一種油田化學(xué)劑的生物毒性評(píng)價(jià)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種對(duì)油田化學(xué)劑的生物毒性評(píng)價(jià)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著世界范圍內(nèi)環(huán)境保護(hù)法律法規(guī)的日益嚴(yán)格及公眾環(huán)境意識(shí)的日益強(qiáng)烈，油田 化學(xué)劑(主要包括鉆井液添加劑及體系、完井液添加劑及體系、油田污水處理劑等）的環(huán)境 保護(hù)評(píng)價(jià)問(wèn)題受到了普遍關(guān)注和重視。在國(guó)外，如美國(guó)、英國(guó)、加拿大、挪威、荷蘭等都制定 了有關(guān)油田化學(xué)劑(主要是鉆井液及其廢棄物）的環(huán)境保護(hù)指標(biāo)。在我國(guó)，油田化學(xué)劑的 生物毒性問(wèn)題日益受到重視，已經(jīng)開(kāi)展了廢棄鉆井液對(duì)海洋生物的毒性測(cè)試，并初步建立 了油基鉆井液毒性評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)程序，但關(guān)于油田化學(xué)劑生物毒性測(cè)試方法的研究卻起步較 晚。油田化學(xué)劑生物毒性測(cè)試方法的研究始于九十年代初期，迄今為止，尚無(wú)統(tǒng)一的油田化 學(xué)劑生物毒性測(cè)試方法標(biāo)準(zhǔn)與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] 1995年國(guó)家環(huán)保局頒布了《水質(zhì)急性生物毒性發(fā)光細(xì)菌法》即國(guó)標(biāo)GB/T 15441-1955,并于1995年3月1日開(kāi)始在全國(guó)實(shí)行。它是測(cè)定水質(zhì)急性生物毒性的標(biāo)準(zhǔn) 方法。中國(guó)石油環(huán)境監(jiān)測(cè)總站W(wǎng)《水質(zhì)急性生物毒性發(fā)光細(xì)菌法》為基礎(chǔ)，參照EPA織奸生 物試驗(yàn)法，建立了利用發(fā)光細(xì)菌法測(cè)定鉆井液及添加劑生物毒性的測(cè)試方法和生物毒性分 級(jí)方法，并W此為基準(zhǔn)起草并建立了中國(guó)石油天然氣集團(tuán)公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/SY111-2007,即 《油田化學(xué)劑、鉆井液生物毒性分級(jí)及檢測(cè)方法發(fā)光細(xì)菌法》。
[0004] 發(fā)光細(xì)菌法是基于毒性物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光度的抑制效果而設(shè)計(jì)的一種 評(píng)價(jià)方法，具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短，易于現(xiàn)場(chǎng)操作等特點(diǎn)，被多個(gè)行業(yè)廣泛采用。 CN201110090246.9公開(kāi)了一種發(fā)光菌毒性的測(cè)定方法，該方法包括W下步驟；1)菌種活 化：將明亮發(fā)光桿菌的凍干粉溶解，接種到斜面上傳代3次后可用；2)菌種的培養(yǎng)；將傳代 好的菌種用接種環(huán)接種到液體培養(yǎng)基，2(TC，ISOrpm培養(yǎng)12h ;3)菌液的平衡；移取適量菌 液到20血3%化Cl溶液中，控制光值測(cè)定范圍在50-500萬(wàn)之間，20°C條件下攬拌40min ;4) 加樣及發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)：將攬拌了 40min的菌液用連續(xù)進(jìn)樣器加入200 U L到800 U L的3% 化Cl空白及800 U L濃度梯度的3%化Cl污染液，加樣后立即在旋潤(rùn)混勻器上混勻2min， 2(TC條件下，靜置15min后將樣品管置入英光檢測(cè)器中測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度；5)雙交錯(cuò)對(duì)照法計(jì) 算樣品對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的抑制率。CN201010537039. 9公開(kāi)了一種發(fā)光細(xì)菌菌種的長(zhǎng)期保存、快 速?gòu)?fù)蘇的方法。通過(guò)開(kāi)發(fā)專口的細(xì)菌凍存培養(yǎng)基和復(fù)蘇溶液，實(shí)現(xiàn)發(fā)光細(xì)菌菌種的長(zhǎng)期保 存和快速?gòu)?fù)蘇，既節(jié)省了測(cè)試成本，也大大縮短了毒性測(cè)試的時(shí)間，為化學(xué)污染物的快速毒 性測(cè)試提供了可能。
[0005] 目前油田化學(xué)劑的生物毒性等級(jí)判斷主要是基于化學(xué)劑對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光量抑 制程度。由于發(fā)光細(xì)菌具有自主的代謝及條件反射機(jī)制，發(fā)光量作為生物毒性唯一的檢測(cè) 指標(biāo)，其受菌體生長(zhǎng)代謝及環(huán)境影響很大，準(zhǔn)確量化的難度很大，因此發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)方法的 穩(wěn)定性、重現(xiàn)性不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種油田化學(xué)劑生物毒性評(píng)價(jià)方法。該方法 通過(guò)菌種復(fù)蘇、同步化培養(yǎng)、穩(wěn)態(tài)篩選等方式獲得具有較高發(fā)光穩(wěn)定性的供試發(fā)光菌菌懸 液；在毒性檢測(cè)過(guò)程中，加入發(fā)光促進(jìn)劑，從而削弱了個(gè)體發(fā)光差異，保證了毒性評(píng)價(jià)結(jié)果 的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。
[0007] 本發(fā)明油田化學(xué)劑生物毒性評(píng)價(jià)方法，包括如下內(nèi)容： (1) 發(fā)光菌復(fù)蘇；將發(fā)光菌用氯化鋼溶液配制成菌懸液，于冰水浴中復(fù)蘇； (2) 同步化培養(yǎng)；將復(fù)蘇菌懸液接種于活化培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)；活化培養(yǎng)后期， 在菌體培養(yǎng)液中加入生長(zhǎng)抑制劑，進(jìn)行同步培養(yǎng)；經(jīng)同步培養(yǎng)后，收集菌體細(xì)胞； (3) 毒性評(píng)價(jià)：用氯化鋼溶液將菌體細(xì)胞配制成具有一定發(fā)光量的菌懸液，并添加發(fā)光 促進(jìn)劑，用于毒性評(píng)價(jià)分析。
[0008] 本發(fā)明方法中，所采用的發(fā)光菌是具有特殊發(fā)光代謝途徑的一類菌種，包括弧菌 屬、發(fā)光桿菌屬、異短桿菌屬，其中優(yōu)選明亮發(fā)光桿菌。
[0009] 本發(fā)明方法中，所采用的發(fā)光菌可W是來(lái)自于市售的發(fā)光菌凍干粉，也可W是斜 面或液體保藏的菌種。
[0010] 本發(fā)明方法中，菌體復(fù)蘇過(guò)程使用質(zhì)量濃度為1. 5%~3. 0%氯化鋼溶液，復(fù)蘇時(shí)間 2min~lOmin。復(fù)蘇后菌懸液發(fā)光量達(dá)到600mV W上即滿足試驗(yàn)要求。
[0011] 本發(fā)明方法中，所述的活化培養(yǎng)基配方為膜蛋白腺0.1 wt%~0.5wt%，酵母膏 0. 2wt% ~0. 5wt%，甘油 0.1 wt% ~0. 3wt%，磯酸二氨鐘 0. 05wt% ~0. 2wt%，磯酸氨二鋼 0. 05wt%~0. 2wt%，氯化鋼0. 2wt%~0. 5wt%，P冊(cè).5。活化培養(yǎng)時(shí)間為1化~1她。
[0012] 本發(fā)明方法中，通過(guò)在活化培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)限制性成分即生長(zhǎng)抑制劑的方式， 進(jìn)行生長(zhǎng)同步化調(diào)節(jié)。所選擇的生長(zhǎng)抑制劑為核酸合成抑制或細(xì)胞分裂抑制劑，如可W是 5-氣脫氧尿嚼巧、居基脈、阿糖胞巧、氨甲蝶嶺、腺嘿嶺、鳥(niǎo)嘿嶺、胸腺嚼巧、秋水仙素、秋水 仙胺等中的一種或幾種。具體根據(jù)選擇的生長(zhǎng)抑制劑不同，確定其加入量，可W實(shí)現(xiàn)同步化 培養(yǎng)即可。
[0013] 本發(fā)明方法中，發(fā)光菌在加入生長(zhǎng)抑制劑菌體培養(yǎng)液中培養(yǎng)化~1化后，進(jìn)行離 必處理，獲得菌體沉淀。離必轉(zhuǎn)速為50化pm~1500巧m，離必時(shí)間IOmin~20min。
[0014] 本發(fā)明方法中，W質(zhì)量濃度為2%~3%的氯化鋼溶液將收集的菌體沉淀進(jìn)行2~ 4次清洗，并配制成發(fā)光菌菌懸液，用于鉆井液生物毒性評(píng)價(jià)。
[0015] 本發(fā)明方法中，發(fā)光菌菌懸液中加入質(zhì)量濃度為0. 1%~0. 3%發(fā)光促進(jìn)劑。發(fā)光 促進(jìn)劑為六碳糖或八碳W上的醒類，優(yōu)選葡萄糖、辛醒。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明油田化學(xué)劑生物毒性評(píng)價(jià)方法通過(guò)有效菌體同步生長(zhǎng)處 理步驟，獲得了生長(zhǎng)一致性的菌體細(xì)胞，排除了菌體生長(zhǎng)差異對(duì)菌體發(fā)光量的影響，同時(shí)根 據(jù)菌體發(fā)光原理，在檢測(cè)用菌懸液中添加了發(fā)光促進(jìn)劑，提高了發(fā)光強(qiáng)度及發(fā)光穩(wěn)定性，更 有利于提高毒性評(píng)價(jià)結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性： (1)現(xiàn)有毒性評(píng)價(jià)方案是W發(fā)光菌的發(fā)光量變化作為毒性檢測(cè)的指標(biāo)，由于發(fā)光菌是 具有自主生理代謝調(diào)控的生物體，因此處于不同生長(zhǎng)期的菌體，其發(fā)光量處于不斷的變化 中，其表現(xiàn)的發(fā)光總量波動(dòng)性很大，作為檢測(cè)指標(biāo)，其結(jié)果的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性會(huì)受到嚴(yán)重質(zhì) 疑。本發(fā)明W菌體同步培養(yǎng)的方式，獲得了同步生長(zhǎng)的供試菌體，從而提高了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn) 定性。
[0017] (2 )現(xiàn)有鉆井液體系中富養(yǎng)有機(jī)成分較少，加入發(fā)光菌后，其發(fā)光量呈逐步下降的 趨勢(shì)，從而影響對(duì)其毒性的判定。因此，本方案在檢測(cè)用菌懸液中添加了發(fā)光促進(jìn)劑，使其 發(fā)光量維持在一個(gè)恒定的水平，有利于其毒性判斷的準(zhǔn)確性。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法的具體過(guò)程及效果進(jìn)行說(shuō)明，但不局限于W下實(shí)施 例。本發(fā)明中，wt%為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
[0019] 本實(shí)施例中所用的發(fā)光菌為市售的明亮發(fā)光桿菌凍干粉。鉆井液毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)過(guò) 程依據(jù)中國(guó)石油天然氣集團(tuán)公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/SY111- 2007,即《油田化學(xué)劑、鉆井液生物毒 性分級(jí)及檢測(cè)方法發(fā)光細(xì)菌法》進(jìn)行。
[0020] 實(shí)施例1 (1) 取市售的明亮發(fā)光桿菌T3小種（Photobacterium photoreum T3 spp.)凍干粉 0. 5g，溶解于ImL質(zhì)量濃度2. 5wt%的氯化鋼溶液。于冰水浴中復(fù)蘇5min ; (2) 將復(fù)蘇菌懸液接種于50mL活化培養(yǎng)基中，于2(TC，活化培養(yǎng)1她； (3) 活化1化后，向培養(yǎng)基中加入5嗦秋水仙胺，同步培養(yǎng)化； (4) 同步培養(yǎng)化后，100化pm離必lOmin，棄上清液，取菌體沉淀，用3%氯化鋼溶液清洗 兩次，并再次離必獲得菌體沉淀； (5) 將菌體溶于IOmL含有3wt%氯化鋼，0.1 wt%葡萄糖的緩沖溶液，配制成菌懸液； (6) 取10化菌懸液加入2mL3wt%氯化鋼溶液中進(jìn)行發(fā)光量測(cè)定。
[0021] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

[002引 實(shí)施例2 (1) 取市售的明亮發(fā)光桿菌T3小種（Photobacterium photoreum T3 spp.)凍干粉 0. 5g，溶解于ImL質(zhì)量濃度2. 5wt%的氯化鋼溶液。于冰水浴中復(fù)蘇5min ; (2) 將復(fù)蘇菌懸液接種于50mL活化培養(yǎng)基中，于2(TC，活化培養(yǎng)1她； (3) 活化1化后，向培養(yǎng)基中加入25mg胸腺嚼巧，同步培養(yǎng)16h ; (4) 同步培養(yǎng)1化后，500巧m離必20min，棄上清液，取菌體沉淀，用3wt%氯化鋼溶液清 洗H次，并再次離必獲得菌體沉淀； (5) 將菌體溶于IOmL含有3wt%氯化鋼、0. 2wt%辛醒的緩沖溶液，配制成菌懸液； (6) 取10化菌懸液加入2血3wt%氯化鋼中進(jìn)行發(fā)光量測(cè)定。
[0023] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

[0024] 實(shí)施例3 (1) 取市售的明亮發(fā)光桿菌T3小種（Photobacterium photoreum T3 spp.)凍干粉 0. 5g，溶解于ImL質(zhì)量濃度2. 5wt%的氯化鋼溶液。于冰水浴中復(fù)蘇5min ; (2) 將復(fù)蘇菌懸液接種于50mL活化培養(yǎng)基中，于2(TC，活化培養(yǎng)1她； (3) 活化1化后，向培養(yǎng)基中加入25mg腺嘿嶺，同步培養(yǎng)16h ; (4) 同步培養(yǎng)1化后，120化pm離必lOmin，棄上清液，取菌體沉淀，用3wt%氯化鋼溶液 清洗H次，并再次離必獲得菌體沉淀； (5) 將菌體溶于IOmL含有3wt%氯化鋼、0. 2wt%葡萄糖的緩沖溶液，配制成菌懸液； (6) 取10化菌懸液加入2mL3wt%氯化鋼中進(jìn)行發(fā)光量測(cè)定。
[0025] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

[002引 實(shí)施例4 W實(shí)施例1所獲得發(fā)光菌菌懸液，用于5%氯化巧鉆井液體系的生物毒性評(píng)價(jià)。毒性評(píng) 價(jià)試驗(yàn)步驟按照中國(guó)石油天然氣集團(tuán)公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/SY111- 2007,即《油田化學(xué)劑、鉆井 液生物毒性分級(jí)及檢測(cè)方法發(fā)光細(xì)菌法》進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

[0027] 相對(duì)發(fā)光度，其中％。。。指實(shí)驗(yàn)樣品的發(fā)光量，Epk指對(duì)照樣品的發(fā)光量。
[002引 比較例1 同實(shí)施例1中（1)~（4)實(shí)驗(yàn)操作，獲得菌體沉淀，并將菌體溶于IOmL含有3wt%氯化 鋼溶液中，不使用發(fā)光促進(jìn)劑，用于發(fā)光量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：

與實(shí)施例1相比，菌體發(fā)光量較低，證明發(fā)光促進(jìn)劑有利于促進(jìn)菌體二次復(fù)蘇，從而 提高發(fā)光量。
[002引 比較例2 同實(shí)施例1中（1)、（2)、（4)、（5)實(shí)驗(yàn)操作，獲得菌體沉淀，不使用生長(zhǎng)抑制劑秋水仙 胺，獲得的菌體溶于IOmL含有3wt%氯化鋼、0.1 wt%葡萄糖的緩沖溶液中，用于發(fā)光量檢測(cè)， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：

與實(shí)施例1相比，菌體發(fā)光量的存在無(wú)序的波動(dòng)性，證明同步化處理有利于提高菌體 發(fā)光穩(wěn)定性。
[0030] 比較例3 (1)取市售的明亮發(fā)光桿菌T3小種（Photobacterium photoreum T3 spp.)凍干粉 0. 5g，按照CN201110090246. 9公開(kāi)方式進(jìn)行復(fù)蘇、活化； (2)取10化菌懸液加入2血3%氯化鋼中進(jìn)行發(fā)光量測(cè)定。
[0031] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：

與實(shí)施例1相比，該專利報(bào)道的菌體復(fù)蘇、活化的方法，其菌體發(fā)光量存在較大的波動(dòng) 性。
[00礎(chǔ) 比較例4 按照中國(guó)石油天然氣集團(tuán)公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/SY111- 2007,即《油田化學(xué)劑、鉆井液生物 毒性分級(jí)及檢測(cè)方法發(fā)光細(xì)菌法》中全部試驗(yàn)過(guò)程，對(duì)5%氯化巧鉆井液體系進(jìn)行生物毒性 評(píng)價(jià)。結(jié)果如下：

與實(shí)施例4相比，相對(duì)發(fā)光度的變化沒(méi)有規(guī)律性，因此不能明確判定其毒性范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種油田化學(xué)劑的生物毒性評(píng)價(jià)方法，其特征在于包括如下內(nèi)容： (1) 發(fā)光菌復(fù)蘇：將發(fā)光菌用氯化鈉溶液配制成菌懸液，于冰水浴中復(fù)蘇； (2) 同步化培養(yǎng)：將復(fù)蘇菌懸液接種于活化培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)；活化培養(yǎng)后期， 在菌體培養(yǎng)液中加入生長(zhǎng)抑制劑，進(jìn)行同步培養(yǎng)；經(jīng)同步培養(yǎng)后，收集菌體細(xì)胞； (3) 毒性評(píng)價(jià)：用氯化鈉溶液將菌體細(xì)胞配制成具有一定發(fā)光量的菌懸液，并添加發(fā)光 促進(jìn)劑，用于毒性評(píng)價(jià)分析。2. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)所述的發(fā)光菌為弧菌屬、發(fā)光桿 菌屬或異短桿菌屬。3. 按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所采用的發(fā)光菌為明亮發(fā)光桿菌。4. 按照權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所采用的發(fā)光菌來(lái)自于市售的發(fā) 光菌凍干粉或者是斜面或液體保藏的菌種。5. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中菌體復(fù)蘇過(guò)程使用質(zhì)量濃度為 1. 5%~3. 0%氯化鈉溶液，復(fù)蘇時(shí)間2min~lOmin。6. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)所述的活化培養(yǎng)基配方為胰 蛋白腺〇· lwt%~0· 5wt%，酵母膏0· 2wt%~0· 5wt%，甘油0· lwt%~0· 3wt%，憐酸二氫鉀 0· 05wt% ~0· 2wt%，磷酸氫二鈉 0· 05wt% ~0· 2wt%，氯化鈉 0· 2wt% ~0· 5wt%，ρΗ6· 5 ;活化 培養(yǎng)時(shí)間為12h~18h。7. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)所述的生長(zhǎng)抑制劑為核酸合成抑 制劑或者細(xì)胞分裂抑制劑。8. 按照權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：步驟（2)所述的生長(zhǎng)抑制劑為5-氟脫氧 尿嘧啶、羥基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、秋水仙素、秋水仙胺等中 的一種或幾種。9. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中發(fā)光菌在加入生長(zhǎng)抑制劑 菌體培養(yǎng)液中培養(yǎng)5h~16h后，進(jìn)行離心處理，離心轉(zhuǎn)速為500rpm~1500rpm，離心時(shí)間 lOmin ~20min〇10. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中以質(zhì)量濃度為2%~3%的氯 化鈉溶液將收集的菌體細(xì)胞進(jìn)行2~4次清洗。11. 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3)菌懸液中加入質(zhì)量濃度為 0. 1%~0. 3%發(fā)光促進(jìn)劑，發(fā)光促進(jìn)劑為六碳糖或八碳以上的醛類。12. 按照權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于：所述的發(fā)光促進(jìn)劑為葡萄糖或辛醛。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種油田化學(xué)劑生物毒性評(píng)價(jià)方法，包括如下內(nèi)容：（1）發(fā)光菌復(fù)蘇：將發(fā)光菌用氯化鈉溶液配制成菌懸液，于冰水浴中復(fù)蘇；（2）同步化培養(yǎng)：將復(fù)蘇菌懸液接種于活化培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化培養(yǎng)；活化培養(yǎng)后期，在菌體培養(yǎng)液中加入生長(zhǎng)抑制劑，進(jìn)行同步培養(yǎng)；經(jīng)同步培養(yǎng)后，收集菌體細(xì)胞；（3）毒性評(píng)價(jià)：用氯化鈉溶液將菌體細(xì)胞配制成具有一定發(fā)光量的菌懸液，并添加發(fā)光促進(jìn)劑，用于毒性評(píng)價(jià)分析。本發(fā)明方法通過(guò)菌種復(fù)蘇、同步化培養(yǎng)、穩(wěn)態(tài)篩選等方式獲得具有較高發(fā)光穩(wěn)定性的供試發(fā)光菌；在毒性檢測(cè)過(guò)程中，加入發(fā)光促進(jìn)劑，從而削弱了個(gè)體發(fā)光差異，保證了毒性評(píng)價(jià)結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。
【IPC分類】C12Q1/02, C12R1/63, C12R1/01
【公開(kāi)號(hào)】CN105713952
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410736313
【發(fā)明人】張霖, 姚新武, 廖莎, 樊亞超, 師文靜
【申請(qǐng)人】中國(guó)石油化工股份有限公司, 中國(guó)石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院