一種低分子肝素的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種低分子肝素的純化方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是將所制得的低分子肝素經(jīng)過以殼聚糖為載體,抗凝血酶Ⅲ為配基的親和色譜法來純化，最終得到了一種高純低分子肝素產(chǎn)品。本發(fā)明生產(chǎn)的純化后的低分子肝素抗Xa活性為646.0IU/mg,比純化前提高6.3倍,而抗Ha活性極低基本不體現(xiàn)，明顯提高了低分子肝素的純度，從而也大大提高了其抗Xa活性，提高其應用價值。
【專利說明】一種低分子肝素的純化方法

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及生化【技術(shù)領域】，具體地說是所制得的低分子肝素再經(jīng)過以殼聚糖為載體，抗凝血酶III為配基的親和色譜法來純化，最終得到了一種高純低分子肝素產(chǎn)品。

【背景技術(shù)】
[0002]肝素是一種天然的抗凝血物質(zhì)，但未分級的肝素存在許多局限性:半衰期短；需監(jiān)測凝血酶活性并調(diào)整用量；需持續(xù)靜脈點滴；受血小板IV因子影響，使療效不穩(wěn)定；導致骨質(zhì)疏松和血小板減少等。而低分子肝素與普通肝素比有很大區(qū)別，不但能產(chǎn)生良好且持久的抗血栓等作用，臨床安全性好，還具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌等功能，同時又可減輕或避免普通肝素的不良作用，從而使用起來更方便。
[0003]目前，低分子肝素在臨床上的應用主要有靜脈血栓、冠狀動脈綜合征、彌散性血管內(nèi)凝血、不穩(wěn)定性心絞痛和心肌梗死等，而且有相關(guān)藥效學實驗表明其抗血栓作用較普通肝素強，也具有免疫調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)已試用于艾滋病的臨床治療中。
[0004]本發(fā)明運用以殼聚糖為載體，抗凝血酶III為配基的親和色譜法對低分子肝素進行純化，對其中的抗Xa活性成分進行極大可能的篩選，使提純后的低分子肝素抗Xa活性為646.0IU/mg,比純化前提高6.3倍，而抗Ha活性極低，基本不體現(xiàn)，即生產(chǎn)出一種溶血栓能力較強，抗凝血能力較低的新型抗血栓肝素類藥物具有較高的應用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是生產(chǎn)純度較高的低分子肝素。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:將所制得的低分子肝素再經(jīng)過以殼聚糖為載體，抗凝血酶III為配基的親和色譜法來純化，最終得到了一種高純低分子肝素產(chǎn)品。本發(fā)明具有工藝簡單，操作安全，成本較低的特點，非常適用于規(guī)模化大生產(chǎn)。包括如下步驟:
(1)制備親和樹脂:將殼聚糖在水中進行懸浮溶脹24h，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH8.0-9.0，加入戊二醛溶液反應2h，抽濾，再用水洗凈戊二醛至無味，在低溫條件下加入凝血酶，反應5h，反應終止后加入NaCl溶液洗去未偶聯(lián)的配基，并用水洗至pH為中性，用親和柱平衡液浸泡15min后，脫氣，再裝柱；
(2)將低分子肝素用pH為7.5Tris-HCl緩沖液溶解；
(3)上樣至親和色譜柱；
(4)上樣后用Tris-HCl緩沖液洗滌；
(5)用氯化鈉溶液洗脫；
(6)向洗脫液中加入3倍體積的乙醇低溫沉淀；
(7)真空干燥得到高純低分子肝素。

【具體實施方式】
[0007]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0008]實施例1
將所制得的低分子肝素再經(jīng)過以殼聚糖為載體，抗凝血酶III為配基的親和色譜法來純化，最終得到了一種高純低分子肝素產(chǎn)品，包括如下步驟:
(I)制備親和樹脂
取10g殼聚糖在100ml雙蒸水中進行懸浮溶脹24h，用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH8.0-9.0，加入300ml 20%戊二醛溶液反應2h，抽濾，再用雙蒸水洗凈戊二醛至無味，在低溫條件下加入Ig凝血酶，反應5h，反應終止后加入3mol/LNaCl溶液洗去未偶聯(lián)的配基，并用雙蒸水洗至PH為中性，用親和柱平衡液浸泡15min后，脫氣，再裝柱。
[0009](2)親和色譜純化
采用柱高40cm、內(nèi)徑1.0cm的分離柱，裝柱，取10mg低分子肝素用1.5ml 20mmol/LpH為7.5Tris-HCl緩沖液溶解，上樣至親和色譜柱中，上樣后用20mmol/LpH為7.5Tris_HCl緩沖液洗滌，再用3mol/L氯化鈉溶液洗脫，向洗脫液中加入3倍體積的乙醇，(TC低溫沉淀24h，過濾出沉淀物，并用少量純乙醇洗滌沉淀物，真空干燥后準確稱量得到高純低分子肝素產(chǎn)物質(zhì)量。
[0010]實施例2
將所制得的低分子肝素再經(jīng)過以殼聚糖為載體，抗凝血酶III為配基的親和色譜法來純化，最終得到了一種高純低分子肝素產(chǎn)品，包括如下步驟:
(I)制備親和樹脂
取10g殼聚糖在100ml雙蒸水中進行懸浮溶脹24h，用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH8.0-9.0，加入300ml 30%戊二醛溶液反應2h，抽濾，再用雙蒸水洗凈戊二醛至無味，在低溫條件下加入1.5g凝血酶，反應5h，反應終止后加入3mol/LNaCl溶液洗去未偶聯(lián)的配基，并用雙蒸水洗至PH為中性，用親和柱平衡液浸泡15min后，脫氣，再裝柱。
[0011](2)親和色譜純化
采用柱高40cm、內(nèi)徑1.0cm的分離柱，裝柱，取10mg低分子肝素用2.5ml 20mmol/LpH為7.5Tris-HCl緩沖液溶解，上樣至親和色譜柱中，上樣后用20mmol/LpH為7.5Tris-HCl緩沖液洗滌，再用3mol/L氯化鈉溶液洗脫，向洗脫液中加入3倍體積的乙醇，(TC低溫沉淀24h，過濾出沉淀物，并用少量純乙醇洗滌沉淀物，真空干燥后準確稱量得到高純低分子肝素產(chǎn)物質(zhì)量。
[0012]經(jīng)核算，采用中國藥典方法檢測可得，低分子肝素抗Xa活性為646.0IU/mg,比純化前提高6.3倍。
[0013]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種低分子肝素的純化方法，其特征在于:將制得的低分子肝素通過親和色譜的方法得到高純度的低分子肝素產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備高純度低分子肝素的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 制備親和樹脂:將殼聚糖在水中進行懸浮溶脹24h，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH8.0-9.0，加入戊二醛溶液反應2h，抽濾，再用水洗凈戊二醛至無味，在低溫條件下加入凝血酶，反應5h，反應終止后加入NaCl溶液洗去未偶聯(lián)的配基，并用水洗至pH為中性，用親和柱平衡液浸泡15min后，脫氣，再裝柱； 將低分子肝素用pH為7.5 Tris-HCl緩沖液溶解； 將溶解液上柱進行吸附； 加入Tris-HCl緩沖液洗滌； 用氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液； 加入乙醇進行低溫沉淀，得到沉淀物； 真空干燥得到高純低分子肝素產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，戊二醛濃度20%-30%;加入凝血酶的量為殼聚糖的0.05%-2%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，溶解用的Tris-HCl緩沖液體積約為低分子肝素的1%_3%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述吸附柱為親和層析柱。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述親和層析柱包括:CM_SephadexA-25,CM-Sephadex A-50, CM-Sephadex C-25,CM-Sephadex C-50，SP-Sepharose2B, SP-Sepharose 4B, SP-Sepharose 6B，SP-Sepharose CL-2B, SP-SepharoseCL-4B, SP-Sepharose CL-6B。
【文檔編號】C08B37/10GK104497172SQ201410807934
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】劉乃山, 宋立明, 劉翠珍 申請人:青島康原藥業(yè)有限公司