一種低粘度、高純度酵母甘露聚糖的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種低粘度、高純度酵母甘露聚糖的制備方法，以釀酒酵母細(xì)胞壁為原料，采用水提醇沉法，得到粗品酵母甘露聚糖，經(jīng)中性蛋白酶和鏈霉蛋白酶酶解并離心，再加工即得。本發(fā)明通過(guò)將二次酶解、離心、超濾和噴霧干燥技術(shù)相結(jié)合，所采用的設(shè)備均可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，所得的酵母甘露聚糖純度大于90％，粘度低且為牛頓流體，在實(shí)際應(yīng)用中不會(huì)影響體系的流變學(xué)特性。
【專利說(shuō)明】一種低粘度、高純度酵母甘露聚糖的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酵母甘露聚糖的制備，具體地說(shuō)，涉及一種低粘度、高純度酵母甘露聚 糖的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 酵母甘露聚糖是酵母細(xì)胞壁多糖的一種，約占酵母細(xì)胞壁干重的40%，由主鏈和 側(cè)鏈構(gòu)成，主鏈由多個(gè)甘露糖分子以α-1，6鍵連接形成，主鏈上連接有以α-1，2或α-1，3 鍵連接的甘露糖側(cè)鏈，它通過(guò)〇-糖肽鍵和N-糖肽鍵與蛋白質(zhì)連在一起，由5 %?20 %蛋白 質(zhì)、80%?90%的甘露糖組成其分子質(zhì)量約為20KDa?200KDa。甘露聚糖具有多種免疫學(xué) 功能，可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)免疫、結(jié)合或者吸附霉菌毒素、抗氧化等，具有廣闊的應(yīng) 用前景。
[0003] 酵母甘露聚糖在酵母細(xì)胞壁中以共價(jià)鍵形式與蛋白質(zhì)相連，粗提取得到的甘露聚 糖含有較多的蛋白質(zhì)，純度較低，采用適當(dāng)?shù)姆椒ń档偷鞍踪|(zhì)含量是制備高純度酵母甘露 聚糖的關(guān)鍵，目前，除蛋白的方法主要有：Sevage法、三氯乙酸法和氯化鈣法等，然而，這些 方法存在如下問(wèn)題：蛋白去除率高而多糖保留率低、有機(jī)溶劑引入和殘留、水相體系不適 用，不利于酵母甘露聚糖純度的提升。
[0004] 國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的酵母甘露聚糖主要為含量20%?50%的規(guī)格，價(jià)格較低，且低純度限 制了酵母甘露聚糖的廣泛應(yīng)用，因此，研究開(kāi)發(fā)一種提高酵母甘露聚糖純度的方法，對(duì)于提 高酵母甘露聚糖產(chǎn)品附加值，滿足市場(chǎng)需求具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0005] 多糖溶液的流變特性對(duì)于被應(yīng)用的食品來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，會(huì)直接影響到該食品的感 官品質(zhì)，所以在開(kāi)發(fā)食品要選擇一種膠體時(shí)，該膠體的流變特性是需要首先考慮的因素。不 同純度的酵母甘露聚糖，其粘度差別較大，對(duì)應(yīng)用體系的影響不同，如何做到不改變體系流 變學(xué)性質(zhì)，而又能夠發(fā)揮酵母甘露聚糖的功能特性就顯得至關(guān)重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種高純度酵母甘露聚糖 的制備方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] -種低粘度、高純度酵母甘露聚糖的制備方法，以釀酒酵母細(xì)胞壁為原料，采用水 提醇沉法，得到粗品酵母甘露聚糖，先經(jīng)中性蛋白酶酶解，并在磷酸緩沖液保護(hù)下，進(jìn)行鏈 霉蛋白酶酶解并多次離心，再加工即得。
[0009] 本發(fā)明技術(shù)方案所得的低粘度、高純度酵母甘露聚糖產(chǎn)品為白色松軟的棉絮狀固 形物。
[0010] 進(jìn)一步地，所述制備方法具體包括如下步驟：
[0011] (1)以釀酒酵母細(xì)胞壁為原料，采用水提醇沉法，得到粗品酵母甘露聚糖I (純度 在8〇%以下）；
[0012] (2)采用去離子水，將步驟（1)所得粗品酵母甘露聚糖配制成溶液；
[0013] (3)向步驟⑵所得溶液中加入中性蛋白酶neutrase，進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后，進(jìn) 行滅酶，得粗品酵母甘露聚糖的一次酶解液；
[0014] (4)將步驟（3)所得的一次酶解液進(jìn)行離心處理；
[0015] (5)取步驟（4)所得上清，加入乙醇進(jìn)行醇沉，離心收集沉淀，得粗品酵母甘露聚 糖II ;
[0016] (6)取步驟（5)所得沉淀，加入磷酸鹽緩沖液配制成溶液，采用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH 值至7. 5?8. 0 ;
[0017] (7)取步驟（6)所得溶液，加入鏈霉蛋白酶，進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后，進(jìn)行滅酶，得 粗品酵母甘露聚糖的二次酶解液；
[0018] (8)將步驟（7)所得二次酶解液進(jìn)行離心處理；
[0019] (9)取步驟（8)所得上清，加入乙醇進(jìn)行醇沉，離心收集沉淀；
[0020] (10)將步驟（9)所得沉淀采用去離子溶解，攪拌均勻至分散完全，將所述溶液采 用超濾除鹽，收集所得截留液；
[0021] (11)將步驟（10)所得的截留液進(jìn)行噴霧干燥，即得低粘度、高純度酵母甘露聚糖 III。
[0022] 其中，所述步驟（1)中，采用熱水浸提法提取粗品酵母甘露聚糖。
[0023] 其中，所述步驟（2)中，采用去離子水，將步驟（1)所得粗品酵母甘露聚糖配制成 15% w/v的溶液。
[0024] 其中，所述步驟（3)中，中性蛋白酶的添加量為粗品酵母甘露聚糖中蛋白含量的 0.05 %，酶解溫度為45°C，酶解時(shí)間為2h。
[0025] 其中，所述步驟（4)中，離心轉(zhuǎn)速為4000?5000rpm，離心時(shí)間為5?lOmin。
[0026] 其中，所述步驟（5)中，乙醇的用量為所得上清的二倍體積，離心轉(zhuǎn)速為4000? 5000rpm，離心時(shí)間為10?20min。
[0027] 其中，所述步驟（6)中，所述溶液濃度為15% w/v，磷酸鹽緩沖液的濃度為 0· 02M ?0· 2M，pH 為 7. O ;NaOH 濃度為 0· 01M。
[0028] 其中，所述步驟（7)中，鏈霉蛋白酶的添加量為粗品酵母甘露聚糖中蛋白含量的 0. 05%，酶解溫度為40°C，酶解時(shí)間為8h。
[0029] 其中，所述步驟（8)中，離心轉(zhuǎn)速為4000?5000rpm，離心時(shí)間為5?lOmin。
[0030] 其中，所述步驟（9)中，乙醇的用量為所得上清的三倍體積，離心轉(zhuǎn)速為4000? 5000rpm，離心時(shí)間為10?20min。
[0031] 其中，所述步驟（10)中，超濾采用的條件分別為分子量截留為IOkDa的超濾膜、操 作壓力為20?25psi、料液濃度為4%?6%、操作溫度為常溫。
[0032] 其中，所述步驟（11)中對(duì)截留液進(jìn)行噴霧干燥處理。
[0033] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0034] 1、工藝操作簡(jiǎn)便，對(duì)比之前通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜柱純化的方法，通過(guò)酶解偶聯(lián)離心， 能夠快速的提高酵母甘露聚糖的純度，降低其蛋白質(zhì)的含量，所需時(shí)間短且一次所得樣品 量大。
[0035] 2、本發(fā)明提高酵母甘露聚糖純度的方法采用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行溶液的配制，最大 程度上保證在調(diào)節(jié)pH的過(guò)程中，多糖原有的結(jié)構(gòu)不受破壞。
[0036] 3、本發(fā)明提高酵母甘露聚糖純度的方法采用酶解離心偶聯(lián)；其蛋白脫除率高，多 糖損失少。通過(guò)離心處理能脫除溶液中原有的以及兩次酶解液中的雜質(zhì)，更大程度上提高 了樣品的純度，且可以減少鏈霉蛋白酶酶解所需時(shí)間，相對(duì)于傳統(tǒng)Sevage法等，具有環(huán)保、 高效、安全等優(yōu)點(diǎn)，適合規(guī)?；a(chǎn)的要求。
[0037] 4、本發(fā)明提高酵母甘露聚糖純度的方法應(yīng)用二次酶解、多次離心、超濾和噴霧干 燥技術(shù)相結(jié)合，所采用的設(shè)備均可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0038] 5、本發(fā)明過(guò)程中，共涉及三種純度的酵母甘露聚糖，與酵母甘露聚糖I和II粘度 較高，且為假塑性流體，而最終所得酵母甘露聚糖粘度低、純度高大于90%，且為牛頓流體， 能夠應(yīng)用與食品體系中，改善其功能性質(zhì)而不影響體系原有的流變學(xué)特性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為本發(fā)明所述一種高純度酵母甘露聚糖的制備方法的流程示意圖。
[0040] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中不同純度酵母甘露聚糖溶液的流變學(xué)特性對(duì)比。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0042] 以下實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0043] 以下實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0044] 以下實(shí)施例中的酵母細(xì)胞壁購(gòu)自浙江深友生物技術(shù)有限公司。
[0045] 以下實(shí)施例每步驟的數(shù)據(jù)處理都是采用DPS軟件完成的。
[0046] 實(shí)施例1
[0047] -種高純度酵母甘露聚糖的制備方法，經(jīng)過(guò)以下工藝步驟（如圖1所示）：
[0048] (1)以釀酒酵母細(xì)胞壁為原料，采用水提醇沉法，制備粗品酵母甘露聚糖I (純度 為 76. 60% );
[0049] (2)對(duì)步驟（1)得到的粗品酵母甘露聚糖，加入去離子水溶解，攪拌至分散均勻， 使粗品酵母甘露聚糖溶液最終濃度為15% (w/v);
[0050] (3)用中性蛋白酶neutrase對(duì)步驟⑵所得的溶液進(jìn)行酶解處理，中性蛋白酶 neutrase的用量為步驟（1)所得粗品酵母甘露聚糖中蛋白質(zhì)含量的0. 05%，酶解溫度與時(shí) 間分別為45°C、2h ;
[0051] (4)對(duì)步驟⑶中所得酶解液進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間分別為4000rpm、IOmin ;
[0052] (5)取步驟（4)所得上清，加入二倍體積乙醇進(jìn)行醇沉，4000rpm離心20min收集 沉淀，得粗品酵母甘露聚糖II ;
[0053] (6)取步驟（5)所得沉淀，加入0· 02M、pH7. 0的磷酸鹽緩沖液配制成15% (w/v) 的溶液，用〇· OlM的NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 8 ;
[0054] (7)取步驟（6)所得溶液，加入鏈霉蛋白酶進(jìn)行酶解處理，鏈霉蛋白酶的用量為 步驟（1)所得的粗品酵母甘露聚糖中蛋白質(zhì)含量的0.05%，酶解溫度與時(shí)間分別為40°C、 8h ；
[0055] (8)對(duì)步驟（7)中所得酶解液進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間分別為4000rpm、20min ;
[0056] (9)收集步驟（8)中經(jīng)離心后的上清，加入三倍體積的乙醇進(jìn)行醇沉，離心收集沉 淀，離心的轉(zhuǎn)速與時(shí)間分別為4000rpm、20min ;
[0057] (10)用去離子水溶解步驟（9)收集的沉淀，采用超濾技術(shù)除鹽，操作壓力為 20psi，料液濃度為4%，操作溫度為常溫。
[0058] (11)收集步驟（10)所得截留液，進(jìn)行噴霧干燥處理，即得純度較高的酵母甘露聚 糖 III。
[0059] 本實(shí)施例得到的酵母甘露聚糖為白色松軟的棉絮狀固形物，經(jīng)酶解離心偶聯(lián)處理 后，得到的酵母甘露聚糖的純度可達(dá)90. 20%，蛋白質(zhì)含量6. 33%，與酵母甘露聚糖I、II 相比，酵母甘露聚糖III的純度得到了顯著的提升、粘度顯著下降（p< 0.05)，并由假塑性流 體變?yōu)榕ｎD流體（見(jiàn)圖2)。
[0060] 實(shí)施例2
[0061] 一種高純度酵母甘露聚糖的制備方法，經(jīng)過(guò)以下工藝步驟（如圖1所示）：
[0062] (1)以釀酒酵母細(xì)胞壁為原料，采用水提醇沉法，制備粗品酵母甘露聚糖I (純度 為 77. 75% );
[0063] (2)對(duì)步驟（1)得到的粗品酵母甘露聚糖，加入去離子水溶解，攪拌至分散均勻， 使粗品酵母甘露聚糖溶液最終濃度為15% (w/v);
[0064] (3)用中性蛋白酶neutrase對(duì)步驟⑵所得的溶液進(jìn)行酶解處理，中性蛋白酶 neutrase的用量為步驟（1)所得粗品酵母甘露聚糖中蛋白質(zhì)含量的0. 05%，酶解溫度與時(shí) 間分別為45°C、2h ;
[0065] (4)對(duì)步驟（3)中所得酶解液進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間分別為5000rpm、5min ;
[0066] (5)取步驟（4)所得上清，加入二倍體積乙醇進(jìn)行醇沉，5000rpm離心IOmin收集 沉淀，得粗品酵母甘露聚糖II ;
[0067] (6)取步驟（5)所得沉淀，加入0· 2M、pH7. 0的磷酸鹽緩沖液配制成15% (w/v)的 溶液，用〇· OlM的NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0 ;
[0068] (7)取步驟（6)所得溶液，加入鏈霉蛋白酶進(jìn)行酶解處理，鏈霉蛋白酶的用量為 步驟（1)所得的粗品酵母甘露聚糖中蛋白質(zhì)含量的0.05%，酶解溫度與時(shí)間分別為40°C、 8h ；
[0069] (8)對(duì)步驟（7)中所得酶解液進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間分別為5000rpm、IOmin ;
[0070] (9)收集步驟（8)中經(jīng)離心后的上清，加入三倍體積的乙醇進(jìn)行醇沉，離心收集沉 淀，離心的轉(zhuǎn)速與時(shí)間分別為5000rpm、10min ;
[0071] (10)用去離子水溶解步驟（9)收集的沉淀，采用超濾技術(shù)除鹽，操作壓力為 25psi，料液濃度為6%，操作溫度為常溫。
[0072] (11)收集步驟（10)所得截留液，進(jìn)行噴霧干燥處理，即得純度較高的酵母甘露聚 糖 III。
[0073] 本實(shí)施例得到的酵母甘露聚糖為白色松軟的棉絮狀固形物，經(jīng)酶解離心偶聯(lián)處理 后，得到的酵母甘露聚糖的純度可達(dá)93. 65 %，蛋白質(zhì)含量5. 07 %，見(jiàn)表1。與酵母甘露聚糖 I、II相比，酵母甘露聚糖III的純度得到了顯著的提升、粘度顯著下降（p < 0. 05)，并由假 塑性流體變?yōu)榕ｎD流體。
[0074] 表1酵母甘露聚糖的主要成分

【權(quán)利要求】
1. 一種低粘度、高純度酵母甘露聚糖的制備方法，其特征在于，所述制備方法具體包括 如下步驟： (1) 以釀酒酵母細(xì)胞壁為原料，采用水提醇沉法，得到粗品酵母甘露聚糖； (2) 采用去離子水，將步驟（1)所得粗品酵母甘露聚糖配制成溶液； (3) 向步驟（2)所得溶液中加入中性蛋白酶，進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后，進(jìn)行滅酶，得粗品 酵母甘露聚糖的一次酶解液； (4) 將步驟（3)所得的一次酶解液進(jìn)行離心處理； (5) 取步驟（4)所得上清，加入乙醇進(jìn)行醇沉，離心收集沉淀； (6) 取步驟（5)所得沉淀，加入磷酸鹽緩沖液配制成溶液，采用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至 7. 5 ?8. 0 ; (7) 取步驟（6)所得溶液，加入鏈霉蛋白酶，進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后，進(jìn)行滅酶，得粗品 酵母甘露聚糖的二次酶解液； (8) 將步驟（7)所得二次酶解液進(jìn)行離心處理； (9) 取步驟（8)所得上清，加入乙醇進(jìn)行醇沉，離心收集沉淀； (10) 將步驟（9)所得沉淀采用去離子溶解，攪拌均勻至分散完全，將所述溶液采用超 濾除鹽，收集所得截留液； (11) 將步驟（10)所得的截留液進(jìn)行噴霧干燥，即得低粘度、高純度酵母甘露聚糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)中，采用去離子水，將步 驟（1)所得粗品酵母甘露聚糖配制成15% w/v的溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（3)中，中性蛋白酶的 添加量為粗品酵母甘露聚糖中蛋白含量的〇. 05%，酶解溫度為45°C，酶解時(shí)間為2h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（4)中，離心轉(zhuǎn)速為4000? 5000rpm，離心時(shí)間為5?lOmin。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（5)中，乙醇的用量為所得 上清的二倍體積，離心轉(zhuǎn)速為4000?5000rpm，離心時(shí)間為10?20min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟￠)中，所述溶液濃度 為15% w/v，磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 02M?0. 2M，pH為7. 0 ;NaOH濃度為0. 01M。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（7)中，鏈霉蛋白酶的添加 量為粗品酵母甘露聚糖中蛋白含量的〇. 05%，酶解溫度為40°C，酶解時(shí)間為8h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（8)中，離心轉(zhuǎn)速為4000? 5000rpm，離心時(shí)間為5?lOmin。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（9)中，乙醇的用量為 所得上清的三倍體積，離心轉(zhuǎn)速為4000?5000rpm，離心時(shí)間為10?20min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（10)中，超濾采用的條件 分別為分子量截留為10kDa的超濾膜、操作壓力為20?25psi、料液濃度為4%?6%、操作 溫度為常溫。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK104403017SQ201410665920
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】王強(qiáng), 劉紅芝, 李亞楠, 石愛(ài)民, 劉麗, 胡暉, 林偉靜 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所