情況的指示來(lái)按比例減少或增加劑量。有利的是以劑量單位形式配制腸胃外組合物，從而方便給藥和劑量均勻性。本發(fā)明MIP的劑量通常取決于(a)活性化合物的特性和待獲得的特定治療或預(yù)防效果，和(b)本領(lǐng)域中，將用于治療對(duì)個(gè)體中真菌毒素過(guò)敏的這類活性化合物進(jìn)行混合而存在的固有局限性。當(dāng)然，給予的劑量根據(jù)已知因素而變化，例如特定試劑的藥效特性及其給藥模式和途徑；接受者的年齡、健康狀況和體重；癥狀的性質(zhì)和程度、共同治療的種類、治療頻率和期望的效果。
[0141]能將本發(fā)明的MIP混入適于向個(gè)體給藥的藥物組合物。例如，藥物組合物可包含MIP和藥物可接受的載體。如本文所用，“藥物可接受的載體”包括生理學(xué)可接受的溶劑、分散介質(zhì)、涂料、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥物可接受的載體的實(shí)例包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一種或多種，以及它們的組合。在許多情況下，其優(yōu)選在組成中包含等滲劑，例如糖、諸如甘露醇、山梨醇的多元醇類或氯化鈉。藥物可接受的載體還可包含微量的諸如潤(rùn)濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液的輔助物質(zhì)，其增強(qiáng)MIP的保存期或有效性。
[0142]在某些實(shí)施方案中，例如可與惰性稀釋劑或可消化食用載體一起口服給予本發(fā)明的MIP。還可將化合物(如果需要，和其它的成分)封裝在硬或軟殼明膠膠囊中、壓縮成片劑或直接混入個(gè)體飲食中。對(duì)于口服治療給藥，可將化合物與賦形劑混合并以可食用的片齊U、頰片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、薄片劑、顆粒劑等形式而使用。為了通過(guò)除腸胃外給藥之外的其它途徑給予本發(fā)明的化合物，可能需要使用采用涂覆化合物或與材料共同給予化合物以防止其失活。
[0143]還能將補(bǔ)充活性化合物混入組合物中。在某些實(shí)施方案中，與一種或多種其它治療劑共同配制和/或共同給予本發(fā)明的MIP。
[0144]本發(fā)明的藥物組合物可包含“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的本發(fā)明的MIP?！爸委熡行Я俊笔侵冈诮o藥時(shí)以及必要時(shí)間內(nèi)有效實(shí)現(xiàn)期望治療結(jié)果的量。治療有效量可根據(jù)多種因素而變化，例如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重以及印跡納米粒在個(gè)體中引起期望反應(yīng)的能力。治療有效量還是其中治療有益效果超過(guò)印跡納米粒的任何有毒或不利影響的量。“預(yù)防有效量”是指在給藥時(shí)和必要時(shí)間內(nèi)有效實(shí)現(xiàn)期望預(yù)防結(jié)果的量。通常，由于在疾病之前或疾病早期階段將預(yù)防劑量用于個(gè)體，因此預(yù)防有效量小于治療有效量。
[0145]在一些實(shí)施方案中，當(dāng)與有機(jī)物質(zhì)(例如，飼料)和/或液體(例如，水、酒或其它飲料)混合和/或直接供給至個(gè)體時(shí)，本發(fā)明的組合物降低個(gè)體對(duì)真菌毒素的吸收或攝取(例如，從而減輕降低的性能、增加健康和/或減少個(gè)體中與真菌毒素有關(guān)的疾病或病理反應(yīng)的發(fā)生率)并減少和/或防止真菌毒素或其代謝物在肉、魚、蛋、奶和注定進(jìn)入人類食物鏈的其它產(chǎn)物中沉積。
[0146]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明用于制備分離設(shè)備(例如，固相提取(簡(jiǎn)寫為SPE))，所述設(shè)備基于不同于可使用的常規(guī)分離設(shè)備(例如，正相、反相或離子交換固相提取)的物理和化學(xué)性質(zhì)而用于從雜質(zhì)混合物中去除固體或半固體化合物。在一些實(shí)施方案中，能將分離設(shè)備并入在提取時(shí)使用的筒，因而純化所生產(chǎn)的MIP的特定對(duì)應(yīng)模板(correspondingtemplate)和模板類似物。
[0147]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明能用于封裝與液體色譜一起使用的色譜柱，并能實(shí)現(xiàn)所使用的MIP的對(duì)應(yīng)模板和模板類似物的特定洗脫。與本領(lǐng)域已知的可使用的其它技術(shù)和材料(例如，正相、離子交換、與多肽和小分子相互作用的包含各種尺寸的疏水烷基鏈(-(CH2)n-CH3,η等于但不限于4、8、18)的反相硅膠柱)相比，制備的MIP柱能實(shí)現(xiàn)更有針對(duì)性的相互作用，而且更具體地指向所制備的MIP的對(duì)應(yīng)模板和模板類似物。在一些實(shí)施方案中，各自用于特定真菌毒素或真菌毒素群的多種不同類型的MIP能用于柱的封裝。
[0148]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于分離和定量真菌毒素的材料。然后，本發(fā)明能用于飼料/食物材料或液體源的溯源檢測(cè)以用于檢測(cè)樣品中存在的真菌毒素及其與通常公認(rèn)的參考化合物(例如，使用與UV-聯(lián)用的HPLC、熒光檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器等洗脫的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品)的比較。
[0149]在一些實(shí)施方案中，使用一種類型的MIP或多種不同類型的各自調(diào)節(jié)至特定真菌毒素或真菌毒素群的MIP，能夠完成真菌毒素水平的溯源，并將其應(yīng)用于檢測(cè)包含飼料或食品樣品(例如，谷物樣品(例如，玉米、小麥等)、水果(例如，蘋果、梨、葡萄等)、咖啡、茶、可可等)的樣品物質(zhì)。
[0150]在一些實(shí)施方案中，將使用一種MIP或多種不同類型的各自調(diào)節(jié)為靶向特定真菌毒或真菌毒素群的MIP的真菌毒素水平溯源用于分析研究(例如，HPLC)以測(cè)定是否樣品中存在真菌毒素，并且若存在，則存在哪種真菌毒素并且處于何種水平。在一些實(shí)施方案中，用于檢測(cè)真菌毒素的分析工具(例如，HPLC)能用于預(yù)測(cè)飼料中真菌毒素污染的危險(xiǎn)性。在其它實(shí)施方案中，用于檢測(cè)真菌毒素的分析工具能用于確定需要將哪種MIP或MIP組合應(yīng)用于采集樣品的材料以減少或消除存在的真菌毒素。
[0151 ] 在一些實(shí)施方案中，將使用一種MIP或多種不同類型的各自用于特定真菌毒或真菌毒素群的MIP的真菌毒素水平溯源用于檢測(cè)在動(dòng)物生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的或用作動(dòng)物和人消耗用飲料的液體(例如，水、牛奶、果汁、酒、啤酒等)的真菌毒素含量。
[0152]在一些實(shí)施方案中，真菌毒素含量的溯源能用于飼料/食物加工(肉加工、新鮮農(nóng)產(chǎn)品加工)以檢測(cè)整個(gè)生產(chǎn)流過(guò)程中真菌毒素的存在，從而確定哪里發(fā)生污染問(wèn)題并需要召回。應(yīng)當(dāng)相應(yīng)地參考條形碼和其它跟蹤介質(zhì)、產(chǎn)品的所有變動(dòng)及生產(chǎn)過(guò)程中的步驟，從而溯源所分析的樣品。
[0153]在一些實(shí)施方案中，將使用一種MIP或多種不同類型的各自用于特定真菌毒或真菌毒素群的MIP的真菌毒素水平溯源用于檢測(cè)血液的真菌毒含量。例如，本發(fā)明能用于輸血實(shí)踐以有助于連續(xù)審計(jì)追蹤，其通過(guò)真菌毒素水平溯源來(lái)解釋從捐獻(xiàn)者的初始采集直至向接受者輸血或丟棄的所有時(shí)間點(diǎn)的與處理、測(cè)試、儲(chǔ)存等方面有關(guān)的血液產(chǎn)品行蹤及其目前狀態(tài)。
[0154]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明將與一種或多種本文所述方法和/或材料結(jié)合的本文所述MIP用于減少、去除和/或消除真菌毒素的組合物和/或方法(例如，本文描述的物理、混合、化學(xué)、微生物方法(例如，以吸附和/或螯合毒素))。例如，在一些實(shí)施方案中，與一種或多種物理、混合、化學(xué)、微生物方法一起使用本文描述的MIP以螯合真菌毒素。能將多種物理方法用于減少真菌毒素存在,例如機(jī)械分離(參見(jiàn)例如，Dickens J.W.和WhitakerT.B.，1975.Peanut Science, 2:45-50)、密度分離(參見(jiàn)例如，Huff ff.E.和 Hagler ff.M.，1982.Cereal Chemistry, 59:152-153)、通過(guò)使用水或碳酸鈉洗滌的谷物清洗以減少玉米污染(例如，具有鐮刀菌毒素)、整理污染的谷物(例如，通過(guò)物理分離或熒光性以檢測(cè)真菌毒素的存在)、熱失活(參見(jiàn)例如，Lee L.S., 1989.Journal of American Oil ChemistrySociety, 66:1398-1413)、UV 照射、X 射線或微波照射(參見(jiàn)例如，CAST，2003.Mycotoxins:Risk inplant, animal, and human systems.1n:Task Force Report 139 (NiyoK.編輯)，Council for Agricultural Science and Technology, Ames, 1wa, USA:pp.1-199)以及毒素的溶劑提取(參見(jiàn)例如，Scott P.Μ., 1998.Review of Veterinary Medicine, 149:543-548)。諸如酸、堿(例如，氨、苛性鈉)、氧化劑(例如，過(guò)氧化氫、臭氧)、還原劑(例如，亞硫酸氫鹽)、氯化劑和甲醛的多種化學(xué)試劑已經(jīng)用于降解污染的飼料中的真菌毒素，特別是黃曲霉毒素(參見(jiàn)例如，Hagler ff.M, Jr., 1991.1n Mycotoxins, Cancer andHealth, (Bray G.和 Ryan D.編輯),Lousiana State University Press, Baton Rouge,LN, USA ；Phillips T.D., Clement B.A.和 Park D.L.,1994.Approaches to reduct1nof aflatoxin in foods and feeds.1n:The toxicology of aflatoxins:Human health,veterinary agriculture significance (Eaton L.D.和 Groopman J.D.編輯),AcademicPress, New York, NY, USA:pp.383-406)。類似地，過(guò)濾器(例如，過(guò)濾柱)和類似的設(shè)備能用于去除真菌毒素。
[0155]本發(fā)明還提供了供給各個(gè)方面產(chǎn)品的體系和方法(例如，本發(fā)明的產(chǎn)品和/或其組分和/或使用本發(fā)明的服務(wù))。本發(fā)明還提供了向公司以外的一方供給公司產(chǎn)品的體系和方法，例如用于向顧客或產(chǎn)品經(jīng)銷商提供公司產(chǎn)品，例如一種或多種MIP(例如，特異的真菌毒素-靶向的MIP)。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了能從溯源體系中分離或與溯源體系結(jié)合的產(chǎn)品管理體系。例如，能分析材料樣本以確定材料中是否存在或不存在真菌毒素；如果存在真菌毒素，則能識(shí)別具體的真菌毒素。該信息能用于溯源(例如，以說(shuō)明不存在所有或某些真菌毒素)。該信息還能用于提供MIP產(chǎn)品管理的體系，由此能建立特異的MIP組合并將其結(jié)合在一起以特異地靶向樣品材料中存在的真菌毒素。
[0156]在一些實(shí)施方案中，公司接收從公司以外的一方(例如，經(jīng)銷商和/或顧客)至指令部門的輸入(例如，指令、信息或材料(例如，生物樣品(例如，懷疑包含靶化合物的液體樣品))的形式)；并提供了輸出(例如，從運(yùn)輸部分遞送的產(chǎn)品形式(例如，至經(jīng)銷商和/或顧客)或數(shù)據(jù)報(bào)告形式(例如，實(shí)驗(yàn)室分析服務(wù)形式的溯源))。在一些實(shí)施方案中，組織產(chǎn)品管理體系以最優(yōu)化指令接收和向公司以外的一方的產(chǎn)品(例如，包含一種或多種MIP (例如，真菌毒素-特異性MIP)的組合物)遞送(例如，以成本有效方式)；并從所述方獲得這類產(chǎn)品的支付。在一些實(shí)施方案中，組織產(chǎn)品管理體系以使遞交的樣品或材料具有條形碼從而用于分析和將數(shù)據(jù)表報(bào)告(例如，通過(guò)使用由MIP (例如，真菌毒素-特異性MIP)制備的MIP-SPE或HPLC柱分析的若干真菌毒素水平)遞送(例如，以成本有效方式)至公司以外的一方；以及從所述一方獲得這類產(chǎn)品的支付。
[0157]在一些實(shí)施方案中，公司包括制造過(guò)程和給藥過(guò)程。本發(fā)明的組合物能在制造過(guò)程中生產(chǎn)和/或通過(guò)第三方生產(chǎn)，并能諸如以物料儲(chǔ)存和/或其它組分儲(chǔ)存(例如，產(chǎn)品儲(chǔ)存)形式在上述過(guò)程中單獨(dú)地儲(chǔ)存和/或能被進(jìn)一步集合(例如，組合(例如，能將一種或多種MIP與一種或多種其它類型的MIP和/或與其它組分(例如，本文描述的載體和/或其它生物活性組分)組合))和儲(chǔ)存(例如，在設(shè)備和/或產(chǎn)品儲(chǔ)存中)。在一些實(shí)施方案中，給藥包括指令部門(例如，接收來(lái)自顧客和/或經(jīng)銷商的產(chǎn)品的指令形式的輸入)。然后，指令部門以指示運(yùn)輸部門滿足指令的形式提供輸出(即，按照顧客或經(jīng)銷商的要求運(yùn)輸產(chǎn)品)。在一些實(shí)施方案中，運(yùn)輸部門除了滿足產(chǎn)品或服務(wù)的指令之外還能向財(cái)務(wù)部門提供信息/數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，公司的其它組分可包括客服部門(例如，能從顧客接收輸入和/或以反饋或信息的形式向顧客提供輸出和/或接收信息或向公司的任何其它組分提供輸出)。例如，客服部門還可以以所需的技術(shù)信息形式從顧客接收輸入，例如用于確定本發(fā)明的產(chǎn)品和方法能用于特殊需要的顧客，并能以對(duì)所需技術(shù)信息做出響應(yīng)的形式向顧客提供輸出。
[0158]因此，在一些實(shí)施方案中，適當(dāng)配置公司的部分以進(jìn)行彼此交流從而促進(jìn)材料和部件、設(shè)備、其它部分、產(chǎn)品、公司內(nèi)部和外部的數(shù)據(jù)資料和信息的傳遞。例如，物理路徑能用于當(dāng)從指令部門接收合適的輸入時(shí)將產(chǎn)品從產(chǎn)品儲(chǔ)存?zhèn)魉椭吝\(yùn)輸部門，或當(dāng)接收緊急分析要求時(shí)將產(chǎn)品從樣品儲(chǔ)存?zhèn)魉椭练治霾块T。相比之下，能將指令部門與公司內(nèi)的其它部分電子連接，例如通過(guò)通信網(wǎng)絡(luò)(例如，網(wǎng)絡(luò)(例如，因特網(wǎng)和/或內(nèi)聯(lián)網(wǎng)))，并能被進(jìn)一步配置以便例如通過(guò)電話網(wǎng)絡(luò)、通過(guò)郵件或其它載體服務(wù)或通過(guò)因特網(wǎng)而從顧客接收輸入。
[0159]在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)品管理體系還包括一種或多種數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。
[0160]在一些實(shí)施方案中，公司能使用大量軟件應(yīng)用以向公司部分提供信息和/或向公司以外一方提供對(duì)一種或多種公司部分的訪問(wèn)(例如，對(duì)指令部門和/或客服部門和/或數(shù)據(jù)采集/儲(chǔ)存的訪問(wèn))。這樣的軟件應(yīng)用可包括諸如因特網(wǎng)、局域網(wǎng)絡(luò)或內(nèi)聯(lián)網(wǎng)的通信網(wǎng)絡(luò)。例如，在基于因特網(wǎng)的應(yīng)用中，顧客能訪問(wèn)與指令部門合作的合適的網(wǎng)站和/或網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，以使顧客能向指令部門提供指令形式的輸入。作為回應(yīng)，指令部門能與顧客交流以確認(rèn)已經(jīng)接收到指令，并還能與運(yùn)輸部門交流，提供將本發(fā)明的產(chǎn)品(例如，包含一種或多種不同類型的MIP(例如，真菌毒素特異性MIP)的組合物)運(yùn)輸至顧客或分析部門的輸入，提供輸入，即，應(yīng)使用本發(fā)明的產(chǎn)品(例如，將包含一種或多種不同類型的MIP(例如，真菌毒素特異性MIP)的組合物包裝為分離裝置)進(jìn)行的分析。因此，以該方式，公司業(yè)務(wù)能以有效的方式進(jìn)行。
[0161]因此，在一些實(shí)施方案中，在網(wǎng)絡(luò)布置中，公司的各個(gè)子部分(例如，儲(chǔ)存、分析、財(cái)務(wù)部門和運(yùn)輸部門)能通過(guò)各自的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)彼此交流。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法，其用于向一方(例如，顧客/使用者、經(jīng)銷商、第三方(例如，政府機(jī)構(gòu)(例如，健康研究中心和/或疾病控制中心)等)提供各個(gè)方面的產(chǎn)品(例如，本發(fā)明的產(chǎn)品和/或其組分)以及關(guān)于本發(fā)明各個(gè)方面的產(chǎn)品信息(例如，性能數(shù)據(jù)、使用統(tǒng)計(jì)等)。在一些實(shí)施方案中，例如通過(guò)運(yùn)輸部門從產(chǎn)品儲(chǔ)存中移除產(chǎn)品并發(fā)送至諸如顧客或經(jīng)銷商的需求方。通常，這樣的運(yùn)輸響應(yīng)于下指令一方而發(fā)生，然后其在組織內(nèi)被處理(例如，傳送至合適部分)并導(dǎo)致指令的產(chǎn)品發(fā)送至所述一方或向所述一方提供服務(wù)。能在組織內(nèi)進(jìn)一步傳送關(guān)于產(chǎn)品裝貨的數(shù)據(jù)或針對(duì)所述一方的分析服務(wù)數(shù)據(jù)資料，例如，從運(yùn)輸或分析部門傳送至財(cái)務(wù)部門，其反過(guò)來(lái)能向所述一方傳送隨同產(chǎn)品或數(shù)據(jù)資料或在產(chǎn)品或數(shù)據(jù)資料已經(jīng)發(fā)送后的賬單。本發(fā)明還提供了向使用本發(fā)明的產(chǎn)品和/或其組分的一方提供技術(shù)服務(wù)的方法。當(dāng)這樣的功能可通過(guò)與產(chǎn)品研究和開發(fā)有關(guān)的個(gè)人進(jìn)行時(shí)，與技術(shù)服務(wù)相關(guān)的詢問(wèn)通常能由組織的行政部門(例如，客服部門)處理、安排和/或管理。技術(shù)服務(wù)(例如，解決與產(chǎn)品或產(chǎn)品各個(gè)組分的使用有關(guān)的問(wèn)題)交流可能需要使用者(例如，顧客)和客服部門間交換信息。
[0162]如上所述，向使用者提供產(chǎn)品(例如，本文描述的產(chǎn)品和/或其組分)和/或服務(wù)的方法的許多變型是可能的并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明包括的方法(例如，商業(yè)方法)涉及(I)產(chǎn)品(例如，本文描述的產(chǎn)品和/或其組分)的生產(chǎn)；(2)接收這些產(chǎn)品的指令；(3)向下這些指令的一方發(fā)送產(chǎn)品；(4)向負(fù)責(zé)支付所發(fā)送的產(chǎn)品的一方發(fā)送賬單；和/或(5)接收產(chǎn)品所發(fā)送至的一方的付款。例如，提供包括下列步驟中的兩種或更多種的方法:(a)從供應(yīng)商獲得部件、材料和/或組分；(b)制備一種或多種第一產(chǎn)品(例如，一種或多種本文描述的組分(例如，本文描述的MIP模板和/或使用MIP模板生成的一種或多種不同類型的MIP)) ；(c)儲(chǔ)存一種或多種步驟(b)的第一產(chǎn)品；(d)將一種或多種步驟(b)的第一產(chǎn)品與一種或多種其它組分結(jié)合以形成一種或多種第二產(chǎn)品(例如，包含兩種或更多種不同類型的MIP的組合物)；(e)儲(chǔ)存一種或多種步驟(b)的第一產(chǎn)品或一種或多種步驟(d)的第二產(chǎn)品；(f)獲得步驟(b)的第一產(chǎn)品或步驟(d)的第二產(chǎn)品的指令；(g)向下步驟(f)的指令的一方運(yùn)輸步驟(b)的第一產(chǎn)品或步驟(d)的第二產(chǎn)品；(h)跟蹤關(guān)于驟(g)中產(chǎn)品被運(yùn)輸至的一方的欠款量的數(shù)據(jù)；(i)向步驟(g)中產(chǎn)品被運(yùn)輸至的一方發(fā)送賬單；(j)獲得步驟(g)中運(yùn)輸?shù)漠a(chǎn)品的付款(通常但不必須地，付款由步驟(g)中產(chǎn)品被運(yùn)輸至的一方進(jìn)行)；以及(k)在組織部門和擁有步驟(d)中運(yùn)輸?shù)漠a(chǎn)品的一方(通常，為在步驟(g)中產(chǎn)品被運(yùn)輸至的一方)之間交換技術(shù)信息。
[0163]購(gòu)買者希望購(gòu)買一種或多種不同類型的MIP。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)購(gòu)買者訂制包含多種不同類型的MIP的組合物(例如，基于與一種或多種類型的待消除/螯合的靶化合物的存在有關(guān)的信息)。該優(yōu)點(diǎn)在于顧客可按照其需要訂制特定的產(chǎn)品(例如，購(gòu)買包含多種不同類型的對(duì)各個(gè)靶化合物有特異性的MIP的組合物，而不分別購(gòu)買包含僅一種MIP的組合物，然后與其它的進(jìn)行結(jié)合而使用各個(gè)組合物)。
[0164]本發(fā)明還提供了與定制產(chǎn)品設(shè)計(jì)有關(guān)的方法。這些方法包括例如(I)收集客戶對(duì)具有特殊子組分的產(chǎn)品和/或操作所述產(chǎn)品的方法進(jìn)行的指令，(2)制備或準(zhǔn)備具有特殊子組分的產(chǎn)品和/或操作所述產(chǎn)品的方法，(3)以及向顧客提供(例如，運(yùn)輸)(b)的產(chǎn)品。
[0165]實(shí)施例
[0166]提供下列實(shí)施例以說(shuō)明和進(jìn)一步例示本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案和方面，并且不應(yīng)理解為限制其范圍。
[0167]實(shí)施例1
[0168]赭曲霉素A模板的合成
[0169]2-乙酰氧基-3，5-二氯苯甲酸的制備。將IL裝備有機(jī)械攪拌器、溫度計(jì)以及壓力平衡的125mL滴液漏斗的圓底三口燒瓶放置在水浴中，并保持在65°C下。隨后，伴隨高效攪拌將下列試劑裝入至燒瓶:250mL的干燥甲苯、2.5mL的濃硫酸和207g的充分研磨的固體3，5-二氯水楊酸，其形成流動(dòng)懸浮液。當(dāng)該不斷攪拌的混合物的溫度達(dá)到60°C時(shí)(使水浴溫度保持在65°C下)，開始滴加1Sg(10mL)的醋酸酐并在30分鐘內(nèi)完成。在醋酸酐加入過(guò)程中，使反應(yīng)混合物溫度不超過(guò)75°C。在完成加入后，將混合物攪拌并加熱至70°C，另外保持4小時(shí)。在該時(shí)間后，停止攪拌并將混合物冷卻過(guò)夜至室溫。將從混合物分離的白色結(jié)晶過(guò)濾除去，用2X10mL的冰冷甲苯洗滌并在50°C下真空干燥以產(chǎn)生206g(產(chǎn)率為82.7%)的2-乙酰氧基_3，5-二氯苯甲酸。通過(guò)濃縮濾液至1/2的最初體積，在冰水浴中冷卻溶液，過(guò)濾除去結(jié)晶產(chǎn)品并在50°C下將其真空干燥來(lái)回收另外的30.68(產(chǎn)率為12.3%)的產(chǎn)物。
[0170]原位制備2_乙酸氧基-3, 5- 二氯苯甲酸氯及其在N- (2-乙酸氧基-3, 5_ 二氯苯甲?；?-L_苯丙氨酸乙酯的制備中的用途(出于個(gè)人安全，該過(guò)程在通風(fēng)廚下進(jìn)行)。
[0171]制備體系由3L反應(yīng)器組成，所述反應(yīng)器裝備有高效機(jī)械攪拌器(Ace Glass Inc,Louisville, KY, cat#13650_12/23)、250mL滴液漏斗、具有出口與酸性蒸汽吸收器連接的CaCl2干燥管的回流冷凝器、干燥氮?dú)馊肟诤头胖迷?2°C水浴中的溫度計(jì)。在攪拌下，將IL的干燥甲苯、5mL的二甲基甲酰胺和103g的2-乙酰氧基_3，5-二氯苯甲酸裝入反應(yīng)器中。在攪拌下一滴一滴地加入至217mL(l.05當(dāng)量)的2M草酰氯溶液的二氯甲烷反應(yīng)混合物中，時(shí)間為2.5小時(shí)。在放置在使用自來(lái)水冷卻的截止閥中的IL的10%氫氧化鈉溶液中吸收在反應(yīng)中產(chǎn)生的有毒氣體混合物流:HC1、CO和C02。在伴隨著完全溶解固體而完成的草酰氯加入之后，使強(qiáng)流的干燥氮?dú)馔ㄟ^(guò)溶液I小時(shí)以去除保持溶解在反應(yīng)混合物中的大多數(shù)酸性氣體(HClXO2)。之后，在冰水浴中將燒瓶的容納物冷卻低于15°C，并將95g(l.0當(dāng)量)的固體L-苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽加入至混合物中。安裝新的500mL滴液漏斗代替250mL的漏斗并充滿145mL三乙胺(2.55當(dāng)量)的350mL甲苯的溶液。然后，在2小時(shí)內(nèi)將三乙胺溶液加入至冰水浴冷卻和攪拌的反應(yīng)混合物中。在加入過(guò)程中，將混合物的溫度保持低于25°C。在完成三乙胺加入后將該溫度保持4小時(shí)，然后過(guò)濾除去三乙胺鹽酸鹽并用兩份10mL的甲苯洗滌白色濾餅。然后，將濾液轉(zhuǎn)移至3L分液漏斗中并用兩份500mL的水和一份500mL的鹽水洗滌。然后，將甲苯層濃縮至500mL的體積并在冰箱中放置過(guò)夜以結(jié)晶。在過(guò)濾器上收集白色結(jié)晶并用一份10mL的冰冷甲苯洗滌，生成108.7g (62 %產(chǎn)率)的N- (2-乙酰氧基_3，5- 二氯苯甲酰基)-L-苯丙氨酸乙酯。
[0172]1H NMR(氘代氯仿(簡(jiǎn)寫為 CDCl3)，ppm):7.78 δ，J 2.8，IH -J.55 δ，J2.4，IH ；
7.30-7.27m, 3Η ；7.11 寬峰 δ，J 8.0，IH ；7.08 δ q, J 8.0 和 1.6，IH ；4.99q, J 6.0，IH ；4.24q, J 7.0，2H ；3.29dd, J 5.6 和 14.4，IH ；3.21dd, J 9.2 和 14.0，IH ；2.11s, 3H ；1.31t,J 7.2，3H。
[0173]N-(3，5-二氯-2-羥基苯甲?；?-L-苯丙氨酸(OTA模板)的制備。將108g的N-(2-乙酰氧基-3，5- 二氯苯甲?；?-L-苯丙氨酸乙酯溶解在IL的無(wú)水乙醇中并放置在裝備有磁力攪拌棒的2L的圓底燒瓶中，并在環(huán)境溫度下放置在水浴中。一批次將33.33g氫氧化鈉的37.2mL水的溶液加入至該混合物中，并在環(huán)境溫度下將混合物攪拌17小時(shí)(過(guò)夜)。在攪拌下加入體積為68.6mL的濃鹽酸，將其保持另外2小時(shí)。過(guò)濾除去沉淀的氯化鈉并在30T的壓力下在60°C下將濾液濃縮至干燥。在冷卻后，88.9g(產(chǎn)率為98%)的殘留物以無(wú)色透明產(chǎn)物形式而凝固，將其充分溶解在甲苯或乙腈中從而制備OTA模板(例如，用于 MIP-OTA 制備)。MS:M+354 和 356? NMR(CDCl3, ppm):12.2 非常寬 s’ IH ；7.49d, J 2.4，IH ；7.35-7.28m, 3H ；7.20d, J 2.0, IH ；7.18-7.16m, 2H ；6.80br d, J 6.4，IH ；6.4 非常寬 s’IH ；5.07dd, 5.2 和 5.2，IH ；3.34dd, J 14.0 和 5.2，IH ;3.27dd, J 13.6 和 5.2，1H。
[0174]實(shí)施例2
[0175]在甲苯-環(huán)己烷混合物中的MIP-OTA合成
[0176]將500mL 的甲苯，35.42g(0.1M)的 OTA 模板、16.18mL(0.15M)的 2-乙烯基吡啶、12.13mL(0.1M)的甲基丙烯酸2-羥基乙酯、235.75mL(1.25M)的二甲基丙烯酸乙二醇酯和
2.46g(15mM)的AIBN放置在裝備有機(jī)械攪拌器、回流冷凝器、溫度計(jì)和氮?dú)馊肟?/出口的3L四頸燒瓶中。在室溫下，將產(chǎn)生的澄清溶液攪拌I小時(shí)并使恒定的氮?dú)饬魍ㄟ^(guò)容器(例如，用于去除能抑制聚合的氧氣)。然后，將燒瓶加熱至60°C并劇烈攪拌混合物。只要溶液的溫度增加至約55°C則發(fā)生聚合(例如，通過(guò)溶液粘度的增加而觀察到的)。在聚合開始后15分鐘，一批加入600mL的(I: I)環(huán)己烷/甲苯混合物以促進(jìn)聚合物球從溶液中分離。保持混合物的劇烈攪拌并在30分鐘后加入另外500mL的甲苯以提高仍然增加體積的固體MIP懸浮液在相對(duì)低體積的溶劑中的整體混合。將60°C的溫度和攪拌保持另外5小時(shí)，此后關(guān)閉攪拌以使MIP球沉淀。傾倒上層清液并將顆粒轉(zhuǎn)移至2L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀燒瓶中以在40°C下和30T的減壓下從MIP球中去除剩余的溶劑。將干燥的球研磨至約140目并通過(guò)使用1.5L的0.2w/v%的氫氧化鈉溶液攪拌30分鐘并傾析來(lái)洗滌5次。將最終部分的MIP-OTA球與也被傾析的1.5L 0.5V/V%醋酸和1.5L DI水混合。使用四個(gè)玻璃托盤將生成的無(wú)模板的潤(rùn)濕MIP-OTA球(約1.0L體積)在80°C下的實(shí)驗(yàn)室烘箱中干燥4小時(shí)。白色粉末狀MIP-OTA重量為248g(產(chǎn)率為93% )。使用該方法合成下列表I中識(shí)別的各個(gè)樣品。
[0177]對(duì)于該合成步驟和隨后的合成步驟，在用于聚合前，通過(guò)真空蒸餾從單體和交聯(lián)劑中去除聚合抑制劑，并且用于聚合的溶劑為ACS純度。通過(guò)比較在λ趴385nm處的模板的橙紅色Fe3+絡(luò)合物強(qiáng)度與在10 μ g/mL至lmg/mL的模板濃度下建立的校正曲線，來(lái)獲得在隨后的洗滌中的模板濃度。
[0178]表1.在甲苯-環(huán)己烷混合物中合成的樣品的識(shí)別
[0179]
樣品ID 甲苯-環(huán)己燒(mL) 最終的洗潘形態(tài)
[0180]
523-29/30 I45/15[ZS|球狀，白色粉末
523-31 65/15?Μ球狀，白色粉末
523-34 65/35乙醇/NaOH球狀，白色粉末
523-35 55/22乙醇/NEt3/H20~白色粉末，簇狀
523-36 90/30Na0H/H20白色簇狀
[0181]實(shí)施例3
[0182]在乙腈中的OTA MIP合成
[0183]將500mL 的乙腈、17.71g(50mM)的 OTA 模板、8.lmL(75mM)的 2-乙烯基吡啶、
6.lmL(50mM)的甲基丙烯酸2-羥基乙酯、117.9mL(625mM)的二甲基丙烯酸乙二醇酯和1.23g(15mM)的AIBN放置在3L的裝備有機(jī)械攪拌器、500mL壓力平衡的滴液漏斗、溫度計(jì)和氮?dú)馊肟?出口的四頸燒瓶中并使用電熱套加熱。將產(chǎn)生的澄清溶液在室溫下攪拌I小時(shí)并使恒定的氮?dú)饬魍ㄟ^(guò)容器(例如，用于去除能抑制聚合的氧氣)。然后，將燒瓶加熱至60°C并劇烈攪拌混合物。只要溶液溫度增加至約55°C則確保聚合發(fā)生(例如，通過(guò)溶液粘度的增加而觀察到的)。在聚合開始后的30分鐘(例如，當(dāng)可觀察到凝膠形成時(shí))，從500mL的滴液漏斗中分三份迅速添加1.5L的乙腈(預(yù)熱至55°C并使用氮?dú)庀礈煲匀コ鯕?以避免阻止聚合物形成并促進(jìn)從溶液中分離聚合物球。將混合物的劇烈攪拌和加熱保持另外17小時(shí)(過(guò)夜)。然后,關(guān)閉加熱和攪拌并使MIP球沉淀。傾析上層清液并將小球轉(zhuǎn)移至2L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀燒瓶中并在40°C和30T的減壓下從MIP球中去除剩余的溶劑。將干燥的球研磨至約140目并通過(guò)使用1.5L的0.2w/v%氫氧化鈉溶液攪拌30分鐘并傾析來(lái)洗滌5次。將MIP-OTA球的最終部分與也被傾析的1.5L的0.5v/v%醋酸和1.5L DI水混合。使用4個(gè)玻璃托盤，在80°C下的實(shí)驗(yàn)室烘箱中將生成的無(wú)模板的濕潤(rùn)MIP-OTA球(體積為約1.2L)干燥6小時(shí)。白色粉末狀MIP-OTA稱重為115g(產(chǎn)率為86.2%)。使用該方法合成在下列表2中識(shí)別的各個(gè)樣品。
[0184]表2.在乙腈中合成的樣品的識(shí)別
[0185]
樣品ID 乙臘(mL)最終的洗潘*形態(tài)
523-48 100(+甲苯50mL)N^OH球狀/簇狀，黃色
523-49 50(+ 水 150mL)NaOH球狀，黃色 / 橙色
[0186]
523_59 |225mL[NaOH|球狀，白色
523-60 190mLNaOH球狀，白色
[0187]*在4X02% NaOH洗滌后，1X1% AcOH洗滌隨后使用I XH2O洗滌。
[0188]實(shí)施例4
[0189]在甲苯中的大規(guī)模MIP-OTA制備
[0190]在具有四頸蓋子的3L反應(yīng)器中進(jìn)行制備，所述反應(yīng)器裝備有:具有在底部和中部安裝的兩個(gè)螺旋槳的機(jī)械攪拌器、電熱套、溫度計(jì)、空氣平衡的1.5L滴液漏斗和氮?dú)馊肟谝约把b備有控制氮?dú)饬髁康牧髁坑?jì)的回流冷凝器。將下列試劑裝載入反應(yīng)器:54.54g(154mM)的 N-(3，5-二氯-2-羥基苯甲?；?-L-苯丙氨酸(0ΤΑ 模板)、25mL (231mM)的2-乙烯基吡啶、18.7mL(154.0mM)的單甲基丙烯酸乙二醇酯、363g(1.925M)的二甲基丙烯酸乙二醇酯、770mL的甲苯和5.0g(30.8mM)的AIBN。將另外的1.5L的甲苯放置在滴液漏斗中。將反應(yīng)混合物劇烈攪拌，并通過(guò)在環(huán)境溫度下使強(qiáng)流的氮?dú)馐紫韧ㄟ^(guò)放置在滴液漏斗中的甲苯隨后通過(guò)空體積的反應(yīng)器45分鐘以去除溶解的氣體。在聚合過(guò)程中保持弱的氮?dú)饬?。通過(guò)將反應(yīng)混合物加熱至高達(dá)55°C引發(fā)聚合。在15min后,混合物的粘度增加,并且攪拌變得不太有效。此時(shí)，從滴液漏斗中加入另外體積的甲苯(為環(huán)境溫度)。將加入過(guò)程設(shè)置以足夠快速運(yùn)行，從而防止由于反應(yīng)的放熱性質(zhì)而產(chǎn)生的混合物過(guò)熱并保持反應(yīng)混合物的粘度足夠低以使在聚合物球的形成和分離過(guò)程中的攪拌有效。將60-70°C的溫度和攪拌保持另外5小時(shí)，然后使混合物在環(huán)境溫度下不攪拌直至第二天。然后，從MIP顆粒和研磨的甲苯濕潤(rùn)MIP顆粒中傾析1.75L的甲苯層并轉(zhuǎn)移至2.0L的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀燒瓶。在輕微的減壓下和低于70°C的溫度下將在MIP顆粒內(nèi)捕獲的大部分甲苯(約0.45L)從MIP球中蒸餾除去。在甲苯去除結(jié)束時(shí)，已經(jīng)形成的粉末狀產(chǎn)物展現(xiàn)出產(chǎn)生粉末的傾向。此時(shí)，停止蒸發(fā)并使用2份每份為500mL的乙醇來(lái)洗滌MIP顆粒。然后，從固體中傾析約0.75L的乙醇并蒸發(fā)以產(chǎn)生30g(55% )的再生OTA模板和700mL的再生乙醇。然后，使用4X0.5L份的0.2w/v% NaOH洗滌白色細(xì)固體，隨后使用500mL的“八％醋酸洗滌一次和500mL份的DI水洗滌一次。然后在80°C下的實(shí)驗(yàn)室烘箱將生成的‘濕潤(rùn)’0ΤΑ-ΜΙΡ干燥24小時(shí)。獲得大量的411.4g(產(chǎn)率為96.6%)的白色粉末狀產(chǎn)物并使用標(biāo)準(zhǔn)篩分離。將該方法用于合成表3中識(shí)別的各個(gè)樣品。表4提供尺寸重新分配的細(xì)節(jié)。
[0191]表3.在甲苯或聚乙烯醇(簡(jiǎn)寫為PVA)中合成的樣品的識(shí)別
[0192]
樣品ID j甲苯或PVA (mL)|最終的洗潘~ME
514-37/39~150mL甲苯NaOH*球狀/簇狀，白色
523-40 5mL PVA+10mLNaOH*球狀 / 簇狀，白色
514-41 5mL PVA+50mLNaOH*球狀 / 簇狀，綠色
514-42/44~ 388+776mL 甲苯NaOH*球狀 / 簇狀，白色
[0193]*使用4X02% NaOH洗滌，隨后使用1X1% AcOHl洗滌和IX水洗滌。
[0194]表4.產(chǎn)生的MIP-OTA的尺寸重新分配
[0195]
分級(jí)尺寸j分級(jí)重量(g) |mip-ota重量百分比
> 106μιη212.8151.8

45 μ m -106 μ m 127.72Ihl
20 μ m-45 μ m 56.9713.9
< 20μιη13.283?2
[0196]實(shí)施例5
[0197]低溫和UV引發(fā)的MIP-OTA和NIP聚合/合成
[0198]光化學(xué)反應(yīng)裝置。將石英、在450瓦UV燈(ACE Glass,目錄#7825-34)和450瓦套管電源(ACE Glass,目錄#7830-58)中裝備的光化學(xué)UV浸沒(méi)池(Ace Glass,目錄#7856-10)與循環(huán)冷卻裝置WKL 230 LAUDA (由Brinkmann Instuments, Inc.提供)連接，并在UV燈開啟時(shí)使4°C的冷卻水運(yùn)行通過(guò)池套。
[0199]聚合(表5):將單體、模板、引發(fā)劑(IABN)和交聯(lián)劑放置在半透明、聚乙烯瓶
(Nalgene?型2105)中并使氬氣流通過(guò)混合物15分鐘以去除所有氧氣，已知其抑制游離自由基聚合。然后，將瓶封閉并在uv燈中心水平處與浸沒(méi)池連接，并與光化學(xué)反應(yīng)裝置一起浸入冰水浴中。當(dāng)開啟燈時(shí)使冷卻水運(yùn)行通過(guò)燈套，并使反應(yīng)混合物照射保持四小時(shí)(當(dāng)uv燈開啟時(shí)需要uv安全玻璃)。在uv聚合過(guò)程中，供給另外的冰并從浴中排掉過(guò)量的水以保持冷卻浴溫度在4°c。在完成聚合后打開瓶，將聚合物壓碎并磨碎成小塊，將其洗滌:使用乙醇洗滌一次，使用0.2 %的氫氧化鈉洗滌十次，使用I %的醋酸洗滌一次并使用乙醇洗滌三次以從聚合物中去除模板，并且確保最終在實(shí)驗(yàn)室烘箱中干燥以去除乙醇?xì)埩粑锏腗IP的最大活性。對(duì)于#555-54A和555-54B，MIP-OTA的產(chǎn)率分別為56.7%和49%。
[0200]表5.使用低溫和UV弓丨發(fā)合成的MIP-OTA樣品的識(shí)別
[0201]
I.2_乙烯基丨單甲基丙烯酸I二甲基丙烯
MIP-OTA ；、'、-吡啶I乙二醇酯酸乙二酯丨=I ?.(mM) (mM) I (πιμΓ I(mM)(_ ("M)
Ρ555^54αΠ^HX73^ - | 7J68θ17J6
I 555-54Β j - 10.73 I 7.16 [89.51.07 i 7.16
[0202]實(shí)施例6
[0203]MIP對(duì)真菌毒素的螯合能力-應(yīng)用于OTA
[0204]對(duì)OTA(Sigma_Aldrich, St.Louis, MO, USA)真菌毒素，測(cè)試用于通過(guò)化學(xué)相互作用從液體或半液體介質(zhì)去除OTA真菌毒素的在甲苯-環(huán)己烷、乙腈或甲苯中制備的MIP聚合物。制備的MIP在本文用于描述螯合OTA真菌毒素的親合力差異并用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的特異性。將12.5mg的MIP放入Amicon超速離心過(guò)濾器設(shè)備(5，OOODa)。與不含MIP物質(zhì)的空白樣品和僅包含待測(cè)試的OTA毒素的陽(yáng)性對(duì)照一起進(jìn)行制備。在調(diào)整至pH 4.0的50mM檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行螯合試驗(yàn)。保持在37°C的溫度下，在150rpm下在軌道旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器(Brunswick, Champaign, IL, USA)上將所有樣品孵育90分鐘。使用最終體積為12.5mL的十億分之50、十億分之100、十億分之250 (ppb)的體系測(cè)試三個(gè)最終濃度的0ΤΑ。在孵育后，將微型離心管在10，OOOrpm下離心10分鐘。將上層清液收集進(jìn)入琥珀色且硅烷化的HPLC小瓶中，防止真菌毒素與小瓶的任何相互作用，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(參見(jiàn)例如，EntwisleA.C., Williams A.C., Mann P.J., Slack P.T., Gilbert J., 1995.Liquid chromatographymethod with immunoaffinity column cleanup for determinat1n of ochratoxin A inbarley Collaborative study (用于確定大麥中赭曲霉素A的具有免疫親和性柱清洗的液體色譜方法:合作研究).Journal of A0AC，83:1377-1383)從與熒光和二極管陣列檢測(cè)器信號(hào)連接的HPLC (Alliance, Waters Corp.，Milford, MA, USA)中進(jìn)行計(jì)算(例如，以檢測(cè)真菌毒素和螯合的真菌毒素的量)。
[0205]結(jié)果(參見(jiàn)表5)表明在1.00g/L的濃度下，在含有OTA-模板和不含模板(NIP)的情況下制備的MIP在PH 4.0下對(duì)OTA真菌毒素分子具有非常高的親合力。根據(jù)所述制備方法，在沉淀聚合后生成的MIP(標(biāo)識(shí)為在甲苯中合成的#523-31 ;在甲苯-環(huán)己烷混合物中合成的#523-34、-35、-36 ;以及在甲苯-乙腈混合物中合成的#523-48)具有的螯合功效高于98.8%，而在乳化聚合后生成的MIP (標(biāo)識(shí)為在水和聚乙烯醇中合成的#523-40和-41 ；以及在乙腈中合成的49)具有的較低親合力低于63%。NIP分子還能以98.8%的螯合功效而相互作用。在該階段，沉淀聚合組表現(xiàn)出在NIP和MIP之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)差別，而乳化聚合組表現(xiàn)出在MIP和NIP之間以及還在MIP之間的顯著差別。
[0206]在15%乙醇/氫氧化鈉、醋酸I %溶液下的兩次相繼洗滌步驟用于評(píng)價(jià)兩個(gè)MIP組保持相互作用的能力并解釋螯合強(qiáng)度(參見(jiàn)表6)。乳化聚合組顯示從MIP強(qiáng)烈釋放0ΤΑ，以及與OTA真菌毒素共同洗脫的剩余模板的釋放解釋了負(fù)百分比吸附。因此，本發(fā)明規(guī)定乳化聚合方法不適于對(duì)OTA分子產(chǎn)生高效吸附劑。本發(fā)明還規(guī)定沉淀聚合組對(duì)OTA具有顯著高的親合力，使得針對(duì)在甲苯-乙腈混合物中合成的MIP僅有26.3%的OTA分子的最大去吸附，而對(duì)任何剩余的模板沒(méi)有任何干擾。
[0207]表6.對(duì)于赭曲霉素A，在甲苯、乙腈和甲苯-環(huán)己烷混合物中合成的MIP和NIP的螯合活性以及在使用15%乙醇/氫氧化鈉的兩次相繼洗滌后的相互作用穩(wěn)定性
[0208]
+均靜止吸附的(％)斗■均去吸附的(％)
樣品ID 初始第I次洗漆第2次洗滌初始第I次洗滌第2次洗漆
--Ρ 523-3 Γ "98J4" 92.5286.661.162— 7.47813.342 —
"mTp 523-3C 98.95 93.05......................8930L04T 6.95510.500
~Μ?Ρ 523-35；； 99M 90.60......................8.6:090.963" 9.39713.915 ~
--Ρ 523-36;； 99.00 86.76..............................................8.2:831.000.13.23817.175 —
?μΓρ 523-48" 99.73 85.7673 710.273 14—24226.293
[0209]#沉淀聚合
[0210]實(shí)施例7
[0211]用于螯合赭曲霉素A的MIP量的滴定
[0212]進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)以研究0.01g/L至1.00g/L的MIP夾雜率(或0.001%至0.1%的夾雜率)。與不含MIP物質(zhì)的空白樣品和僅含待測(cè)試的OTA毒素的陽(yáng)性對(duì)照一起進(jìn)行制備。在調(diào)整至pH 4.0的50mM檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行螯合試驗(yàn)。保持在37°C的溫度下，在150rpm下,在軌道旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器(Brunswick, Champaign, IL, USA)上將所有樣品孵育90分鐘。使用最終體積為12.5mL的十億分之50、十億分之100、十億分之250 (ppb)的體系測(cè)試三個(gè)最終濃度的0ΤΑ。在孵育后，將微型離心管在10，OOOrpm下離心10分鐘。將上層清液收集進(jìn)入琥珀色且硅烷化的HPLC小瓶中，防止真菌毒素與小瓶的任何相互作用，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(參見(jiàn)例如，Entwisle等人，2000，如前所引用)從與熒光和二極管陣列檢測(cè)器信號(hào)連接的HPLC (Alliance, Waters Corp.，Milford, MA, USA)中進(jìn)行計(jì)算(例如，以檢測(cè)真菌毒素和螯合的真菌毒素的量)。
[0213]如圖3所示，在0.05g/L下，最佳功效高于螯合值的80%并達(dá)到平均86.4±1.5%的螯合。檢查酸性緩沖液條件(pH 4.0)中，通過(guò)50--13、100--13、200--13的0^上的0.01(^/L、0.025g/L、0.050g/L、0.075g/L、0.100g/L、0.50g/L 和 1.0Og/L 的 MIP#523-34(在甲苯-環(huán)己烷混合物中合成的)和#523-60(在乙腈中合成的)的螯合活性來(lái)評(píng)價(jià)MIP化合物的夾雜水平的發(fā)生率。將MIP尺寸設(shè)置在45 μ m至106 μ m的粒徑，因?yàn)樵摲旨?jí)給予最佳的螯合結(jié)果并代表在合成的總MIP產(chǎn)物中顆粒尺寸的最高比例。
[0214]各個(gè)MIP、#523-34 和 #523-60 能夠分別吸附 91.53±10.86%和 81.75±23.67%的0ΤΑ，以作為獨(dú)立于夾雜水平的平均總螯合。在針對(duì)#523-34和#523-60樣品分別為
0.05g/L和0.10g/L的MIP夾雜水平的螯合曲線中發(fā)現(xiàn)偏差點(diǎn)。對(duì)于#523-34，0.05g/L至1.00g/L和0.10g/L至1.00g/L的夾雜螯合親合力平均值分別為96.31±2.23%和97.39±0.70% ο 對(duì)于 #523-60,0.05g/L 至 1.00g/L 和 0.10g/L 至 1.00g/L 的夾雜水平的螯合親合力平均值分別為94.51 ±6.54和97.76±0.91%。因此，本發(fā)明規(guī)定在甲苯-環(huán)己烷混合物中合成的MIP有利于在0.01g/L的夾雜下對(duì)OTA螯合具有72.42 ±2.58%的較高親合率，而使用乙腈制備的樣品在0.01g/L和0.05g/L的產(chǎn)物夾雜下分別具有不太有效的47.40±6.08 和 84.77±1.96 的親合率。
[0215]實(shí)施例8
[0216]不同的MIP和NIP的親合力及對(duì)赭曲霉素A的特異性特征
[0217]在開展本發(fā)明實(shí)施方案的過(guò)程中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而評(píng)價(jià)在作為聚合用溶劑的乙腈或甲苯中合成的不同NIP/MIP的親合力。在沒(méi)有任何OTA模板的情況下合成樣品#523-31 (甲苯)和#523-59(乙腈)(定義為非印跡聚合物)；在OTA類似物模板周圍聚合樣品#523-34(甲苯-環(huán)己烷的混合物)和#523-60(乙腈)。然后，使用不同截止尺寸的篩子來(lái)篩選樣品。如在實(shí)施例4中描述的測(cè)試粒徑范圍。MIP產(chǎn)物主要產(chǎn)生直徑為約45 μ m至106 μ m大小的顆粒(如圖4所示)。與不含MIP物質(zhì)的空白樣品和僅包含待測(cè)試的OTA毒素的陽(yáng)性對(duì)照一起進(jìn)行制備。在調(diào)整至pH 4.0的50mM檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行螯合試驗(yàn)。保持在37°C的溫度下,在150rpm下,在軌道旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器(Brunswick, Champaign, IL, USA)上將所有樣品孵育90分鐘。使用最終體積為12.5mL的十億分之50、十億分之100、十億分之250 (ppb)的體系測(cè)試三個(gè)最終濃度的0ΤΑ。在孵育后，將微型離心管在10，OOOrpm下離心10分鐘。將上層清液收集進(jìn)入琥珀色且硅烷化的HPLC小瓶中，防止真菌毒素與小瓶的任何相互作用，并從與熒光和二極管陣列檢測(cè)器信號(hào)連接的HPLC (Alliance，Waters Corp.，Milford, MA, USA)中進(jìn)行計(jì)算(例如，以檢測(cè)真菌毒素和分離的真菌毒素的量)。
[0218]OTA親合力的比較僅顯示出在3種不同濃度的毒素上(50ppb、100ppb、250ppb)對(duì)沒(méi)有連續(xù)洗滌步驟的單一螯合進(jìn)行評(píng)價(jià)而得出的有限差異。僅由沒(méi)有篩分的NIP制成的樣品#523-59在每一 pH濃度的OTA下展現(xiàn)出較低的螯合能力。對(duì)于50ppb濃度值的ΟΤΑ,ΜΙΡ樣品#523-34也發(fā)現(xiàn)較低的螯合值，特別是在尺寸為20 μ m至45 μ m，以及在較少程度中直徑為45μπι至106μπι。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明規(guī)定根據(jù)本發(fā)明方法制備的MIP顆粒的尺寸對(duì)OTA的總吸附親合力具有較小的影響，在最差的情況下具有螯合率為78%至99%的親合力波動(dòng)。與MIP相比NIP在它們的螯合性能中有效性低，解釋了 MIP與OTA真菌毒素相互作用的特異性。
[0219]實(shí)施例9
[0220]使用MIP在酒中捕獲示蹤OTA和使用MIP固相提取(SPE)類過(guò)濾裝置在酒中直接過(guò)濾示蹤赭曲霉素A
[0221]使用免疫親和性柱在白色酒(Chardonnay 2005-California)樣品上測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)提取步驟。在純的酒樣品上以及在包含5ppb、1ppb、20ppb的純結(jié)晶OTA的示蹤酒樣品上進(jìn)行提取。酒的最初濃度平均為1.676±0.269ppb的OTA(例如，如按照標(biāo)準(zhǔn)提取步驟所測(cè)定的)。5ppb的示蹤樣品回收為100%且對(duì)于1ppb為77.7%。
[0222]與不含MIP物質(zhì)的空白樣品和僅包含待測(cè)試的OTA毒素的陽(yáng)性對(duì)照一起進(jìn)行制備。在調(diào)整至pH 4.0的50mM檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行螯合試驗(yàn)。保持在37°C的溫度下，在150rpm下,在軌道旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器(Brunswick, Champaign, IL, USA)上將所有樣品孵育90分鐘。使用最終體積為12.5mL的十億分之50、十億分之100、十億分之250 (ppb)的體系測(cè)試三個(gè)最終濃度的0ΤΑ。在孵育后，將微型離心管在10，OOOrpm下離心10分鐘。將上層清液收集進(jìn)入琥珀色且硅烷化的HPLC小瓶中，防止真菌毒素與小瓶的任何相互作用，并從與熒光和二極管陣列檢測(cè)器信號(hào)連接的HPLC (Alliance，Waters Corp.，Milford，MA，USA)進(jìn)行計(jì)算(例如，以檢測(cè)真菌毒素和分離的真菌毒素的量)。
[0223]使用用于在原始最佳表現(xiàn)的MIP#523_34 (苯酚-環(huán)己烷混合物)上螯合真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)步驟來(lái)評(píng)價(jià)從酒中螯合0ΤΑ。對(duì)于0.05g/L、0.10g/L、0.50g/L和1.00g/L的夾雜水平，螯合分別在 43.29±4.08%至 67.15±4.94%至 91.75±1.59%至 95.612±1.201%的平均值上變化。當(dāng)在0.5mg/mL和1.0mg/mL的夾雜水平下使用時(shí)，MIP的滴定測(cè)定最佳親合力(參見(jiàn)圖5)。
[0224]因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從酒中捕獲/吸附真菌毒素(例如，0ΤΑ)的組合物和方法(例如，用于(例如，在震動(dòng)條件下)有效結(jié)合并吸附來(lái)自酒的真菌毒素的MIP顆粒)。
[0225]例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于捕獲和/或吸附真菌毒素(例如，一種或多種不同類型的真菌毒素(例如，液體介質(zhì)或來(lái)自絡(luò)合物基質(zhì)(例如，飼料、食品、植物、動(dòng)物等)的提取溶液中存在的)的MIP(例如，根據(jù)本文描述的方法而制備的)。
[0226]生成固相提取類(SPE類)過(guò)濾裝置以用于0.lg/L當(dāng)量的MIP夾雜物。需要硅烷化的玻璃小瓶以確保OTA在水性溶劑中的穩(wěn)定性并防止OTA和玻璃小瓶間任何非特異性相互作用?；谕ǔＳ糜诒绢I(lǐng)域的方法將硅烷化方法應(yīng)用于尼龍和PTFE/PE過(guò)濾器和管(參見(jiàn)例如，Entwisle等人，2000，如前面所引用)。小瓶和過(guò)濾器通過(guò)使用硅烷化試劑(SURFASIL)填充它們或浸潰它們而制備。在I分鐘后，使用甲苯將它們洗滌一次，然后使用甲醇洗滌兩次，隨后使用水洗滌三次并干燥。如在本領(lǐng)域中進(jìn)行的，進(jìn)行硅烷化并產(chǎn)生物質(zhì)與OTA分子的相互作用的顯著降低。例如，觀察到小于5%的干擾(例如，當(dāng)使用PE/PTFE過(guò)濾器時(shí)，與先前未硅烷化的物質(zhì)的約16%至26%的干擾相比)。尼龍不適用于硅烷化。使用硅烷化玻璃管替換所有聚丙烯管。
[0227]生成SPE類過(guò)濾裝置以在通過(guò)柱直接過(guò)濾樣品后從酒中捕獲0ΤΑ。測(cè)試MIP對(duì)從加入有 5ppb 和 1ppb OTA 的酒(Chardonnay 2005-California)中清除 OTA 的功效。結(jié)果證實(shí)對(duì)于加入5ppb和1ppb的0ΤΑ，酒的OTA含量立即分別降低為55.41 + 5.542%和56.937 ± 5.739 %。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與SPE或SPE類過(guò)濾裝置一起使用的真菌毒素特異性MIP (例如，根據(jù)本文描述的方法而生成的)以從包含真菌毒素的液體(例如，酒)中去除真菌毒素。
[0228]實(shí)施例10
[0229]使用熱引發(fā)和低溫UV引發(fā)的MIP固相提取(SPE)類過(guò)濾裝置捕獲赭曲霉素A以及對(duì)關(guān)鍵的酒成分的選擇性評(píng)價(jià)
[0230]生成固相提取類(SPE類)過(guò)濾設(shè)備以用于0.lg/L當(dāng)量的MIP的夾雜物。需要硅烷化的玻璃小瓶以確保OTA在水性溶劑中的穩(wěn)定性并防止OTA和玻璃小瓶間任何非特異性相互作用。基于通常用于本領(lǐng)域的方法將硅烷化方法應(yīng)用于尼龍和PTFE/PE過(guò)濾器和管(參見(jiàn)例如，Entwisle等人，2000，如前面所引用)。小瓶和過(guò)濾器通過(guò)使用硅烷化試劑(SURFASIL)填充它們或浸潰它們而制備。在I分鐘后，使用甲苯將它們洗滌一次，然后使用甲醇洗滌兩次，隨后使用水洗滌三次并干燥。如在本領(lǐng)域中進(jìn)行的，進(jìn)行硅烷化并產(chǎn)生物質(zhì)與OTA分子的相互作用的顯著降低。例如，觀察到小于5%的干擾(例如，當(dāng)使用PE/PTFE過(guò)濾器時(shí)，與先前未硅烷化的物質(zhì)的約16%至26%的干擾相比)。尼龍不適用于硅烷化。使用硅烷化玻璃管替換所有聚丙烯管。
[0231]通過(guò)在甲醇(HPLC級(jí))中溶解并加入水和85%鄰磷酸以使pH降低至約3.0來(lái)制備包含多酚的12種化合物的原液:咖啡酸(Caf A)、兒茶酸水合物(CH)、表兒茶酸(ECH)、阿魏酸(Fer)、反式-3-羥基肉桂酸(3-HCA)、2_羥基肉桂酸(2-HCA)、錦葵色素_3_半乳糖苷氯化物(Mai)、楊梅酮(Myr)、槲皮黃酮脫水物(QH)、反式-白藜蘆醇(Res)、蘆丁三水合物(Rut)和吲哚-3-醋酸(IAA) (Sigma, StLouis, MO, USA)。將上層清液收集在琥珀色且娃燒化的HPLC小瓶中，防止真菌毒素與小瓶的任何相互作用，并從與熒光和二極管陣列檢測(cè)器信號(hào)連接的HPLC (Alliance, Waters Corp.，Milford, MA, USA)進(jìn)行計(jì)算(例如，以檢測(cè)真菌毒素和分離的真菌毒素的量)。使用恒溫在30°C的C18反相HPLC Spherisorb ODS柱 5 μ m, 4.6 μ mX 250mm(Waters Corp.,Milford,MA,USA) ? 將激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)置為225nm和365nm。將UV光電二極管陣列檢測(cè)器設(shè)置為210nm至799nm波長(zhǎng)的全掃描模式。流動(dòng)相由水/磷酸(99.5%: 0.5%；v/v)和⑶乙腈(HPLC級(jí))/水/磷酸(50% /49.5%/0.5% ；v/v/v)組成。
[0232]所有MIP均顯示出在緩沖液溶液中的OTA的良好吸附，所有均超過(guò)80 %的吸附。MIP 555-52顯示出最佳的吸附，約100%。有趣地，在所有MIP的緩沖液洗滌過(guò)程中OTA保持吸附，但在甲醇洗滌過(guò)程中解吸附，特別是從熱引發(fā)的MIP#555-52和#523-34并在最高的OTA濃度下顯著。與對(duì)熱引發(fā)的MIP相比，OTA對(duì)在甲醇洗滌中的低溫和UV-引發(fā)的MIP#555-54A和#555_54B保持更好的吸附，對(duì)通過(guò)甲醇洗滌保持的UV-引發(fā)的MIP具有平均超過(guò)50%的吸附(參見(jiàn)圖6)。
[0233]充分記載了酒中抗氧化劑多酚化合物的健康益處。在過(guò)濾諸如OTA的液體(例如，酒)中的真菌毒素時(shí)，還基本評(píng)價(jià)了螯合劑物質(zhì)對(duì)諸如多酚的一些有益化合物的影響。在一些實(shí)施方案和本文的記載中(參見(jiàn)例如，實(shí)施例6至實(shí)施例9)，熱引發(fā)聚合產(chǎn)生的MIP#555-52和#523-34能夠與液體介質(zhì)中存在的OTA真菌毒素有效地相互作用，吸附水平超過(guò)95 %，而低溫和UV-弓丨發(fā)聚合產(chǎn)生的MIP#555-54和#555_54X則產(chǎn)生為80 %至92 %的螯合功效的吸附功效(圖6)。
[0234]在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用不同的多酚、花青素和吲哚-3-醋酸的混合物進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，本發(fā)明的低溫和UV-引發(fā)的MIP組合物具有對(duì)OTA的d特異性。在該情況下，MIP#555-54A和#555-54B具有OTA的高吸附(超過(guò)80%)并同時(shí)防止多酚或吲哚_3_醋酸的吸附(例如，其提供了感官和抗氧化特性(例如，酒的))。在UV-引發(fā)的MIP的研究中，除去孵育時(shí)間并將酒樣品和洗滌劑立即推進(jìn)MIP或過(guò)濾器。觀察到非常少的吸附(圖7)。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有對(duì)真菌毒素(例如，0ΤΑ)的特異性、而同時(shí)具有對(duì)有益化合物(例如，多酚和/或吲哚-3-醋酸)的較少結(jié)合或沒(méi)有結(jié)合(例如，吸附)的MIP。楊梅酮、白藜蘆醇和蘆丁的定量?jī)A向于不確定，由于它們?cè)诮咏鼨z測(cè)極限和HPLC分析儀器定量極限下以非常低的濃度存在，產(chǎn)生出大的標(biāo)準(zhǔn)偏差和負(fù)值作為結(jié)果。因此，在本實(shí)施方案中，UV-引發(fā)的MIP高效捕獲OTA并且不損壞酒液體培養(yǎng)基的多酚含量，說(shuō)明對(duì)產(chǎn)生的MIP物質(zhì)的特異性。
[0235]實(shí)施例11
[0236]在玻璃纖維網(wǎng)上涂覆MIP用作過(guò)濾裝置
[0237]在進(jìn)行本發(fā)明實(shí)施方案的過(guò)程中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)試具有MIP-OTA的玻璃纖維網(wǎng)涂層(參見(jiàn)圖8)。將多種濃度的OTA用于測(cè)定各個(gè)制劑的親合力。在下列表7中概述生成的不同MIP。使用包含不同濃度的交聯(lián)劑的MIP涂覆3個(gè)網(wǎng)格篩，所述交聯(lián)劑影響脆度。(單體溶液1、2、3和1H)?；谕扛睲IP之前和之后的重量將從涂覆的MIP制備的網(wǎng)格切割以產(chǎn)生通過(guò)微分加權(quán)而估計(jì)的50mg、10mg和200mg的MIP。使用沉入在20mL離心管中的MIP涂覆的網(wǎng)格進(jìn)行螯合檢驗(yàn)，在使用旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器孵育90分鐘后確定酒介質(zhì)中OTA的螯合特性。在孵化之前和之后使用MIP-OTA網(wǎng)格過(guò)濾器測(cè)量來(lái)自包含加入三種不同濃度的OTA的酒溶液的管中ImL物質(zhì)。將樣品收集在琥珀色且硅烷化的HPLC小瓶中，防止真菌毒素與小瓶的任何相互作用，并從與熒光和二極管陣列檢測(cè)器信號(hào)連接的HPLC (Alliance，WatersCorp.，Milford, MA, USA)進(jìn)行計(jì)算(例如，以檢測(cè)真菌毒素和分離的真菌毒素的量)。
[0238]表7.用于在玻璃纖維網(wǎng)上涂覆MIP的聚合條件的描述
[0239]
赭曲霉素A類似物(mg)模板1000 500 250 1000
2-乙烯基吡啶(μ?) MOTA 丨0聽 500 2501000___ 的職__
乙二醇二甲基兩烯酸_(mL)η 交聯(lián)劑一 5555 —
2-羥基乙基甲基丙婦酸酯(μ?)—結(jié)合分子—800200800
偶氮二昇丁績(jī)(mg)—聚合引發(fā)劑—6655— 5066
固化(烘箱)_用于干燥網(wǎng)袼65°C65°C ~65°C:80-90°C
溶劑露解_體沒(méi)有沒(méi)有沒(méi)有500μ1〒苯
[0240]結(jié)果表明對(duì)OTA的最大螯合依賴于MIP的夾雜水平。使用500mg的模板、250mg的乙烯基-吡啶和200mg的甲基丙烯酸羥基乙酯來(lái)獲得螯合最大值(參見(jiàn)圖9)，所述甲基丙烯酸羥基乙酯產(chǎn)生在10ppb濃度的酒中吸附高達(dá)46.5%的OTA的MIP。相反地，使用在纖維玻璃上涂覆的相同處理的NIP聚合物進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，表現(xiàn)出依賴制備步驟的小于15%(降至I % )的螯合功效(參見(jiàn)圖10)，從而例示針MIP-OTA物質(zhì)對(duì)OTA的特異性。
[0241]實(shí)施例12
[0242]MIP的色譜保留能力
[0243]在水-浴中使用聲波降解法，在包裝物質(zhì)后將MIP#523_34(使用甲苯-環(huán)己烷混合物合成的)用作4.6 X 150mm HPLC柱的靜態(tài)相，然后采用連續(xù)過(guò)夜的5.0mL/min流速的乙臆運(yùn)行通過(guò)該柱(使用 HPLC Waters Alliance binary pump (Waters Corp, Milford, MA,USA)的MIP)。測(cè)定柱壓力為約400psi并可與其它地方描述的其它HPLC條件比較(參見(jiàn)例如，Baggiani 等人，2002,如前面所引用；Jodlbauer J.,Maier N.Μ.和 Lindner Journalof Chromatography A, 945:45-63 ；Maier N.M., Buttinger G., Welhartizki S., Gav1liE., Lindner ff., 2004.Journal of Chromatography B, 804:103-11)。使該柱在 1.0mL/min的乙腈流速下穩(wěn)定48小時(shí)并使用甲醇99%和四乙基胺1%廣泛洗滌以從柱中去除剩余的OTA模板。使用MIP柱來(lái)進(jìn)行前面的OTA的HPLC-PDA-FID分析表征。
[0244]在不同的流動(dòng)相條件下以及在30°C恒溫下保持通過(guò)該柱的不同梯度設(shè)置下來(lái)評(píng)價(jià)柱的生存。測(cè)試包括100%水和過(guò)渡至100%乙腈或100%甲醇且反之亦然的若干梯度；并還使用四乙基胺I %的甲醇至甲醇100%，時(shí)間為60分鐘。在將壓力增加至高達(dá)1600psi后，柱生存并沒(méi)有靜態(tài)相的任何改變，解釋了柱在高壓力下的生存。注射丙酮用于評(píng)價(jià)柱的空體積，而分析物的洗脫為2分鐘時(shí)間。使用用于常規(guī)ODS C18洗脫特性(85%乙腈)的相同條件來(lái)評(píng)價(jià)OTA洗脫。在等度梯度下使用MIP柱在5分鐘時(shí)評(píng)價(jià)OTA保留。為增加OTA的保留時(shí)間，實(shí)施允許OTA的保留增加至19.5分鐘的梯度。
[0245]圖11顯示所選擇的最終條件并在相關(guān)的表中詳細(xì)說(shuō)明梯度條件。觀察到兩個(gè)峰，在17分鐘至22分鐘(在63%的乙腈下)洗脫OTA的主峰且第二峰與通過(guò)向柱加入四乙基胺I %而釋放的剩余高度結(jié)合的OTA部分相關(guān)。
[0246]實(shí)施例13
[0247]葚孢菌素模板合成
[0248]從2，3- 二甲氧基苯甲酸制備N-叔丁氧基羰基-2，3- 二甲氧基苯胺。將300mL的無(wú)水叔丁醇、50.0g(274mM)的2，3-二甲氧基苯甲酸和28.33g (280mM，39mL)的無(wú)水三乙基乙胺裝入裝備有120mL壓力平衡的滴液漏斗和氣體流量計(jì)、重型磁力攪拌棒和溫度計(jì)的IL圓底兩頸燒瓶中。將燒瓶的容納物磁力攪拌并在油浴中加熱至80°C。使用足夠低的速率將77.04g(280mM,60.5mL)的二苯基疊氮基磷酸酯滴加入混合物中以控制氣體產(chǎn)物釋放。加熱至80°C并將磁力攪拌保持過(guò)夜。然后，在30T的真空和低于55°C的溫度下將混合物的揮發(fā)性組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。將油狀產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至IL分液漏斗并溶解在500mL的環(huán)己烷和200mL的乙酸乙酯的混合物中。使用200mL DI水將溶液洗滌三次并使用200mL的飽和氯化鈉水溶液洗滌一次并在無(wú)水硫酸鈉上干燥15分鐘，過(guò)濾并在80°C下在30T的真空下濃縮。獲得67.88g無(wú)色油狀形式的N-叔丁氧基羰基_2，3- 二甲氧基苯胺(產(chǎn)率為98% )。
[0249]TLC, S12, CH2Cl2:環(huán)己烷(簡(jiǎn)寫為 c_Hex) (I: 2) ；Rf = 0.66 檢測(cè) UV，熱的 5%KMnO4亮黃色。
[0250]FT-1R 膜(cnT1):3319,2941,1669,1601,1529,1477,1459，1416,13691296,1258,1090,998,978,780,737。
[0251]1H NMR，(400MHz)，CDCl3, δ (ppm):1.53s, 9H ；3.86s, 3H ；3.862s, 3H ；6, 593dd,J =8.4 和 1.6Hz, IH ；7.004t, J = 8.4 和 8.0，IH ；7.135br s’ IH ；7.725d, J = 8.0Hz。
[0252]從N-叔丁氧基羰基-2，3- 二甲氧基苯胺制備2，3- 二甲氧基苯胺。將體積為580mL的甲醇、67.88g(268mM)的N-叔丁氧基羰基-2，3-二甲氧基苯胺和66.45mL的12.1M HCl裝入至裝備有磁力攪拌棒的IL燒瓶中并放置在50°C的水浴中。將加熱和攪拌保持2小時(shí)，然后在環(huán)境溫度下保持?jǐn)嚢柽^(guò)夜。然后，在冰浴中冷卻溶液后，伴隨攪拌加入體積為130.5mL的6.16M的氫氧化鈉。
[0253]在低于40°C的溫度下和在30T的真空壓力下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀從混合物中蒸發(fā)甲醇。使用ISOmL的甲苯稀釋半固體殘留物并過(guò)濾。使用ISOmL份的甲苯將沉淀再洗滌兩次并將濾液轉(zhuǎn)移至IL分液漏斗中。收集上層并使用硫酸鈉干燥，濃縮并真空蒸餾。在8T下，在105°C _107°C下收集無(wú)色結(jié)晶油狀形式的質(zhì)量為34.6g的2，3- 二甲氧基苯胺(產(chǎn)率為94.0% )。
[0254]TLC, S12, c-Hex:四氫呋喃(簡(jiǎn)寫為 THF) (6: I) ;Rf = 0.35 檢測(cè) UV，5% KMnO4加熱/褐色_綠色。
[0255]FT-1R 膜(cnT1):3463,3368,2939,1609，1497，1475,1319，1262,1226,1129，1085,1050,999,773,729,694o
[0256]1H NMR, (400MHz)，CDCl3, δ (ppm):3.75br s,2H ；3.83s, 3H ；3.84s3H ；6.34d, J =
8.1Hz, IH ；6.38d, J = 8.1Hz, IH ；6.84t, J = 8.1Hz, 1H。
[0257]從2，3- 二甲氧基苯胺和酮基丙二酸二乙酯合成3-羥基-6，7- 二甲氧基_2_吲哚酮-3-甲酸乙基酯。將69.33g(398.1mM)酮基丙二酸二乙酯的250mL甲苯溶液放置在IL圓底燒瓶中，該燒瓶裝備有空氣平衡的滴液漏斗和放置在冰水浴中的磁力攪拌棒。將56.769g(370.6mM)2，3-二甲氧基苯胺的200mL甲苯的溶液裝入滴液漏斗中。開始攪拌并將2，3_ 二甲氧基苯胺溶液緩慢加入至燒瓶，伴隨反應(yīng)混合物的連續(xù)冷卻和磁力攪拌。在4小時(shí)內(nèi)完成添加并使混合物升溫至室溫并保持?jǐn)嚢柽^(guò)夜，總計(jì)22小時(shí)。然后，將混合物加熱至80°C，時(shí)間為2小時(shí)，并隨后將混合物的溫度升至100°C。收集體積為25mL的蒸餾物。收集包含4mL的水和21mL的甲苯的體積為25mL的蒸餾物。TLC S12 (PhMe: THF/6: 1，UV，熱的KMnO4表示下列物質(zhì)的存在:酮基丙二酸二乙酯Rf 0.86 ;酮基丙二酸單乙基酯的2，3-二甲氧基苯胺Rf 0.66 ;2，3-二甲氧基苯胺Rf 0.43 ;酮基丙二酸二乙酯單水合物Rf
0.30和目標(biāo)產(chǎn)物3-羥基-6，7-二甲氧基-2-吲哚酮-3-甲酸乙基酯Rf 0.20)。持續(xù)加熱至100°C保持24小時(shí)，此后燒瓶中形成白色沉淀。然后，將燒瓶容納物攪拌并在80°C -90°C下加熱另外48小時(shí)。在該時(shí)間后，將其冷卻至室溫并過(guò)濾除去沉淀并使用50mL的甲苯洗滌。在干燥后，獲得16.1g的3-羥基-6，7- 二甲氧基-2-吲哚酮-3-甲酸乙基酯(產(chǎn)率為24.0% )。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮濾液并使用THF含量從7.5%至20%的C-Hex = THF混合物，在S12上進(jìn)行LC。收集另外12.2g(產(chǎn)率為18.2% )相當(dāng)純的產(chǎn)物。
[0258]Mp 150-151 °C。
[0259]TLC，S12，甲苯(簡(jiǎn)寫為 PhMe): THF (6: I)，Rf = 0.12 檢測(cè) UV，5% KMnO4 加熱
/淡黃色。
[0260]FT-1R 膜(cnT1):3293,2937,1728,1726,1636，1505，1466，1336，1236，1234，1164，1084,1016,1192,729。
[0261]1H NMR，(400MHz)，CDCl3, δ (ppm):1.191t, J = 7.2Hz,3H ；3.892s, 3H ；3.898s,3H；4.152-4.319m，16條線，dqx2，所有J = 7.2Hz在下列位置具有四重中心:4.179,4.205，4.265,4.292，2H ；4.346br s’ IH ；6.575d, J = 8.4Hz, 1H, 6.961dd, J = 8.4 和 0.4Hz, IH ；7.744br s’1H。
[0262]從3-羥基-6，7- 二甲氧基-2-吲哚酮_3_甲酸乙基酯中合成6，7_ 二甲氧基靛紅。在環(huán)境溫度的水浴中攪拌10.67g (40.2mM) 3-羥基-6，7 二甲氧基_2_吲哚酮-3-甲酸乙基酯的10mL乙醇的溶液。向該混合物滴加4.828g(120.7mM)氫氧化鈉的25mL水的溶液。將不含CO2的空氣流傳送通過(guò)劇烈攪拌的反應(yīng)混合物。將使空氣通過(guò)混合物且在環(huán)境溫度下攪拌混合物的過(guò)程保持過(guò)夜?；厥盏幕旌衔餅閺?qiáng)紅褐色。通過(guò)加入5mL的濃鹽酸中和溶液。將形成的白色無(wú)機(jī)鹽沉淀過(guò)濾除去并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將濾液濃縮至20mL體積并保持在冰箱中結(jié)晶。收集橙黃色結(jié)晶并空氣干燥。獲得量為2.24g(產(chǎn)率為26.9%)的純的6，7-二甲氧基靛紅。通過(guò)使用S12和PhMe: THF (4: I)混合物的液體層析從濾液中分離另外0.54g(產(chǎn)率為6.5% )的產(chǎn)物。
[0263]Mp 209-210 °C。
[0264]TLC, S12, PhMe: THF (6: I)，Rf = 0.18 黃色點(diǎn)，檢測(cè) UV，5% KMnO4 加熱 / 淡黃色。
[0265]FT-1R 膜(cnT1):3218,1747,1707,1623,1507,1452，1442，1337,1286，1240,1184，1082,1041,973,949,794,685,702,6620
[0266]1H NMR, (400MHz)，CDCl3, δ (ppm):3.91s 3H ；3.98s 3H ；6.60d, J = 8.4Hz, IH ；
7.42d, J = 8.4Hz, IH ；7.74br s’ 1H。
[0267]從6，7-二甲氧基靛紅中合成6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅。伴隨磁力攪拌并在冰水浴中冷卻，通過(guò)橡膠隔片從注射器中將2.255g(20.1mM)叔丁醇鉀的20mL無(wú)水THF的溶液加入至包含2.78g(13.4mM)6, 7- 二甲氧基靛紅的15mL無(wú)水THF的溶液的50mL圓底燒瓶中。通過(guò)注射器向該混合物中加入3.8mL(8.65g,60mM)的碘甲烷并在35°C下將含有立即形成的大量沉淀的混合物攪拌過(guò)夜。TLC(Si02，PhMe: THF(6: I))證實(shí)底物(6，7-二甲氧基靛紅)Rf = 0.18完全轉(zhuǎn)化為6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅Rf = 0.34。過(guò)濾除去沉淀并使用20mL份的無(wú)水THF洗滌三次。將混合的濾液濃縮至干燥并從快速層析中收集亮紅顏色部分的產(chǎn)物。使用S12和PhMe: THF(9: I)的混合物。在紅色洗脫液蒸發(fā)至干燥后，收集2.517g(產(chǎn)率為84.8% )的亮黃色結(jié)晶。
[0268]Mp 190-191 °C。
[0269]TLC, S12, PhMe: THF (6: I)，Rf = 0.34 橙紅色點(diǎn)，檢測(cè) UV, 5% KMnO4 加熱 / 淺黃色。
[0270]FT-1R 膜(cnT1):2955,1724,1614,1497，1450，1373,1264,1205，1168，1131,1086,1044，1028,979,975,828,800,775,654o
[0271]1H NMR，(400MHz)，CDCl3, δ (ppm):3.490s, 3H ；3.877s, 3H ；3.982s, 3H ；6.575d, J=8.4Hz, IH ；7.416d, J = 8.4Hz, 1H。
[0272]5-氯-6，7_ 二甲氧基-1-甲基靛紅的合成。將2.517g(ll.38mM)的6，7_ 二甲氧基-1-甲基靛紅和1.823g(13.65mM)的N-氯琥珀酰亞胺和30mL的DMF放置在裝備有磁力攪拌棒和空氣平衡的1mL滴液漏斗的10mL圓底燒瓶中并放置在冰水浴中。將
1.125mL(13.6mM)濃鹽酸的DMF的1mL溶液裝入至滴液漏斗并滴加進(jìn)入攪拌和冷卻的反應(yīng)混合物中。在完成添加后，在環(huán)境溫度下將溶液混合另外2小時(shí)。然后，在8T真空和50°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑并使用PhMe: THF(19: I)混合物在S12上使殘留物進(jìn)行快速層析。收集包含磚紅色帶產(chǎn)物的洗脫液并旋轉(zhuǎn)濃縮至干燥產(chǎn)生1.83g(產(chǎn)率為62.9% )的5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基親紅的磚紅色結(jié)晶。
[0273]Mp 140-142 °C。
[0274]TLC, S12, PhMe: THF (6: I)，Rf = 0.51 紅色點(diǎn)，檢測(cè) UV，5% KMnO4 加熱 / 淺黃色。
[0275]UV/VIS(nm)c.-0.143mg/mL 的乙醇:型，e 2.75，433，e 0.70。
[0276]FT-1R 膜(cnT1):2951,1726,1602,1457，1442，1423，1404，1359,1292，1263，1232，1093，1046，1005,979，941，897，881，797，766，668。
[0277]1H NMR, (400MHz)，CDCl3, δ (ppm):3.475s, 3H ；3.935s, 3H ；4.027s, 3H ；7434s, 1H。
[0278]在圖12中能發(fā)現(xiàn)葚孢菌素和5-氯-6，7_二甲氧基-1-甲基靛紅模板的分子結(jié)構(gòu)。在圖13中概述合成途徑。
[0279]實(shí)施例14
[0280]葚孢菌素MIP和NIP合成(使用甲基丙烯酸)
[0281]將1.8g(7.04mm)的 5_ 氯 _6，7_ 二甲氧基-1-甲基靛紅、1.194mL(l.212g，14.08mM)的甲基丙烯酸、3.415mL(3.664g，28.16mM)的甲基丙烯酸2-羥基乙基酯、39.83mL (41.86g，211.2mM)的二甲基丙烯酸乙二醇酯和 1.0g (6.09mM)的 AIBN 的 10mL 甲苯的溶液放置在裝備有氣體平衡的120mL滴液漏斗、機(jī)械攪拌器、具有流量計(jì)和溫度計(jì)的回流冷凝器的500mL四頸圓底燒瓶中。將體積為120mL的甲苯放置在滴液漏斗中，開啟攪拌器并使氮?dú)鈧魉屯ㄟ^(guò)甲苯(在滴液漏斗中)和燒瓶中混合物的整個(gè)表面并通過(guò)流量計(jì)釋放到外部。在攪拌和吹入氮?dú)?0分鐘后，將氣體流的速率限制為單一氣泡并通過(guò)將燒瓶浸入在70°C的水浴中使燒瓶的溫度增加至65°C。在聚合開始的15分鐘內(nèi)，溶液變得越來(lái)越粘稠。當(dāng)難于維持劇烈攪拌時(shí)，盡可能快地從滴液漏斗中添加甲苯以稀釋混合物。將劇烈攪拌和加熱保持4小時(shí)。在該時(shí)間過(guò)程中，形成MIP的小球。在不攪拌或加熱的情況下保持混合物過(guò)夜。在早晨，過(guò)濾除去MIP球并每次使用150mL的乙醇洗滌13次。收集橙紅色濾液，旋轉(zhuǎn)濃縮。通過(guò)使用PhMe: THF (98: 2)的快速層析回收5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅(葚孢菌素模板)并收集磚紅色帶的模板。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)產(chǎn)生1.572g(回收率為87.3% )的非常純的結(jié)晶5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅。在環(huán)境溫度下，將MIP球空氣干燥過(guò)夜并在80°C下在實(shí)驗(yàn)室烘箱中干燥另外I小時(shí)。
[0282]以小的蛋殼白色球形式獲得數(shù)量為45.362g的葚孢菌素MIP(甲基丙烯酸)并標(biāo)識(shí)為 MIP#519-98。
[0283]通過(guò)下列相同的步驟獲得雪白色球形式的葚孢菌素NIP (甲基丙烯酸)45.883g，然而沒(méi)有葚孢菌素模板加入至反應(yīng)混合物中并且僅進(jìn)行三次乙醇洗滌(每次150mL)。將聚合物標(biāo)識(shí)為MIP#555-99。
[0284]MIP和NIP都容易過(guò)濾和在燒結(jié)的玻璃過(guò)濾器上洗滌。
[0285]實(shí)施例15
[0286]葚孢菌素MIP和NIP合成(使用2_乙烯基吡啶)
[0287]將1.5g(5.86mM)的 5_ 氯 _6，7_ 二甲氧基-1-甲基靛紅、1.260mL(l.232g，
11.72mM)的2-乙烯基吡啶、2.845mL(3.053g，23.46mM)的甲基丙烯酸2-羥基乙基酯、33.191mL(34.833g, 176mM)的二甲基丙烯酸乙二醇酯和 0.833g(5.07mM)的 AIBN 的 80mL 甲苯的溶液放置在裝備有氣體平衡的10mL滴液漏斗、機(jī)械攪拌器、具有流量計(jì)和溫度計(jì)的回流冷凝器的500mL四頸圓底燒瓶中。將體積為120mL的甲苯放置在滴液漏斗中，開啟攪拌器并使氮?dú)鈧魉屯ㄟ^(guò)甲苯(在滴液漏斗中)和燒瓶中混合物的整個(gè)表面并通過(guò)流量計(jì)釋放到外部。在攪拌和吹入氮?dú)?0分鐘后，將氣體流的速率限制為單一氣泡并通過(guò)將燒瓶浸入在70°C的水浴中使燒瓶的溫度增加至65°C。在聚合開始的15分鐘內(nèi)，溶液變得越來(lái)越粘稠。當(dāng)難于維持劇烈攪拌時(shí)，盡可能快地從滴液漏斗中添加甲苯以稀釋混合物。將劇烈攪拌和加熱保持4小時(shí)。在該時(shí)間過(guò)程中，形成MIP的小球。在不攪拌或加熱的情況下保持混合物過(guò)夜。然后，過(guò)濾除去MIP球并每次使用150mL的乙醇洗滌13次。收集自洗滌的MIP的所有濾液并旋轉(zhuǎn)濃縮至干燥。將紅色的殘留物溶解于20mL的甲苯并應(yīng)用至填充有200mLSi02的甲苯的液體層析柱(24mmX50cm)的頂部。使用PhMe: THF(5: I)洗滌紅色帶。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)產(chǎn)生1.489g(回收率為99.2%)的結(jié)晶5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅。在環(huán)境溫度下將MIP球空氣干燥過(guò)夜并在80°C下在實(shí)驗(yàn)室烘箱中另外干燥兩小時(shí)。獲得小蛋殼白色球形式的37.936g的葚孢菌素MIP (2-乙烯基吡啶)并標(biāo)識(shí)為MIP#519_101。
[0288]葚孢菌素NIP (2-乙烯基吡啶)。按照下列步驟獲得雪白色球形式的39.2g的量，然而沒(méi)有葚孢菌素模板加入至反應(yīng)混合物中并且僅進(jìn)行三次乙醇洗滌(每次150mL)。將聚合物標(biāo)識(shí)為MIP#555-102。
[0289]實(shí)施例16
[0290]葚孢菌素MIP的UV引發(fā)、低溫聚合/合成
[0291]光化學(xué)反應(yīng)設(shè)備。將在450瓦UV燈(ACE Glass,目錄#7825-34)和450瓦套管電源(ACE Glass,目錄#7830-58)中裝備的石英光化學(xué)UV浸沒(méi)池(Ace Glass,目錄#7856-10)與循環(huán)冷卻裝置WKL 230 LAUDA (由Brinkmann Instuments, Inc.提供)連接，并在UV燈開啟時(shí)使4°C的冷卻水運(yùn)行通過(guò)池套。
[0292]聚合過(guò)程。單體:甲基丙烯酸1.2g(13.95mM)和單甲基丙烯酸乙二醇酯
3.631g(13.95mM)、葚孢菌素模板 1.783g(6.97mM)、引發(fā)劑(IABN)0.991g(6.03mM)和交聯(lián)劑(二甲基丙烯酸乙二醇酯41.444g(209.1mM))的混合物放置在半透明、聚乙烯瓶(Nalgene1:型2105)中并使氬氣流通過(guò)混合物15分鐘以去除所有氧氣，已知其抑制游離自由基聚合。然后，封閉瓶并在UV燈中心水平處與浸沒(méi)池連接，并與光化學(xué)反應(yīng)設(shè)備一起浸入冰水浴中。當(dāng)開啟燈時(shí)使冷卻水運(yùn)行通過(guò)燈套，并使反應(yīng)混合物照射保持3.5小時(shí)(當(dāng)UV燈開啟時(shí)需要UV安全玻璃)。在UV聚合過(guò)程中，供給另外的冰并從浴中排掉過(guò)量的水以保持冷卻浴溫度在4°C。在完成聚合后打開瓶，將聚合物壓碎并磨碎成小塊，將其洗滌:使用乙醇洗滌三次,使用1:1的水-乙醇混合物洗滌兩次,使用3: I的水-乙醇混合物洗滌六次并使用乙醇再洗滌一次以從聚合物中去除模板并確保最終在實(shí)驗(yàn)室烘箱中干燥的MIP的最大活性以去除乙醇?xì)埩粑锂a(chǎn)生41.lg(產(chǎn)率為89% )的產(chǎn)物。
[0293]實(shí)施例17
[0294]MIP對(duì)真菌毒素的螯合能力-應(yīng)用于葚孢菌素類似物
[0295]測(cè)試通過(guò)在甲苯中使用甲基丙烯酸或2-乙烯基吡啶單體的熱引發(fā)沉淀聚合而制備的MIP和NIP聚合物(參見(jiàn)例如，實(shí)施例14和實(shí)施例15)對(duì)5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板(參見(jiàn)例如，實(shí)施例13)和膠霉毒素(包含相似的二硫化物-橋接的哌嗪雙酮環(huán)體系的葚孢菌素分子類似物(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA))的通過(guò)化學(xué)相互作用從液體或半液體介質(zhì)中去除模板和膠霉毒素真菌毒素的能力。制備的MIP和NIP在本文用于描述螯合親合力的差別。通過(guò)稱重400mg的MIP/NIP物質(zhì)放入琥珀色Schott瓶并加入10mL的研究的分析物處理溶液以獲得介質(zhì)中螯合劑的0.4g/L的夾雜率來(lái)進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。與不含MIP物質(zhì)的空白樣品和包含5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板或膠霉毒素的陽(yáng)性對(duì)照一起進(jìn)行制備。在調(diào)整至pH 4.0的50mM檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行分離試驗(yàn)。保持在37°C的溫度下,在150rpm下,在軌道旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器(Brunswick, Champaign, IL, USA)上將所有樣品孵育90分鐘。使用體系-十億分之500、1，000、I，500、2，000、2，500 (ppb)或
I,000,2, 000,3, 000,4, 000,5, 000測(cè)試五個(gè)最終濃度的5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板或膠霉毒素。在孵育后，將制劑在10，OOOrpm下離心10分鐘。將上層清液收集進(jìn)入琥珀色且硅烷化的HPLC小瓶中，防止真菌毒素或模板與小瓶的任何相互作用，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從與光電二極管陣列檢測(cè)器信號(hào)連接的HPLC (Alliance，Waters Corp.，Milford, MA,USA)進(jìn)行計(jì)算(例如，以檢測(cè)真菌毒素和分離的真菌毒素的量)。使用乙腈/醋酸/三氟醋酸(34.9: 65: 0.1, v/v)的混合物作為流動(dòng)相進(jìn)行膠霉毒素的HPLC分析。根據(jù)用于由乙腈/水/甲醇(45: 45: 10，v/v)混合物組成的葚孢菌素分析的標(biāo)準(zhǔn)洗脫參數(shù)來(lái)選擇檢測(cè)5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板的HPLC方法。在具有全波長(zhǎng)掃描(268.1nm產(chǎn)生膠霉毒素的最佳信號(hào)；258.Snm產(chǎn)生模板的最佳信號(hào))的U.V.光電二極管陣列上進(jìn)行檢測(cè)。
[0296]結(jié)果顯示在pH 4.0下，對(duì)于吸附劑0.4%的夾雜水平，MIP#519_98和#519-101以及NIP#519-99和#519-10X能夠在500ppb至2，500ppb之間與大于90.8%的測(cè)試的膠霉毒素相互作用(參見(jiàn)表8)。還研究了 5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅模板的吸附，給出了在吸附劑的0.4%的夾雜水平下，對(duì)于在pH 4.0的培養(yǎng)基中存在的模板濃度為1，OOOppb至5，OOOppb 的模板分子，MIP#519-98 和 #519-101 以及 NIP#519-99 和 #519-10X 大于 94.9%的親合力(表8)。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明規(guī)定在甲苯合成的MIP均傾向于吸附葚孢菌素類似物(例如，膠霉毒素和5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板)，具有對(duì)于使用2-乙烯基吡啶單體合成的MIP#519-101的輕微優(yōu)勢(shì)，當(dāng)在pH 4.0下以4g/L的夾雜率進(jìn)行加入時(shí)，對(duì)于膠霉毒素和5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板所具有的螯合親和力分別為高達(dá)97.82±4.25%和95.85±1.25%的親合力率。MIP和NIP間的差別對(duì)于制備的任何制劑是最小的。
[0297]表8.在pH 4.0和0.4%的吸附劑夾雜下所評(píng)價(jià)的2MIP和2NIP
[0298]對(duì)5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板以及膠霉毒素的百分比表達(dá)的平均吸附親合力
[0299]........................................................................................................................................................................................................................不.販麗..............— ^ 1?%).........................——................................................................miiTri?.................................................................................................................94.M±i21.........................NlP 555-99 91.04 ± 1.5195—35 ± O—72
MlP 519-101 — 97—82 士 4—25— 95.85 土 1.25 —
—Ν1Ρ^?9-?0Χ—................................................................9114± 402..........................95.8β?.....L02
[0300]實(shí)施例18
[0301]用于螯合葚孢菌素類似物的MIP量的滴定
[0302]進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)以研究0.lg/L至1.00g/L (或0.01%至0.1 %的夾雜率)的MIP夾雜率。與不含MIP物質(zhì)的空白樣品和僅含待測(cè)試的5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅模板或膠霉毒素的陽(yáng)性對(duì)照一起進(jìn)行制備。在調(diào)整至PH 4.0的50mM檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行螯合試驗(yàn)。保持在37°C的溫度下,在150rpm下在軌道旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器(Brunswick, Champaign,IL, USA)上將所有樣品孵育90分鐘。在10mL的最終體積中使用體系1，000,2, 000,3, 000、4，000,5, OOOppb測(cè)試五個(gè)最終濃度的5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板或膠霉毒素。在孵育后，將微型離心管在10，OOOrpm下離心10分鐘。將上層清液收集進(jìn)入琥珀色且硅烷化的HPLC小瓶中，防止分析物與小瓶的任何相互作用，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從與二極管陣列檢測(cè)器信號(hào)連接的HPLC (Alliance，Waters Corp.，Milford, MA, USA)進(jìn)行計(jì)算(參見(jiàn)例如，實(shí)施例17)。
[0303]表9.在pH 4.0和4水平吸附劑夾雜下所評(píng)價(jià)的2MIP和3NIP對(duì)5_氯_6，7_ 二甲氧基-1-甲基靛紅模板的百分比形式表達(dá)的平均吸附親合力
[0304] 樣品m.丨％夾雜丨......................................................................................................................................^...............................................................................................................................__模權(quán)濃度(ppb)
~ MlP 519-98 T Ο'ΟΙΟ — 48.90—.57^93..48J7 — 37'86..38'63 一 46J0..6L98 6194 5074 6L8T^
HIT 80.37— 87.95 — 73.97 76.41 1).28 77.59
0.100 94.10 91.35 89.72 86'74 84,73 89.33^?Ρ--￥99 θ1)Τθ 59^83 5?83 4L80 42J7 38^40 4X21
砸g 700 6X50 6L71 5$Μ 5731 6440^.........................................................................................0ls0........................89l3.............................83?8...........................7108...........................7146...........................7725...........................79J2.............'^ojckP' 91^50 ' 90^97 ~ 87.99 ^ 88^86 8723 89.31ΜΙΡ519-101 ^_0 48.60 37.95 39'12 38.29 34.72 39J4^.......................................................................................Μ25........................7173...........................mil...........................60J3.............................5Τβ9...........................5438...........................603—
'^(105(F 76.93— 73.40 — 73.94 70.98 "^0.17 73.09"1ckF 90.83— 8730 ' 87,66 89J 6 1441 87.91N1P519-10X ^aMtF 41.33— 42.88 ~ 36.18 25.54 ^638 34.70
隱5 5g_67 57.45 53—56 47,35 46'85 5177^.......................................................................................a050.......................75.20..........................6838...........................68.26...........................6i43...........................Wm...........................68J9—
^1?J0(F 83.57— 84,02 — 82.04 78.64 ^75.09 80.67NIP519-47X 0^010^ 16.57— 748 — 10^59 17 仍 10.39^ 12.42
—0.025 — 13.20 ^10.25 7,61 ^13'26 ^18^^ 12.59...............................................................................~omo~ —石 y ——t2；4Q—■ —ΓΓ92— ~.......?Ζ?2——13J6.............................1aiF^
OJOO 10.13 10.52 11.59 17'88 24.72 14.97
[0305]如圖14、表9和表10所示，在一些實(shí)施方案中，例如，在0.05g/L的吸附劑夾雜水平下，本發(fā)明顯示超過(guò)70%螯合值的最佳功效并在0.10g/L下達(dá)到接近90%的螯合。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明規(guī)定使用甲基丙烯酸合成的MIP/NIP比使用2-乙烯基吡啶合成的MIP/NIP對(duì)于葚孢菌素類似物的吸附(例如，膠霉毒素和5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅模板(例如，當(dāng)在pH 4.0下以0.0^/1至0.lg/L的夾雜率而加入時(shí)))更有利。然而，對(duì)于制備的任何制劑，MIP和NIP之間的差異為最小的，除了在低溫和UV引發(fā)聚合下合成的NIP隨著吸附劑夾雜水平，其吸附值增加了 10%至15%。
[0306]表10.在pH 4的檸檬酸鹽緩沖液介質(zhì)中NIP和MIP在四種不同的夾雜率下對(duì)葚孢菌素模板的體外等溫吸附特征
[0307]
I * Λ NIP MIPI NIPI MIPNIP
#519-99 #519-98#519-1OX #519-101#519-47X
47.207 ± 46J02 ±34^703 ±| 39J37±12.416 ±
' 9 J 59__8.2977,8375.229__4'197
TTTI 64.404 士 61.882 土52.774 ± 60.331 ±12.585 ±
7.894 6^9835.517 8.1364.101
n 謂 79.720 士^^77.594 土68.186 土 73.087 土10J73 土
' 6.683 7.0474.3% 2—6713.817
89.309 土的.329 土80.671 土I 87.912 土' 14.967 ±
I 1.858 3.702j 3.767| 2.3756.288
[0308]實(shí)施例19
[0309]不同MIP和NIP的親合力以及對(duì)葚孢菌素類似物的特異性特征
[0310]在進(jìn)行本發(fā)明實(shí)施方案的過(guò)程中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)在作為用于熱引發(fā)沉淀聚合的溶劑的甲苯中合成的不同NIP/MIP的親合力。本文使用制備的MIP以描述葚孢菌素類似物(例如，膠霉毒素和5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅模板)的螯合親合力的差異并評(píng)價(jià)物質(zhì)的特異性。將量為30mg的MIP放置在裝備有硅烷化的聚乙烯固相提取熔塊的SEP-PAK柱中。硅烷化的玻璃小瓶用于確保分析物在水性溶劑中的穩(wěn)定性并防止分析物和玻璃小瓶之間的任何非特異性相互作用?；诒绢I(lǐng)域通常使用的方法，將硅烷化方法應(yīng)用于尼龍和PTFE/PE過(guò)濾器和管。與不含MIP物質(zhì)的空白樣品和僅含待測(cè)試的5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板或膠霉毒素的陽(yáng)性對(duì)照一起進(jìn)行制備。通過(guò)將ImL的5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板或膠霉毒素溶液過(guò)濾經(jīng)過(guò)30mg物質(zhì)來(lái)制成固相提取類(SPE類)過(guò)濾設(shè)備，以用于當(dāng)量為0.lg/L的MIP夾雜。小瓶和過(guò)濾器通過(guò)使用硅烷化試劑(SURFASIL，參見(jiàn)例如，實(shí)施例9)填充它們或浸潰它們而制備。使SPE類過(guò)濾設(shè)備負(fù)載有以2，OOOppb單一濃度而使用的5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅模板或膠霉毒素的ImL溶液。與樣品一起，保持控制處理溶液。伴隨間歇震動(dòng)，在37°C下將樣品和對(duì)照均孵育2分鐘。在孵育期后，將樣品推出注射器并在15mL離心管中收集并在10，OOOOg下離心10分鐘。將上層清液收集進(jìn)入琥珀色且硅烷化的HPLC小瓶并進(jìn)行分析。為評(píng)價(jià)靶分子解吸的特異性，在包含MIP聚合物的物質(zhì)上進(jìn)行六步洗滌步驟。在15mL的離心管中收集各個(gè)洗滌并在HPLC分析之前在10，OOOOg下離心10分鐘。使用增加濃度的有機(jī)溶劑進(jìn)行六次洗滌,其包括使用50mM檸檬酸鹽緩沖液洗滌的第一次洗滌和分別使用20%、40%、60%、80%、100%甲醇的水(v/v)的五次連續(xù)洗滌。實(shí)驗(yàn)使用前面熱引發(fā)沉淀聚合的MIP#519-98和#519-101以及NIP#519-99和#519-10X(粉末形式)連同在低溫和UV聚合下生成的標(biāo)識(shí)為#519-47和#519-47X的MIP和NIP的結(jié)晶形式(參見(jiàn)例如，實(shí)施例5)。將上層清液收集進(jìn)入琥珀色且硅烷化的HPLC小瓶中，防止真菌毒素或模板與小瓶的任何相互作用，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，從與光電二極管陣列檢測(cè)器信號(hào)連接的HPLC (Alliance，Waters Corp.，Milford, MA, USA)進(jìn)行計(jì)算(例如，以檢測(cè)真菌毒素和分離的真菌毒素的量)。使用乙腈/醋酸/三氟醋酸(34.9: 65: 0.1, v/v)的混合物作為流動(dòng)相進(jìn)行膠霉毒素的HPLC分析。根據(jù)由乙腈/水/甲醇(45: 45: 10，v/v)的混合物組成的葚孢菌素分析的標(biāo)準(zhǔn)洗脫參數(shù)來(lái)選擇用于檢測(cè)5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板的HPLC方法。使用全波長(zhǎng)掃描在U.V.光電二極管陣列上進(jìn)行檢測(cè)(268.1nm產(chǎn)生膠霉毒素的最佳信號(hào)；258.8nm產(chǎn)生模板的最佳信號(hào))。
[0311]結(jié)果表明(參見(jiàn)圖15和表11)與各自用于吸附膠霉毒素的NIP#519_10X和#519-99相比，當(dāng)使用40%的甲醇洗滌時(shí)，MIP#519-101和#519-98具有較低的解吸值。然而，包含大于60%的甲醇的洗滌能夠去除幾乎全部量的螯合的膠霉毒素。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)將使用20%的甲醇的洗滌應(yīng)用于體系時(shí)，使用2-乙烯基吡啶單體合成的MIP#519-101 具有比相應(yīng)的 NIP#519-10X 和 NIP#519_99、MIP#519_98、NIP#519_47X 和 MIP519-47更高的特異性。聚合物519-47X和519-47不能夠吸附大于25%的膠霉毒素。緩沖液洗漆的應(yīng)用能夠去除任何吸附的膠霉毒素。
[0312]結(jié)果表明(參見(jiàn)圖16和表11)與各自的NIP#519_10X相比，當(dāng)使用20%和40%的甲醇洗滌時(shí)MIP#519-101具有較低的解吸值。然而，MIP#519-98和NIP#519-99的特異性與用于吸附5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅模板的特異性相比沒(méi)有差別。然而，包含大于60%的甲醇的洗滌能夠去除幾乎全部量的螯合的5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板。在一些實(shí)施方案中并如使用膠霉毒素所發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)將使用20%和40%的甲醇洗滌應(yīng)用于體系時(shí)，使用2-乙烯基吡啶單體合成的MIP#519-101比相應(yīng)的NIP#519_10X和NIP#519-99、MIP#519-98、NIP#519-47X 和 MIP 519-47 具有更高的特異性。聚合物 519-47X和519-47表現(xiàn)出有利于MIP化合物的螯合特異性差異。然而，盡管5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板的吸附低于50%，但其比使用膠霉毒素的觀察值表現(xiàn)出更好的親和力，其顯示出對(duì)5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板的MIP的更好特異性。
[0313]表11.在0.1 %水平的吸附劑夾雜下在SPE配置中在pH 4.0下3個(gè)MIP、3個(gè)NIP對(duì)5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅模板和膠霉毒素的吸附性質(zhì)以及對(duì)使用檸檬酸鹽緩沖液(溶液A)和甲醇(溶液B)的混合物滴定的甲醇洗滌的生存
[0314]
吸爾細(xì):: 平均W分比吸附::
_ ―夢(mèng) fA:100%| A: 80% I A; 60% A: 40% A: 20% A; 0%
常評(píng)__m B: 0% B: 20% I B: 40% B: 60% B; 80% [B: 100%
—__ 肢霉毒素(％吸附) __
NIP519-10X 99.3±0.6 |99.3鐵67J±L9 47'7士 1.4 |-0.3士2:0 0'8土1.6 |-0.8±1.2~
M1P519-101 99.9±0.3 99.9±M 99,9±0,d 55.5土0.1 8J土2.0 -4.6±3T -5.1^8.7
ΝΙΡ5Ι9-99 99.0±0.4 98^2±0.4 "gQ3±j^ $0.7±2.8 4.0±2.5 -8.4土6.1 -7.6±m(xù)
MIPS 19-98 99.1±0.4 99MO3 78.5±0.4_ 443±22 Ι5.4±?2 -9,6±Τ?~ -6.1±7.7~
—Ν1Ρ555-47Χ— ?]...........'7ii6±6J ?.7?]
ΜΙΡ5?9-47 玉土 2:6
__5-氯-6 7-二甲氧基-1 -甲基靛紅模板(％吸附)_
ΝΙΡ519-10Χ 9ij±0j'''[98^T^0]86.5±0^2.....593±Γ.1 Γ_γ^8±γ^''Γ39 J±Q ^Τ'19^5±γ^
ΜΙΡ519-10丨 99_9±0.1 99.4±0,6—94^8?θΤ 72.牡0.1 -0,2±1.3 -2.2±1.5 -15.3±L5
NIP555-99 99.0±0J 97J±0?I 9Q^S±oT 65^2±0^-:L85±1
MIPS 19-98 I 98.8 士 O |見(jiàn)2 士 0.3丨 89.2 土 0:7 55.1 士 0.6 丨9.35 土】-7.9±0.4 |-8.0 土 3.3
[0315]
NIP555-47X 丨 44.8士5.6 丨33.0土0.8丨 9.7士3.9 6.2士0.9 卜29.7±0.1丨-Π.5士1.4 卜9.3士3,
MIPS19-47 48.7土7.0 [44.7±0.6| 28.2土0.6 [-17.1±0.8 丨-20.1土2.l|-21.3i:13.6|-24.1±3.4|
[0316]實(shí)施例20
[0317]MIP對(duì)真菌毒素的螯合能力-應(yīng)用于葚孢菌素
[0318]對(duì)于葚抱菌素(AgResearchLimited, Ruakura Research Centre, Hamilton, NewZealand)，測(cè)試使用2_乙烯基吡啶單體的甲苯(參見(jiàn)例如，實(shí)施例15)制備的MIP聚合物通過(guò)化學(xué)相互作用從液體或半液體介質(zhì)中去除葚孢菌素(A 93% ;B、D、E 2至17% )真菌毒素的能力。制備的MIP用于表征螯合親合力以評(píng)價(jià)物質(zhì)的特異性。通過(guò)稱重50mg和400mg的MIP物質(zhì)進(jìn)入Schott瓶并在介質(zhì)中加入10mL的給定0.5g/L和4.0g/L吸附劑夾雜率的葚孢菌素混合物處理溶液來(lái)進(jìn)行螯合實(shí)驗(yàn)。與不含MIP物質(zhì)的空白樣品和僅含葚孢菌素的陽(yáng)性對(duì)照一起進(jìn)行制備。在調(diào)整至PH6.0的50mM琥珀酸鹽緩沖液中進(jìn)行螯合試驗(yàn)以滿足瘤胃隔室的生理學(xué)條件。保持在37°C的溫度下，在150rpm下在軌道旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器上將所有樣品孵育90分鐘。使用體系500ppb、l，OOOppb,2, OOOppb測(cè)試三種最終濃度的葚孢菌素。在孵育后，將制劑在10，OOOrpm下離心10分鐘。將上層清液收集進(jìn)入HPLC小瓶中，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從與UV檢測(cè)器信號(hào)連接的HPLC進(jìn)行計(jì)算(例如，以檢測(cè)真菌毒素很和分離的真菌毒素的量)。用于檢測(cè)葚孢菌素的HPLC方法使用乙腈/水/甲醇(45: 45: 10,v/v)的混合物以進(jìn)行分析物和C18柱(4.6mmX25cm)的洗脫。在U.V.檢測(cè)器上進(jìn)行檢測(cè)(280nm產(chǎn)生葚孢菌素的最佳信號(hào))。
[0319]在500ppb、l, OOOppb 和 2，OOOppb 下，MIP#519_98 產(chǎn)物對(duì) 0.5g/L 夾雜率的吸附為80.5%至85.7%，并且當(dāng)在4g/L夾雜率的葚孢菌素下進(jìn)行使用時(shí)，吸附大于98.5% (參見(jiàn)例如，表12)。重復(fù)幾次之間的吸附變化小于I %。在0.5g/L的夾雜率下能觀察到輕微的飽和效應(yīng)，整個(gè)研究的葚孢菌素范圍中獲得吸附值的下降。
[0320]表12.在0.5g/L和4.0g/L的夾雜率下MIP#519_98對(duì)3種濃度的葚孢菌素的吸附功效
[0321]
^^I
I 500ppb I 1,000 ppb I 2,000 ppb
[0322]
0:0585.65 士 0.87 I 84:03 士 0.70 [ 80:5] ±1:37
[0323]上述說(shuō)明書中提及的所有公開和專利均通過(guò)引用并入本文。本發(fā)明所描述組合物和方法的各種修改和變型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)，而不違背本發(fā)明范圍和實(shí)質(zhì)。盡管結(jié)合特別優(yōu)選的實(shí)施方案描述本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過(guò)度局限于這類特定實(shí)施方案。實(shí)際上，意圖將對(duì)相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的用于進(jìn)行本發(fā)明所描述方式的各種修改包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.組合物，其包含使用真菌毒素模板；和一種或多種單體和一種或多種交聯(lián)劑合成的分子印跡聚合物，所述真菌毒素模板選自5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅、3-羥基-6，7- 二甲氧基-2-吲哚酮-3-甲酸乙酯、6，7- 二甲氧基靛紅和6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述一種或多種單體選自2-乙烯基吡啶、2-羥基乙基甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述一種或多種交聯(lián)劑包含二甲基丙烯酸乙二醇酯。
4.組合物，其包含使用真菌毒素模板合成的分子印跡聚合物，所述真菌毒素模板選自5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅、3-羥基-6，7- 二甲氧基-2-吲哚酮-3-甲酸乙酯、6，7- 二甲氧基青定紅和6，7- 二甲氧基-1-甲基青定紅。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述分子印跡聚合物通過(guò)以下制備:提供真菌毒素模板與一種或多種單體和一種或多種交聯(lián)劑；以及在允許所述一種或多種單體和所述一種或多種交聯(lián)劑在存在所述模板時(shí)聚合的條件下，使所述真菌毒素模板與所述一種或多種單體和所述一種或多種交聯(lián)劑接觸。
6.制備分子印跡聚合物的方法，其包括: a)提供: 1.真菌毒素模板；和 ?.一種或多種單體和一種或多種交聯(lián)劑；以及 b)在允許所述一種或多種單體和所述一種或多種交聯(lián)劑在存在所述真菌毒素模板時(shí)聚合的條件下，使所述真菌毒素模板與所述一種或多種單體和所述一種或多種交聯(lián)劑接觸，所述真菌毒素模板選自5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅、3-羥基-6，7- 二甲氧基-2-吲哚酮-3-甲酸乙酯、6，7- 二甲氧基靛紅和6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述一種或多種單體選自2-乙烯基吡啶、2-羥基乙基甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述一種或多種交聯(lián)劑包含二甲基丙烯酸乙二醇酯。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中在55攝氏度至110攝氏度的溫度下，通過(guò)在有機(jī)溶劑中形成自由基引發(fā)所述聚合。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中通過(guò)偶氮異丁腈(AIBN)的熱引發(fā)分解而形成所述自由基。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑選自甲苯、環(huán)己烷、乙腈、聚乙烯醇(PVA)/水溶液以及甲苯、環(huán)己烷、乙腈和PVA/水溶液中的兩種或更多種的混合物。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述溫度為55攝氏度至75攝氏度。
13.如權(quán)利要求6所述的方法，其中在所述一種或多種單體和所述一種或多種交聯(lián)劑聚合之后，從所述分子印跡聚合物中去除所述真菌毒素模板。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中利用由選自有機(jī)溶劑、緩沖液、水及其組合的溶液的一次或多次洗滌從所述分子印跡聚合物中去除所述真菌毒素模板。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述有機(jī)溶劑選自乙醇、甲醇、乙腈、甲苯及其混合物。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述緩沖液為通過(guò)使氫氧化鈉、檸檬酸、琥珀酸和醋酸反應(yīng)而制備的緩沖液。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述水為去離子水。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中在所述一次或多次洗滌后干燥所述分子印跡聚合物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中利用將所述分子印跡聚合物暴露于20攝氏度至90攝氏度的溫度來(lái)干燥所述分子印跡聚合物。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述溫度為60攝氏度至80攝氏度。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述溫度為75攝氏度至80攝氏度。
22.從材料中螯合真菌毒素的方法，其包括: a)提供: i)包含真菌毒素的材料；和 ?)在真菌毒素模板的存在下通過(guò)聚合一種或多種單體和一種或多種交聯(lián)劑而生成的分子印跡聚合物，所述真菌毒素模板選自5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅、3-羥基-6，7- 二甲氧基-2-吲哚酮-3-甲酸乙酯、6，7- 二甲氧基靛紅和6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅；以及 b)在允許所述分子印跡聚合物與所述真菌毒素結(jié)合的條件下，使所述分子印跡聚合物與所述包含真菌毒素的材料接觸。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述方法從所述材料中螯合赭曲霉素A。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述方法從所述材料中螯合葚孢菌素。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述包含真菌毒素的材料選自飲料、食品、動(dòng)物飼料、藥物組合物、營(yíng)養(yǎng)品組合物、化妝品組合物和維持生命所必需的物質(zhì)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述維持生命所必需的物質(zhì)選自在水產(chǎn)業(yè)中使用的培養(yǎng)基和包含氧氣的氣體樣品。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中與真菌毒素結(jié)合的分子印跡聚合物未與所述包含真菌毒素的材料分離。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其還包括c)從所述包含真菌毒素的材料中分離與真菌毒素結(jié)合的分子印跡聚合物。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述分離包括從所述包含真菌毒素的材料中提取、濃縮和隔離所述與真菌毒素結(jié)合的分子印跡聚合物。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述分離發(fā)生在色譜或分離柱或筒中。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中分離后，通過(guò)洗滌從所述分子印跡聚合物中去除與所述分子印跡聚合物結(jié)合的真菌毒素。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中在從所述分子印跡聚合物中去除之后，定性和定量分析所述真菌毒素。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中將所述定量和定性分析用于溯源。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其中將所述已經(jīng)去除真菌毒素的分子印跡聚合物再使用以從包含真菌毒素的材料中螯合真菌毒素。
35.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述分子印跡聚合物吸附比其重量大I至10倍的水。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述分子印跡聚合物吸附比其重量大I至5倍的水。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述分子印跡聚合物吸附比其重量大I至2倍的水。
38.如權(quán)利要求22所述的方法，其中使兩種或更多種不同的分子印跡聚合物與所述包含真菌毒素的材料接觸以從所述材料中螯合兩種或更多種特定的真菌毒素。
39.用于合成5-氯-6，7-二甲氧基-1-甲基親紅的方法，其包括: a)將2，3-二甲氧基苯甲酸轉(zhuǎn)化為2，3- 二甲氧基-N-叔丁氧基羰基苯胺； b)將2，3-二甲氧基-N-叔丁氧基擬基苯胺轉(zhuǎn)化為2，3- 二甲氧基苯胺； c)使2，3-二甲氧基苯胺與酮基丙二酸二乙酯反應(yīng)以形成6，7-二甲氧基-3-羥基-3-(2-吲哚酮)-甲酸乙酯；d)將6，7-二甲氧基-3-羥基-3- (2-吲哚酮)-甲酸乙酯轉(zhuǎn)化為6，7- 二甲氧基靛紅； e)將6，7-二甲氧基靛紅轉(zhuǎn)化為6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅；以及 f)將6，7-二甲氧基-1-甲基靛紅轉(zhuǎn)化為5-氯-6，7- 二甲氧基-1-甲基靛紅。
【文檔編號(hào)】C08J9/26GK104190378SQ201410359900
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2009年8月27日
【發(fā)明者】亞歷克桑德斯.伊安尼克里斯, 斯蒂凡.奎特闊斯基, 麻奴吉.寶佳帕.庫(kù)杜鮑捷, 克萊頓.馬特尼 申請(qǐng)人:全技術(shù)公司