一種利用共固定化酶合成D-丙氨酸的方法與流程

文檔序號：11936866閱讀：531來源：國知局

本發(fā)明屬于生物催化領域，涉及一種共固定化酶催化合成D-丙氨酸的方法。把meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體和FDH共固定化于載體上，共固定化酶為生物催化劑，以NAD（H）為輔酶，催化α-酮酸底物合成D-丙氨酸，反應結束后將反應液直接濾除，共固定化酶回收可重復使用120批，在填充柱中可連續(xù)催化反應55天，活性沒有明顯下降，得到的反應液通過酸性離子樹脂吸附分離得到D-丙氨酸。產(chǎn)物D-丙氨酸的光學純度 >98%。

背景技術：

-丙氨酸是白色晶體，有特殊的結晶形狀。有甜味，溶于水、強堿和強酸溶液，不溶于無水酒精，乙醚和丙酮。在2%的鹽酸（5 mol/L）中25℃比旋光度是-14.6，在2%的水中25℃比旋光度是-1.8。D-丙氨酸是一種非天然氨基酸，是重要的手性藥物中間體，用于生產(chǎn)新型廣譜抗生素、D-丙氨醇、多肽合成過程的丙氨酸保護劑、食品添加劑、化妝品、維生素B6以及合成新型甜味劑阿力甜等[代書玲，徐虹，歐陽平凱，D-天冬氨酸的制備和應用［J］.南京工業(yè)大學學報，2003，25（3）:108-110.]。

-丙氨酸的制備方法主要有微生物發(fā)酵法[Terasawa Masato，Nara shoichi.Manufacture of D2aspartic acid with aspartase［P］.JP：04008297，1992201213.]，化學合成法[Soda Kenji，Kageyama sadao.Manufacture of D -aspartic acid with malic acid dahydrogenase，alanine dahydrogenase，alanine racemase and D-amino acid transaminase［P］.JP:01285193，1989211216.]和生物酶催化合成法。其中，發(fā)酵法生產(chǎn)周期長、設備投資大、有副反應、分離較復雜、污染大；不對稱化學合成法反應機制相當復雜，工藝過程長，需要純手性試劑或貴金屬絡合物作催化劑，環(huán)境污染大。生物催化合成法是通過酶進行催化或者拆分，用于合成D-氨基酸的酶如轉氨酶[Eul-Soo Park, Joo-Young Dong and Jong-Shik Shin, ω-Transaminase-catalyzed asymmetric synthesis of unnatural amino acids using isopropylamine as an amino donor, Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 6929-6933]、meso-二氨基庚二酸脫氫酶（DAPDH）[Gao X., Chen X., Liu W., Feng J., Wu Q., Hua L., Zhu D., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 8595-8600，專利申請?zhí)枺?01210334554.6]以及目前國內外工業(yè)化生產(chǎn)D-丙氨酸普遍采用的氨基酸?；福壑苄闱?氨基酸代謝相關的酶［J］.發(fā)酵科技通訊，2006，35（1）:43-44.］等，酶催化方法存在酶的價格昂貴，同時游離酶對環(huán)境敏感、容易失活，且存在無法回收，反應成本高，二次污染等問題。

固定化酶技術發(fā)展于 20 世紀 60 年代。與游離酶相比有很多優(yōu)點，如：產(chǎn)物易分離；可以重復多批次使用；酶的穩(wěn)定性提高；簡化了后期提純工藝等[羅貴民. 酶工程[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2002，2]；共固定化酶是將兩種或兩種以上的酶固定于同一載體內形成共固定化系統(tǒng)的一種技術[徐莉，侯紅萍. 酶的固定化方法的研究進展[J]. 釀酒科技，2010(1)：86–90]。共固定化酶可以充分發(fā)揮不同酶的特點，將其催化特性結合起來，充分利用協(xié)同作用，提高其催化效率。同時可以減少反應時間和步驟，連續(xù)生產(chǎn)，能夠更好的控制產(chǎn)品質量。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種反應條件溫和，酶活力回收較高，成本低廉、工藝簡單的利用共固定化酶制備D-丙氨酸的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是，一種利用共固定化酶合成D-丙氨酸的方法，具體包括以下步驟：（1）將一定比例的meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體酶液和甲酸脫氫酶酶液混合，加入環(huán)氧基樹脂或者活化后的氨基樹脂，室溫下攪拌15-30小時，取出載體，用緩沖液洗至無游離蛋白，將載體加入到一定濃度的封閉劑溶液中25°C攪拌6-10小時，取出載體后將其用緩沖液洗三遍。得到的共固定化酶4°C保存?zhèn)溆谩＃?）α-酮酸、α-酮酸鹽和氨基化合物作為底物與溶劑構成的反應體系中加入共固定化酶和少量輔酶進行催化還原胺化反應，反應溫度20~60 °C，反應pH值為6~11，反應時間4~72小時，制得光學純度>98% D-氨基酸。（3）將反應液直接濾除，共固定化酶回收重復使用，得到的反應液通過酸性離子樹脂吸附分離得到D-丙氨酸。

所述步驟（1）中meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體，可通過以下步驟獲得：

a．以pET32-StDapdh質粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引入R35E單位點突變；

b．以pET32-StDapdh質粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引入R35E/R36V兩位點組合突變；

c．以pET32-StDapdh質粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引入R35D/R36V兩位點組合突變；

d．以pET32-StDapdh質粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引入R35D/R36Q兩位點組合突變；

e．以pET32-StDapdh質粒為模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突變試劑盒引入R35D/R36Q/Y76V三位點組合突變；

f．將構建的突變子工程菌進行培養(yǎng)、并對目的蛋白進行誘導表達；

g．將步驟f中的單位點、雙位點、三位點組合突變體分別收集菌體后，用緩沖液進行重懸，進行高壓破碎，離心取破碎上清，通過Ni-NTA層析柱純化；

h．將步驟f中三位點組合突變體收集菌體后，用緩沖液進行重懸，進行高壓破碎，離心取破碎上清。將破碎上清于70℃水浴中熱處理30 min，再次離心取熱處理上清。

所述步驟（1）中載體為表面含有氨基或者環(huán)氧基官能團的載體，如：ES-1，ES-101，ES-102，ES-103，ESR-1，ESR-2, ESR-3, ESQ-1（購自天津南開和成科技有限公司），優(yōu)選表面含有氨基的樹脂為固定化載體。

所述步驟（1）中共固定酶meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體酶液和甲酸脫氫酶兩種酶的酶量比例在1:1-1:5之間，優(yōu)選比例為1:3。所選封閉劑包括鹽酸乙二胺、二乙胺和α-甲基芐胺，乙醇胺等，封閉劑濃度在0.1mmol/g載體-3mmol/g載體，優(yōu)選封閉劑為乙醇胺，濃度為0.1mmol/g載體-1mmol/g載體。

所述步驟（2）中，α-酮酸、α-酮酸鹽和氨基化合物作為底物與溶劑構成的反應體系中加入共固定化酶和少量輔酶進行催化還原胺化反應，反應溫度20~60 °C，優(yōu)選反應溫度為30~50 °C。反應pH值為6~11，優(yōu)選pH值為7~9，反應時間4~72小時，優(yōu)選反應時間為4-24小時。

所述步驟（3）中反應結束后，反應液通過酸性離子樹脂吸附分離得到光學純度>98% D-氨基酸。

反應產(chǎn)物構型檢測：

向反應產(chǎn)物中加入高氯酸使蛋白變性后，對反應產(chǎn)物氨基酸進行衍生，利用衍生后的L、d-丙氨酸標樣做對照，確定產(chǎn)物構型以及ee值。

附圖說明：

附圖1 為本發(fā)明的工藝流程圖；

附圖2為丙氨酸消旋體HPLC譜圖；

附圖3為產(chǎn)品D-丙氨酸構型HPLC譜圖；

附圖4為產(chǎn)品核磁譜圖。

具體實施方式

以下通過具體的實施例來進一步說明本發(fā)明內容，但是這些實施例不構成對本發(fā)明的限制。下列實例中所用材料除特別說明外，所用化學藥品、試劑均購自Sigma公司。DNA和蛋白質Marker均購自Fermentas公司，蛋白純化Ni-NTA填料購自GE。Quick Change Mutagenesis Kit購自Agilent公司，突變引物按照試劑盒要求進行設計。引物合成、DNA序列測定均由華大基因公司（北京）進行。pET₃₂質粒載體，TOP10、BL21(DE3)高效感受態(tài)（Novagen）。液相色譜分析使用Agilent-1200色譜儀，色譜柱為Eclipse XDB-C18柱(4.6 × 150 mm)，固定化載體購自天津南開和成科技有限公司。

實施例1：meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體的獲得

所用StDapdh基因Genbank號為AP006840.1，先將該基因全合成并連接到pET₃₂載體上獲得質粒：pET₃₂-StDapdh，并在大腸桿菌BL21（DE3）中對野生型基因進行可溶表達，表達出的蛋白N-端帶有6×his tag，以利于后續(xù)Ni-NTA純化。根據(jù)需要突變的位點，參照Quick Change Mutagenesis Kit試劑盒使用說明，合成表1中所用PCR突變引物，PCR產(chǎn)物擴增、Dpn1切割及后續(xù)核酸回收均按試劑盒使用說明進行。

表1：突變PCR引物

以pET32-StDapdh質粒為模板，使用引物1和2在質粒上引入R35E/R36V雙突變，并轉化至大腸桿菌TOP10感受態(tài)，提取質粒并測序確認獲得雙突變質粒pET₃₂-StDapdhR35E/R36V。以獲得的雙突變質粒為模板，使用引物3和4在該突變子上繼續(xù)引入Y76V突變，獲得三突變質粒：pET₃₂-StDapdhR35E/R36V/Y76V，轉化入大腸桿菌BL21(DE3)高效感受態(tài)中，并提取質粒測序確證。

實施例2：meso-二氨基庚二酸脫氫突變體酶的表達、熱擊處理制備

將含有三突變質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在2 L LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約0.8后，向其中加入終濃度0.5 mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）進行誘導表達，誘導溫度為30℃，誘導時間為20小時。誘導表達結束后，于5000 rpm離心5分鐘收集菌體。取部分菌體樣品進行純化及活力確定，利用緩沖液A（20 mM Tris-Cl pH 8.0）重懸并洗滌菌體，高壓勻漿破碎，14000 rpm離心30分鐘去除破碎沉淀。由于粗酶中的其他雜酶(L-氨基酸脫氫酶，羰基還原酶等)對產(chǎn)物的ee值、產(chǎn)物純度都有影響。StDAPDH突變子有較好的熱穩(wěn)定性，通過對粗酶進行熱處理，在維持StDAPDH活力的情況下去除對反應有影響的雜酶。在70℃水浴中對上清進行熱處理，每隔10 min取一次樣100 μL，連續(xù)取樣40 min。每次取樣后均離心取上清，上清一部分進行SDS-PAGE電泳（結果見附圖1）。

實施例3：FDH酶液制備

將來源于假絲酵母（Candida bodinii）的甲酸脫氫酶基因克隆于pET21d（+）表達載體上，在大腸桿菌BL21（DE3）中進行可溶性表達，種子液以1%的接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀約0.8后，向其中加入終濃度0.5 mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）進行誘導表達，誘導溫度為20℃，誘導時間為20小時。誘導表達結束后，于5000 rpm離心5分鐘收集菌體。高壓勻漿破碎后進行硫酸銨沉淀，收集55%硫酸銨上清進行下一步的疏水層析。疏水層析柱為Phenyl Sepharose 6 Fast Flow column（high sub）（GE Healthcare）。緩沖液A（50 mM Kpi pH 8.0，55%硫酸銨）用于平衡，緩沖液B（50 mM Kpi pH 8.0）用于洗脫，4ml/min流速， 0-100% B液洗脫。洗脫峰收集后用緩沖液C（50 mM Kpi pH 8.0，100 mM 氯化鈉）透析，超濾管濃縮后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例4：固定化酶的制備

將1ml meso-二氨基庚二酸脫氫酶突變體酶液和3.3ml甲酸脫氫酶酶液加入到磷酸緩沖液(0.1M,pH 7.8)中，再加入3g 活化后的ESR-2氨基樹脂，在室溫下溫和的攪拌20小時，取出載體，用緩沖液洗至無游離蛋白，再在0.5mmol/L的乙醇胺溶液中攪拌4小時，然后取出載體，用緩沖液洗三遍。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例5：催化反應體系建立，及產(chǎn)物ee值的測定

將0.2 M底物丙酮酸，0.6 M甲酸銨溶于1 mL水中，用碳酸氫鈉調pH值至7.5左右，加入0.5 mg 輔酶NAD⁺，以及共固定化酶100mg， 200 rpm轉速于37℃反應6小時。反應液濾除，共固定化酶重復使用，反應液加入10 μl高氯酸來結束反應，取反應液20μL，用水稀釋至200μL，加入400 μL FDAA衍生試劑，再加入80 μL的1 M的NaHCO₃， 40 ℃反應1 h后加入40 μL 的2 M的HCl，0.45 μm的膜過濾HPLC分析。

實施例5：共固定化酶在填充柱中連續(xù)催化反應

先取一根高徑比為30的有機玻璃柱作為填充柱，把實施例4中的共固定化酶填充到填充柱中。然后將0.1 M丙酮酸，0.3 M甲酸銨溶于水中，用碳酸氫鈉調pH值至7.5左右，加入0.3g/L 輔酶NAD⁺，在溫度為35 ℃條件下，以流速為1 ml/min流經(jīng)填充柱，在此反應條件下，D-丙氨酸產(chǎn)率為75%，共固定化酶轉化55天，活性沒有明顯下降。得到的反應液通過酸性離子樹脂吸附分離得到D-丙氨酸。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所

<120> 一種利用共固定化酶合成D-丙氨酸的方法

<130> 2015

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 906

<212> DNA

<213> Symbiobacterium thermophilum

<400> 1

atggacaaac tgcgtgttgc ggttgttggt tacggtaacg ttggtcgtta cgcgctggaa 60

gcggttcagg cggcgccgga catggaactg gttggtgttg ttgaacgtaa agttctggcg 120

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<213> Symbiobacterium thermophilum

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