一種微生物發(fā)酵制備2,3-丁二醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工領域，具體涉及一種微生物發(fā)酵制備2, 3- 了二醇的方法。
【背景技術】
[0002] 2, 3-了二醇可W作為一種潛在的平臺化合物，替代傳統(tǒng)的平臺化合物，用于大規(guī) 模合成甲己麗(優(yōu)良溶劑）和1，3- 了二帰(廣泛應用于合成橡膠、聚醋和聚亞胺醋等領域)。 除此之外，2, 3- 了二醇還可用于制備油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑、軟化劑、增塑劑、炸藥及藥 物手性載體等，2, 3- 了二醇的氧化產物3-居基了麗和了二麗可作為食用香料使用；同時， 因其熱值較高，與己醇、甲醇相當，故可作為燃料添加劑；2, 3-了二醇醋化后可生成聚氨醋 泡沫的前體；2, 3-了二醇與己酸反應生成2, 3-了二醇二己酸醋，該醋可加到奶油中改善風 味；2, 3-了二醇在我國還被添加到白酒中，W改善白酒的風味。2, 3-了二醇脫氨變成雙己 醜，雙己醜在食品工業(yè)中作為一種具有很高價值的風味劑。2, 3- 了二醇的L型異構體可用 于抗凍劑。2, 3-了二醇醋化物能作為制作藥物和化妝品的前體。其它潛在的用途包括用于 制作墨水、增塑劑、濕潤劑。目前2, 3- 了二醇的合成主要采用W石油裂解物為來源的化學 法，但隨著石油資源的大量消耗和不可再生資源價格的節(jié)節(jié)攀升，發(fā)展環(huán)境友好的生物基 化學品的生物煉制技術已成為轉變經濟增長方式、保障生態(tài)鏈良性循環(huán)、實現(xiàn)經濟社會可 持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略需求。
[0003] 微生物發(fā)酵制備2, 3-了二醇的過程中，通常W葡萄糖作為碳源。葡萄糖來源廣 泛，并且能夠被眾多微生物利用，目前作為通用碳源，廣泛應用于各種發(fā)酵生產中。在W葡 萄糖為碳源，經生物轉化生產2, 3-了二醇過程中，除底物添加葡萄糖外，在發(fā)酵周期內還 需要進行葡萄糖補加，因此葡萄糖的消耗量較大。由于添加的葡萄糖并不能完全被微生物 利用，因此在發(fā)酵液中通常會產生部分殘留，通常濃度為5g/L。殘留的葡萄糖會對2, 3-了 二醇產品分離提純造成很大困難，主要表現(xiàn)在：葡萄糖水溶性好，通常與2, 3- 了二醇共同 存在與水相中，經常規(guī)的分離手段，難W高效脫除，從而影響2, 3-了二醇提取純度；葡萄糖 在加熱條件下，易與蛋白類大分子反應，生成有色度物質，影響2, 3-了二醇的品質；目前高 純度的2, 3-了二醇是經過減壓精傭獲得，但葡萄糖在高溫條件下會明顯的結焦現(xiàn)象，從而 減慢了 2, 3- 了二醇的蒸發(fā)速率，降低了 2, 3- 了二醇產品的收率。
[0004] 由于發(fā)酵液中殘留的葡萄糖難W有效去除，采用常規(guī)分離方式難W獲得高純度的 2, 3- 了二醇產品，因此近年來開發(fā)了雙水相萃取技術、沸石吸附技術用于2, 3- 了二醇產品 的分離。CN200710010203. 9公開了一種從發(fā)酵液中分離2, 3-了二醇的雙水相萃取方法，其 特征在于向2, 3-了二醇的發(fā)酵液中加入無機鹽和親水有機物形成新型雙水相，從而達到 萃取分離發(fā)酵液中2, 3- 了二醇的目的。CN200810024865. 6公開了一種利用疏水娃沸石吸 附分離發(fā)酵液中2, 3- 了二醇的方法，其特征在于將菌種發(fā)酵制得的2, 3- 了二醇發(fā)酵液預 處理后用疏水娃沸石對2, 3- 了二醇進行吸附，吸附后用無水己醇脫附，脫附液除去己醇后 得到2, 3- 了二醇。送些工藝雖然能夠通過不同方式，排除了葡萄糖對2, 3- 了二醇分離過 程的影響，但處理方式過程復雜，均不同程度的添加了有機溶劑，難W規(guī)模應用。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種微生物發(fā)酵制備2, 3-了二醇的方法。本 發(fā)明方法能夠有效脫除發(fā)酵液中葡萄糖的殘留，有利于下一步雙水相、精傭等精制方式的 實施，適用于大規(guī)模生產應用。
[0006] 本發(fā)明微生物發(fā)酵制備2, 3- 了二醇的方法，包括W下步驟： (1) 菌種培養(yǎng)：W MRS培養(yǎng)基進行乳桿菌的培養(yǎng)，獲得乳桿菌種子液；W LB培養(yǎng)基進行 克雷伯氏菌的培養(yǎng)，獲得克雷伯氏菌種子液； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)；在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入克雷伯氏菌種子液，進行微氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中流 加葡萄糖溶液使發(fā)酵體系中葡萄糖濃度控制在20g/L~40g/L ; (3) 發(fā)酵調控；在發(fā)酵末期將發(fā)酵液抑調至5~6,接入乳桿菌種子液，在低抑條件下 進行好氧發(fā)酵。
[0007] 本發(fā)明方法中，所采用的乳桿菌為干酪乳桿菌；所采用克雷伯氏菌為肺炎克雷伯 氏I未I。
[0008] 本發(fā)明方法中，種子液的培養(yǎng)過程如下；菌種保藏液與種子培養(yǎng)基的體積比為1 ; 100~1 ;500,在溫度為30°C~40°C，攬拌速度為10化pm~40化pm,抑值為6~7的條件 下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，培養(yǎng)過程中保持厭氧或微氧條件。
[0009] 本發(fā)明方法中，發(fā)酵過程如下；W葡萄糖為底物發(fā)酵，克雷伯氏菌種子液和發(fā)酵培 養(yǎng)基的體積比為1 ;8~1 ;20,培養(yǎng)溫度為30°C~40°C，攬拌速度為20化pm~50化pm, pH 值為6~7。
[0010] 本發(fā)明方法中，微氧發(fā)酵時通入流速小于0. 05vvm的空氣。
[0011] 本發(fā)明方法中，發(fā)酵初始葡萄糖底物濃度控制在50g/L~lOOg/L。發(fā)酵過程中，通 過流加形式補充濃度為200g/L~400g/L的葡萄糖溶液，使發(fā)酵體系中葡萄糖濃度控制在 20g/L ~40g/L。
[001引本發(fā)明方法中，在發(fā)酵末期W 5mol/L~lOmol/L硫酸將抑調至5~6,并加入乳 桿菌種子液，乳桿菌種子液和發(fā)酵液體積比為1 :8~1 ;20。發(fā)酵末期是指發(fā)酵培養(yǎng)進行 40h W后。
[001引本發(fā)明方法中，好氧發(fā)酵時通入流速為0. 5vvm~Ivvm的空氣。
[0014] 本發(fā)明通過發(fā)酵末期環(huán)境誘導、優(yōu)勢菌種的添加手段，能夠有效消耗發(fā)酵液中葡 萄糖的殘留量，降低了后續(xù)提取難度，能夠提高2, 3- 了二醇的收率，更有利于工業(yè)應用。與 現(xiàn)有技術相比，具有W下優(yōu)點： (1) 微生物對葡萄糖的攝取主要采用主動運輸?shù)姆绞?，細胞內葡萄糖的相對濃度較高。 當細胞自溶后，胞內富集的葡萄糖會從新進入發(fā)酵液中，因此經滅菌處理后，發(fā)酵液中葡萄 糖濃度通常要高于發(fā)酵結束時發(fā)酵液殘?zhí)菨舛?。本發(fā)明在發(fā)酵末期，通過低pH、高滲透壓等 調控的手段，提高發(fā)酵菌株的自溶率，使葡萄糖完全溶液溶解于發(fā)酵液中，從而加強了葡萄 糖的脫除效果； (2) 乳桿菌具有高效的葡萄糖代謝能力，并且能夠對低pH、高滲透壓進行較好的耐受。 本發(fā)明在發(fā)酵末期，通過乳桿菌的加入，W微生物代謝的方式，脫除發(fā)酵液中殘留的葡萄 糖，工藝簡單，操作簡便，效果明顯。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的效果，但不構成對本發(fā)明的限制。
[0016] 本發(fā)明實施例中，W Waters 2695分離系統(tǒng)與Waters 2414示差檢測器構成液相 分析系統(tǒng)，其中分離柱選用Aminex HPX-87H有機酸和醇分析柱用于酸類和醇類的分離。W 葡萄糖、玻巧酸、乳酸、己酸、2, 3-了二醇、己醇標準樣品建立標準圖譜，反應過程中定時測 量反應體系中葡萄糖的消耗情況、產物2, 3- 了二醇的積累情況。
[0017] 本發(fā)明實施例中，所用的菌種為克雷伯桿菌(必eAsieiia /we歴oniae )，來 自中國石化撫順石油化工研究院專利菌種，保藏編號為CGMCC N0.0 798 ;干酪乳桿菌 仏casei)來自中國石化撫順石油化工研究院專利菌種FY-04,保藏編號為 CGMCC NO. 3269O
[0018] 本發(fā)明實施例中，種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如表1所示。
[001引 親1培苯某配方 實她例i

(1)種子液培養(yǎng)；取液體保藏的克雷伯桿菌(必6知fieiia /wei/woniae)菌種保藏液2mL 加入SOOmL的LB培養(yǎng)基中，混合于IL種子罐中，進行種子液培養(yǎng)。培養(yǎng)條件控制為；培養(yǎng) 溫度為37C，攬拌速度設為20化pm,抑控制在7. 0,培養(yǎng)過程中保持微氧，培養(yǎng)1 Ih至對數(shù) 期。
[0020] 取液體保藏的干酪乳桿菌仏sctoAscWii/s casei)菌種保藏液2. 5血加入1000血 的MRS培養(yǎng)基中，混合于IL種子罐中，進行種子液培養(yǎng)。培養(yǎng)條件控制為；培養(yǎng)溫度為 35C，攬拌速度設為20化pm,抑控制在6. 0,培養(yǎng)過程中保持微氧，培養(yǎng)2化至對數(shù)期。
[0021] (2)發(fā)酵培養(yǎng)；采用間歇發(fā)酵模式，發(fā)酵罐體積選擇15L上罐體積為化。具體步 驟如下： 曰、分別取SOOmL克雷伯桿菌種子液加入到7. 2L發(fā)酵培養(yǎng)基中； b、發(fā)酵過程控制培養(yǎng)溫度為37°C，攬拌速度為20化pm,過程中W 30%Na0H調節(jié)抑，使其 控制為7,該過程保持微氧發(fā)酵； C、發(fā)酵過程中，通過液相分析系統(tǒng)，測量反應體系中葡萄糖的消耗情況，并及時通過流 加的方式加入葡萄糖，使其在反應體系中的濃度維持在30g/L水平。
[0022] (3)發(fā)酵開始4化后，用5mol/L硫酸將抑調至5,并加入IL干酪乳桿菌種子液， 并通入0. 5vvm空氣，進行好氧發(fā)酵。
[0023] 發(fā)酵4她結束，最終產物中2, 3- 了二醇濃度為82. 52g/l，葡萄糖0. lOg/L。
[0024] 實施例2 (1)種子液培養(yǎng)；取液體保藏的克雷伯桿菌(必6知fieiia /wei/woniae)菌種保藏液3mL 加入900mL的LB培養(yǎng)基中，混合于IL種子罐中，進行種子液培養(yǎng)。培養(yǎng)條件控制為；培養(yǎng) 溫度為37C，攬拌速度設為30化pm,抑控制在6. 5,培養(yǎng)過程中保持微氧，培養(yǎng)1化至對數(shù) 期。
[00巧]取液體保藏的干酪乳桿菌仏SCcasei)菌種保藏液6血加入1800血 的MRS培養(yǎng)基中，混合于2.化種子罐中，進行種子液培養(yǎng)。培養(yǎng)條件控制為；培養(yǎng)溫度為 35C，攬拌速度設為10化pm,抑控制在6. 0,培養(yǎng)過程中保持微氧，培養(yǎng)24h至對數(shù)期。
[0026] (2)發(fā)酵培養(yǎng)；采用間歇發(fā)酵模式，發(fā)酵罐體積選擇15L上罐體積為化。具體步 驟如下： 曰、分別取900mL克雷伯桿菌種子液加入到8. IL發(fā)酵培養(yǎng)基中； b、發(fā)酵過程控制培養(yǎng)溫度為37°C，攬拌速度為20化pm,過程中W 30%Na0H調節(jié)抑，使其 控制為7,該過程保持微氧發(fā)酵； C、發(fā)酵過程中，通過液相分析系統(tǒng)，測量反應體系中葡萄糖消耗情況，并及時通過流加 的方式加入葡萄糖，使其在反應體系中的濃度維持在30g/L水平。
[0027] (3)發(fā)酵開始4化后，用5mol/L硫酸將抑調至5. 5,并加入1.化干酪乳桿菌種子 液，并通入Ivvm空氣，進行好氧發(fā)酵。
[0028] 發(fā)酵50h結束，最終產物中2, 3- 了二醇濃度為92. 64g/l，葡萄糖0. 05g/L。
[0029] 比較例1 采用克雷伯氏菌單一菌種發(fā)酵，菌種培養(yǎng)及發(fā)酵過程控制與實施例1相同。發(fā)酵4她， 最終產物中2, 3- 了二醇濃度為83. 62g/l，葡萄糖6. 24g/L。
[0030] 比較例2 采用克雷伯氏菌單一菌種發(fā)酵，菌種培養(yǎng)及發(fā)酵過程控制與實施例2相同。發(fā)酵50h， 最終產物中2, 3- 了二醇濃度為93. 32g/l，葡萄糖5. 25g/L。
[00引]比較例3 種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)與實施例1相同。不同之處在于：發(fā)酵4化后，不經抑調節(jié)，直接 加入IL干酪乳桿菌種子液，并通入0. 5vvm空氣，進行好氧發(fā)酵。經4她，最終產物中2, 3-了 二醇濃度為83. 33g/l，葡萄糖3. 42g/L。
[00礎 比較例4 種子培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)與實施例1相同。不同之處在于：發(fā)酵4化后，用5mol/L硫酸將 抑調至5,但是不加干酪乳桿菌種子液，并通入0. 5vvm空氣，進行好氧發(fā)酵。經4她，最終產 物中2, 3- 了二醇濃度為81. 26g/l，葡萄糖9. 15g/L。
【主權項】
1. 一種微生物發(fā)酵制備2, 3- 丁二醇的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 菌種培養(yǎng)：以MRS培養(yǎng)基進行乳桿菌的培養(yǎng)，獲得乳桿菌種子液；以LB培養(yǎng)基進行 克雷伯氏菌的培養(yǎng)，獲得克雷伯氏菌種子液； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入克雷伯氏菌種子液，進行微氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中流 加葡萄糖溶液使發(fā)酵體系中葡萄糖濃度控制在20g/L~40g/L ; (3) 發(fā)酵調控：在發(fā)酵末期將發(fā)酵液pH調至5~6,接入乳桿菌種子液，在低pH條件下 進行好氧發(fā)酵。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所采用的乳桿菌為干酪乳桿菌；所采用克 雷伯氏菌為肺炎克雷伯氏菌。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于：種子液的培養(yǎng)過程如下：菌種保藏 液與種子培養(yǎng)基的體積比為1 :1〇〇~1 :500,在溫度為30°C~40°C，攪拌速度為lOOrpm~ 400rpm，pH值為6~7的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，培養(yǎng)過程中保持厭氧或微氧條件。4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：發(fā)酵過程如下：以葡萄糖為底物發(fā)酵，克 雷伯氏菌種子液和發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1 :8~1 :20,培養(yǎng)溫度為30°C~40°C，攪拌速度 為 200rpm ~500rpm，pH 值為 6 ~7。5. 根據(jù)權利要求1或4所述的方法，其特征在于：微氧發(fā)酵時通入流速小于0.05vvm的 空氣。6. 根據(jù)權利要求1或4所述的方法，其特征在于：發(fā)酵初始葡萄糖濃度控制在50g/L~ 100g/L。7. 根據(jù)權利要求1或4所述的方法，其特征在于：發(fā)酵過程中，通過流加濃度為200g/ L~400g/L的葡萄糖溶液，使發(fā)酵體系中葡萄糖濃度控制在20g/L~40g/L。8. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：在發(fā)酵末期以5mol/L~10m〇l/L硫酸將 pH調至5~6。9. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：乳桿菌種子液和發(fā)酵液體積比為1 :8~ 1 ：20〇10. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：好氧發(fā)酵時通入流速為〇. 5vvm~lvvm 的空氣。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵制備2,3-丁二醇的方法，包括（1）菌種培養(yǎng)：以MRS培養(yǎng)基進行乳桿菌的培養(yǎng)，獲得乳桿菌種子液；以LB培養(yǎng)基進行克雷伯氏菌的培養(yǎng)，獲得克雷伯氏菌種子液；（2）發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入克雷伯氏菌種子液，進行微氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中流加葡萄糖溶液使發(fā)酵體系中葡萄糖濃度控制在20g/L～40g/L；（3）發(fā)酵調控：在發(fā)酵末期將發(fā)酵液pH調至5～6，接入乳桿菌種子液，在低pH條件下進行好氧發(fā)酵。本發(fā)明方法能夠有效脫除發(fā)酵液中葡萄糖的殘留，有利于下一步雙水相、精餾等精制方式的實施，適用于大規(guī)模生產應用。
【IPC分類】C12R1/22, C12P7/18, C12R1/245
【公開號】CN105713932
【申請?zhí)枴緾N201410730613
【發(fā)明人】張霖, 樊亞超, 廖莎, 姚新武, 師文靜
【申請人】中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司大連石油化工研究院