本發(fā)明涉及了一種海藻酸鹽水凝膠微載體，具體地說是一種內(nèi)部含有半乳糖基殼聚糖分子的海藻酸鹽水凝膠微球載體及其制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
具有生物活性的物質(zhì)被包封在選擇性透過膜中，形成球狀的微膠囊，稱之為“生物微膠囊”[Chang TMS.Hemoglobin corpuscles.Research report for honours physiology.Medical Library,McGill University,1957]。90年代以來，以生物微膠囊作為細(xì)胞的免疫隔離和運(yùn)載工具，利用基因重組細(xì)胞或原代細(xì)胞的代謝產(chǎn)物來調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能，治療相關(guān)疾病成為生物醫(yī)學(xué)工作者的研究熱點(diǎn)[Basic D,Vacek I,Sun A M.Microencapsulation and transplantation of engineered cells：a new approach to somatic gene therapy.Art Cells Blood Subs ImmobBiotechnol,1996,24(3)：219-255]。海藻酸因其具有優(yōu)良的物理化學(xué)性能和生物醫(yī)學(xué)性能，成為微囊化技術(shù)的主要材料?，F(xiàn)有的微囊化技術(shù)在培養(yǎng)肝細(xì)胞時，由于肝細(xì)胞貼壁依賴的生長特性，微囊內(nèi)部三維立體環(huán)境不能夠使肝細(xì)胞迅速適應(yīng)生長。半乳糖基團(tuán)是肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體的特異性配體，能夠特異性識別肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體，因此，在微囊材料上引入肝靶向的半乳糖基團(tuán)，可誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在微膠囊內(nèi)部的黏附和增殖行為[Jun Yang,Galactosylated alginate as a scaffold for hepatocytes entrapment,Biomaterials,2002,23:471-479]。目前在微囊內(nèi)部引入半乳糖基團(tuán)可通過在海藻酸上的共混或共價修飾。含有半乳糖基團(tuán)的大分子物質(zhì)[Seog-Jin Seo,Yun-Jaie Choi,Alginate microcapsules prepared with xyloglucan as a synthetic extracellular matrix for hepatocyte attachment,Biomaterials,2005,26:3607-3615]主要通過與海藻酸共混制備微膠囊來發(fā)揮作用，共混的物質(zhì)易發(fā)生泄漏因此導(dǎo)致了這類微膠囊的穩(wěn)定性降低；而針對于海藻酸的共價修飾主要發(fā)生在海藻酸的羧基部位，羧基位點(diǎn)的占據(jù)使得海藻酸在凝膠化反應(yīng)形成微膠囊的時候凝膠化程度降低，為了不過度影響海藻酸的成膠性能，半乳糖基取代度受到限制。[Ivan Donati,AmedeoVetere,Galactose-Substituted Alginate:Preliminary Characterization and Study of Gelling Properties,Biomacromolecules,2003,4:624-631]。由于微膠囊穩(wěn)定性及半乳糖基取代度的限制，無論是共混或共價修飾海藻酸，目前報道的方法中均無法在微膠囊內(nèi)部引入較高濃度的半乳糖基團(tuán)。
殼聚糖是一種生物相容性優(yōu)良的天然生物材料，實(shí)踐表明海藻酸鹽與殼聚糖因靜電相互作用制成的微囊，制備方法溫和、簡單、成囊速度快，其微囊球 形度好，藥物穩(wěn)定性高[Donati I,Holtan S,Morch YA,et al.New hypothes is on the role of alternating sequences in calcium-alginate gels,Biomacromolecules,2005,6(2):1031-1040]。所以，近年來海藻酸鹽/殼聚糖微囊的研究取得了明顯的進(jìn)展。目前的制備海藻酸鹽/殼聚糖微囊的方法主要有以下三種：海藻酸鹽滴入殼聚糖與二價離子的混合溶液中形成微囊[Thomas Chandy,Daniel L,Evaluation of Modified Alginate-Chitosan-Polyethylene Glycol Microcapsules for Cell Encapsulation,Artificial Organs,1999]；殼聚糖滴入海藻酸鹽溶液中形成微囊[Sun-Hee Yu,Sung-Koo Kim,Encapsulation of rat hepatocyte spheroids for the development of artificial liver,Biotechnology Techniques,1999，13:609–614；X.L.GUO,K.S.YANG,et al,Morphology and metabolism of Ba-alginate-encapsulated hepatocytes with galactosylated chitosan and poly(vinyl alcohol)as extracellular matrices,Journal of Biomaterials Science,Polymer Edition,2014，6：551-565]；海藻酸鹽滴入鈣液中形成包埋型水凝膠微球載體，再將該包埋型水凝膠微球載體浸入殼聚糖溶液中進(jìn)一步反應(yīng)成膜形成微膠囊，即AC微囊[TasimaHaque,In vitro study of alginate–chitosan microcapsules:an alternative to liver cell transplants for the treatment of liver failure，Biotechnology Letters，2005，27：317-322；Wujie Zhang,Shuting Zhao，A novel core–shell microcapsule for encapsulation and 3D culture of embryonic stem cells，Journal of Materials Chemistry B，2013，1：1002-1009]。前兩種方法均存在以下幾個問題，一是因殼聚糖和海藻酸兩種大分子瞬間反應(yīng)速度限制，形成的微囊粒徑在1mm左右甚至更大，過大的微囊容易導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)生長過大，中心細(xì)胞因傳質(zhì)傳氧限制出現(xiàn)壞死，影響細(xì)胞活性，進(jìn)而影響細(xì)胞分泌產(chǎn)物的醫(yī)療效果；二是大分子瞬間結(jié)合會形成不均勻，球形度較差的微囊，影響了微囊的機(jī)械強(qiáng)度，移植體內(nèi)時微囊易發(fā)生破損而引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)；三是無論海藻酸還是殼聚糖作為凝膠浴，海藻酸與溶于鈣液中的殼聚糖不能完全反應(yīng)或者殼聚糖不能完全結(jié)合海藻酸，均導(dǎo)致了原料的浪費(fèi)。第三種方法，將海藻酸滴入二價鹽溶液中可形成可控大小，球形度及機(jī)械強(qiáng)度均良好的包埋型水凝膠微球載體，但是再將包埋型水凝膠微球載體浸入殼聚糖溶液中進(jìn)一步反應(yīng)成膜形成傳統(tǒng)AC微囊的時候，殼聚糖并不會進(jìn)入微囊內(nèi)部，這就形成了以海藻酸為核，殼聚糖為殼的核殼微囊結(jié)構(gòu)，殼聚糖不接觸微囊內(nèi)部的細(xì)胞，使得有功能的殼聚糖不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對上述問題，本發(fā)明提出一種內(nèi)部含有半乳糖基殼聚糖分子的海藻酸鹽包埋型水凝膠微球載體，其特征在于：海藻酸鹽包埋型水凝膠微球載體內(nèi)部含有半乳糖基殼聚糖分子，其中，半乳糖基殼聚糖分子與海藻酸鹽分子間形成靜電絡(luò)合。即通過共價修飾的半乳糖基殼聚糖溶液與海藻酸鹽溶液在二者均不形 成沉淀的pH環(huán)境下充分混合均勻后，將混合液在高壓靜電場下形成射流，滴入pH偏酸的二價鹽凝膠浴中，通過殼聚糖與海藻酸鹽的靜電絡(luò)合，形成內(nèi)部含有半乳糖基團(tuán)的包埋型水凝膠微球載體。
技術(shù)方案
本發(fā)明中，通過共價修飾的半乳糖基殼聚糖溶液與海藻酸鹽溶液在pH6.0-8.0環(huán)境下充分混合均勻后，將混合液在高壓靜電場下形成射流，滴入pH5.0-6.9的二價鹽凝膠浴中，形成內(nèi)部含有半乳糖基團(tuán)的包埋型水凝膠微球載體。包埋型水凝膠微球載體可繼續(xù)與聚陽離子反應(yīng)，在微球載體表面絡(luò)合形成膜結(jié)構(gòu)，稱之為海藻酸鹽/半乳糖基殼聚糖-聚陽離子微膠囊；其中，聚陽離子包括下述任意一種或兩種以上：聚氨基酸類(如聚賴氨酸、聚鳥氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸等)、聚胺類(如聚乙烯亞胺、聚亞甲基胍、聚N乙烯基己內(nèi)酰胺、羧基-丙基-丙烯酰胺共聚物、DEAE-dextran、氨基聚乙二醇等)、殼聚糖等。該種海藻酸鹽/半乳糖基殼聚糖-聚陽離子微膠囊可浸入有機(jī)金屬螯合劑溶液中，液化微膠囊內(nèi)部海藻酸鹽凝膠；參與液化反應(yīng)的有機(jī)金屬螯合劑溶液為40-70mmol/L的檸檬酸鈉或50-200mmol/L的EDTA溶液，微膠囊與有機(jī)金屬螯合劑溶液體積比范圍為1:1～1:40，反應(yīng)1-60分鐘，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內(nèi)部液態(tài)核心的微膠囊。
其中，所述半乳糖基殼聚糖是由殼聚糖(Chitosan)和乳糖酸(LA)通過酰胺化反應(yīng)生成半乳糖基殼聚糖(GC)，其接枝度在(每100個殼聚糖單體接枝乳糖酸分子的百分?jǐn)?shù))1％-99％，反應(yīng)式如下：
乳糖酸與殼聚糖經(jīng)過共價修飾制備半乳糖基殼聚糖材料具體制備過程，參考文獻(xiàn)如下：TaekWoong Chung，Preparation of alginate/galactosylated chitosan scaffoldfor hepatocyteattachment，Biomaterials，2002，23：2827-2834。
本方法制備的海藻酸鹽/半乳糖基殼聚糖-聚陽離子微膠囊產(chǎn)品為粒徑 100-1000微米的球形微膠囊；微膠囊膜厚度在1-100微米；微膠囊膜中聚陽離子材料包括：殼聚糖，其脫乙酰度為60-98％，分子量為1kDa-800kDa(例如：1kDa-5kDa；10kDa-20kDa；50kDa-100kDa；100kDa-800kDa)；α-聚賴氨酸，分子量為2kDa-500kDa(例如：2kDa-10kDa；70kDa-150kDa；150kDa-300kDa；300kDa-500kDa)；ε-聚賴氨酸，分子量為2kDa-500kDa(例如：2kDa-50kDa；50kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)；聚精氨酸，分子量為1kDa-500kDa(例如：1kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)；聚鳥氨酸，分子量為1kDa-500kDa(例如：1kDa-50kDa；50kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)；聚組氨酸，分子量為1kDa-500kDa(例如：1kDa-50kDa；50kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)。
該微膠囊中海藻酸鹽凝膠為二價金屬鈣，鋇或鋅水凝膠，海藻酸鹽(分子量10KDa-10000kDa)溶液為海藻酸的鈉鹽或鉀鹽溶液。半乳糖基殼聚糖溶液為使用鈉鹽或鉀鹽溶解的易水溶的半乳糖基殼聚糖(分子量1KDa-800KDa)溶液。
產(chǎn)品的具體制備步驟為：
1)乳糖酸與殼聚糖經(jīng)過酰胺化反應(yīng)制備半乳糖基修飾殼聚糖材料，其中，殼聚糖接枝半乳糖基團(tuán)的接枝率為1％-99％；
2)分別配制濃度為1-60g/L的半乳糖基殼聚糖溶液和濃度為10-30g/L的海藻酸鹽溶液，調(diào)節(jié)二者pH環(huán)境均為6.0-8.0之間，保證二者充分溶解。其中，半乳糖基殼聚糖分子量為1KDa-800KDa，脫乙酰度80-98％，海藻酸分子量為10KDa-10000kDa；
3)將2)中所述半乳糖基殼聚糖溶液與海藻酸鹽溶液按照體積比例為1：5-5：1的比例混合，室溫攪拌0.1-6h；
4)用3)中所述混合溶液通過銳孔擠出法、靜電液滴法、乳化法、旋轉(zhuǎn)盤法等形成液滴，滴入pH在5.0-6.9的二價鹽凝膠浴中，凝膠固化20-60分鐘，即制備成內(nèi)部含有半乳糖基殼聚糖分子的包埋型水凝膠微球載體，稱之為A微球。
5)將步驟4)中的A微球浸入聚陽離子溶液中，A微球與聚陽離子溶液體積比的范圍為1:1-1:40，反應(yīng)時間為1-60分鐘，反應(yīng)溫度在0-37℃，此時得到裝載半乳糖基團(tuán)的包埋型水凝膠微球載體，即海藻酸鹽/半乳糖基殼聚糖-聚陽離子微膠囊。
聚陽離子溶液的配制方法是：
殼聚糖溶于pH為5.0-7.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液或3-9g/L NaCl溶液，殼聚糖濃度為0.1-15g/L；
或，α-聚賴氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，α-聚賴氨酸濃度為0.01-10g/L；
或，ε-聚賴氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，ε-聚賴氨酸濃度為0.01-10g/L；
或，聚精氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚精氨酸濃度為0.01-10g/L；
或，聚鳥氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚鳥氨酸濃度為0.01-10g/L；
或，聚組氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚鳥氨酸濃度為0.01-10g/L；
該微膠囊可用于活細(xì)胞的包埋，半乳糖基殼聚糖溶液與海藻酸鹽溶液充分 混合后，混合液與需要包埋的活細(xì)胞混勻制備包埋活細(xì)胞的微膠囊。微囊化細(xì)胞含量為105-2*107個/mL，細(xì)胞活性保持80％以上。所述活細(xì)胞為人或動物來源的離體的肝細(xì)胞，干細(xì)胞，干細(xì)胞分化的具有肝細(xì)胞功能的細(xì)胞，肝細(xì)胞系細(xì)胞，轉(zhuǎn)分化的具有肝細(xì)胞功能的細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，肝枯否氏細(xì)胞，肝星形細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中一種或二種以上。
本發(fā)明的有益效果
1、本方法能夠保證形成大小可控、球形度良好的微膠囊，避免了微膠囊粒徑過大而導(dǎo)致的細(xì)胞團(tuán)中心壞死現(xiàn)象。
2、該方法制備的海藻酸鹽/半乳糖基殼聚糖-聚陽離子微膠囊，半乳糖基殼聚糖可進(jìn)入微膠囊內(nèi)部，解決了傳統(tǒng)的AC微囊中半乳糖只能分布在微膠囊表面或即使進(jìn)入微膠囊內(nèi)部后也會導(dǎo)致微膠囊粒徑變大，球形度變差的問題。
3、無論是將海藻酸滴入半乳糖基殼聚糖溶液或者將半乳糖基殼聚糖滴入海藻酸溶液，形成的海藻酸鹽/半乳糖基殼聚糖水凝膠微球載體中半乳糖含量均較低，該方法預(yù)先將海藻酸與半乳糖基殼聚糖在中性條件下混合，因此能將較大濃度的半乳糖引入到微膠囊內(nèi)部，有利于半乳糖基團(tuán)在微膠囊內(nèi)部發(fā)揮更大的功能。
4、本方法直接將兩種重要的大分子原料海藻酸和半乳糖基殼聚糖預(yù)先混合后制備微膠囊可最大限度的節(jié)約原料，控制成本。
5、本方法制備的微膠囊在保持優(yōu)良球形度的同時，保持了良好的機(jī)械強(qiáng)度，能保證作為組織細(xì)胞移植、細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用過程中微膠囊的完整性。
6、本方法制備的微膠囊相比于核殼結(jié)構(gòu)的海藻酸鹽/半乳糖基殼聚糖微膠囊，保持免疫隔離性能的同時，通透性并未受到任何影響，反之更好，有利于細(xì)胞在該微膠囊內(nèi)得到更好的傳質(zhì)與傳氧。
具體實(shí)施方式
制備海藻酸鹽/半乳糖基殼聚糖包埋型水凝膠微球載體的方法為靜電液滴法(參考文獻(xiàn)：In Vivo Culture of Encapsulated Endostatin-Secreting Chinese Hamster Ovary Cells for Systemic Tumor Inhibition,Human Gene Therapy.2007,18:474-481)。
實(shí)施例1
1)制備海藻酸鈉溶液：將2.0g海藻酸溶于100mL生理鹽水中制備成20g/L的海藻酸鈉溶液，其中，海藻酸分子量為350kDa。
2)制備半乳糖基殼聚糖溶液：將半乳糖基殼聚糖溶于生理鹽水中，分別配制濃度為0，15g/L，20g/L，30g/L，pH為7.0的半乳糖基殼聚糖溶液。
3)配制凝膠浴溶液：11g無水氯化鈣溶于1L去離子水中。
4)取2mL海藻酸鈉溶液，分別混合2mL步驟2)中得到的不同濃度半乳糖基殼聚糖溶液，室溫攪拌3h，此時海藻酸鈉濃度為10g/L，半乳糖基殼聚糖濃度依次為0，7.5g/L，10g/L，15g/L，使用靜電液滴法制備海藻酸鈣/半乳糖基殼聚糖包埋型水凝膠微球載體。
5)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。
6)制備海藻酸鈣/半乳糖基殼聚糖-α-聚賴氨酸微膠囊：將步驟4)制得的包埋型水凝膠微球載體浸入步驟5)制備的α-聚賴氨酸溶液中，包埋型水凝膠微球與α-聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成海藻酸鈣/半乳糖基殼聚糖-α-聚賴氨酸微膠囊。
7)將步驟6)制得的海藻酸鈣/半乳糖基殼聚糖-α-聚賴氨酸微膠囊，按微膠囊：BSA＝1：20體積比放入FITC標(biāo)記的BSA(牛血清蛋白)溶液中，激光共聚焦顯微鏡下實(shí)時觀察，各組微膠囊均在2h內(nèi)達(dá)到擴(kuò)散平衡，表明海藻酸鈣/半乳糖基殼聚糖-α-聚賴氨酸微膠囊具有良好的通透性能。
8)將步驟6)制得的海藻酸鈣/半乳糖基殼聚糖-α-聚賴氨酸微膠囊與瑪瑙球、生理鹽水共同放置于三角瓶內(nèi)，在37度，170r/min條件下震蕩球磨24小時，各組微膠囊的完整率均在90％以上，表明海藻酸鈣/半乳糖基殼聚糖-α-聚賴氨酸微膠囊具有良好的機(jī)械強(qiáng)度。
實(shí)施例2
1)制備海藻酸鈉溶液：將3.0g海藻酸溶于100mL生理鹽水中制備成30g/L的海藻酸鈉溶液，其中，海藻酸分子量為350kDa。
2)制備FITC標(biāo)記的半乳糖基殼聚糖溶液：將FITC標(biāo)記的半乳糖基殼聚糖溶于生理鹽水中，配制濃度為10g/L，pH為7.0的半乳糖基殼聚糖溶液。
3)配制凝膠浴溶液：11g無水氯化鈣溶于1L去離子水中。
4)取2mL海藻酸鈉溶液，分別混合2mL步驟2)中得到的半乳糖基殼聚糖溶液，室溫攪拌3h，此時海藻酸鈉濃度為15g/L，半乳糖基殼聚糖濃度5g/L，使用靜電液滴法制備海藻酸鈣/半乳糖基殼聚糖包埋型水凝膠微球載體。
實(shí)施例3
1)制備海藻酸鈉溶液：將2.0g海藻酸溶于100mL生理鹽水中制備成20g/L的海藻酸鈉溶液，其中，海藻酸分子量為350kDa，過濾除菌。
2)制備半乳糖基殼聚糖溶液：將0.4g半乳糖基殼聚糖溶于10mL生理鹽水中制備成40g/L的殼聚糖溶液，調(diào)節(jié)pH值7.2，過濾除菌。
3)配制凝膠浴溶液：11g無水氯化鈣溶于1L去離子水中，過濾除菌。
4)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液，過濾除菌。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。
5)取3mL海藻酸鈉溶液，混合1mL半乳糖基殼聚糖溶液，室溫攪拌1h。取2mL該混合溶液，加入4*106個大鼠原代肝細(xì)胞，混合均勻后，使用靜電液滴法制備海藻酸鈣/半乳糖基殼聚糖混合大鼠原代肝細(xì)胞包埋型水凝膠微球載體。其中，形成包埋型水凝膠微球載體的粒徑大小350μm左右。
6)將包埋有原代大鼠肝細(xì)胞的海藻酸鈣/半乳糖基殼聚糖包埋型水凝膠微球載體浸入步驟4)制備的聚賴氨酸溶液中，包埋型水凝膠微球載體與聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成海藻酸鈣/半乳糖基 殼聚糖-α-聚賴氨酸微膠囊。
7)對該微膠囊內(nèi)的原代大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和肝細(xì)胞功能表征，一周后，微膠囊保持完整形態(tài)，球形度良好；微膠囊內(nèi)細(xì)胞活性保持初始活性的69％，肝細(xì)胞白蛋白分泌量為1.29±0.33μg/10^6個細(xì)胞，尿素合成量為349±7μg/10^6個細(xì)胞。
比較例
1)制備海藻酸鈉溶液：將2.0g海藻酸溶于100mL生理鹽水中制備成20g/L的海藻酸鈉溶液，其中，海藻酸分子量為350kDa，過濾除菌。
2)配制凝膠浴溶液：11g無水氯化鈣溶于1L去離子水中，過濾除菌。
3)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液，過濾除菌。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。
4)取3mL海藻酸鈉溶液，混合1mL生理鹽水溶液，室溫攪拌1h。取2mL該混合溶液，加入4*106個大鼠原代肝細(xì)胞，混合均勻后，使用靜電液滴法制備海藻酸鈣混合大鼠原代肝細(xì)胞包埋型水凝膠微球載體。其中，形成包埋型水凝膠微球載體的粒徑大小350μm左右。
5)將包埋有原代大鼠肝細(xì)胞的海藻酸鈣包埋型水凝膠微球載體浸入步驟3)制備的α-聚賴氨酸溶液中，包埋型水凝膠微球載體與聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成海藻酸鈣-α-聚賴氨酸微膠囊。
6)對該微膠囊內(nèi)的原代大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和肝細(xì)胞功能表征，一周后，微膠囊保持完整形態(tài)，球形度良好；微膠囊內(nèi)細(xì)胞活性保持初始活性的44％，肝細(xì)胞白蛋白分泌量為0.46±0.05μg/10^6個細(xì)胞，尿素合成量為231±29μg/10^6個細(xì)胞。